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第十六章蛋白与蛋白相互作用分析第一节免疫共沉淀一．实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合抗体Fc段的现象而开发出来的方法，是研究蛋白质相互作用的经典方法，主要用于确定两种蛋白质在完整细胞内是否存在生理性相互作用。
其原理是：当细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用可以被保留下来。
如果用蛋白质X的抗体进行免疫沉淀，那么在细胞内与X结合的蛋白质Y也能被沉淀下来。
目前多将精制的protein A/G预先结合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A就能吸附抗原及其结合蛋白，通过低速离心，可以将目的抗原及其结合蛋白与其它成分分离。
二．主要仪器和试剂1．主要仪器微量高速4°C离心机；vortex震荡器；垂直混和器；Western blot 所需仪器。
2．试剂（1）蛋白定量试剂盒；抗体；PBS；protein A/G agarose beads；（2）Western blot所需试剂（参考本书第十七章免疫印迹）；（3）NP-40蛋白裂解缓冲液（使用前加入蛋白酶抑制剂）：150mM NaCl，0.5% NP-40，50mM Tris-HCl。
配置500mL 需要：5M NaCl 15mL，10% NP-40 25mL，1M Tris-HCl （pH8.0）25mL。
三．实验步骤1.转染24-48 h后，刮取细胞，转移到15mL离心管，1000rpm离心5min，用冰预冷的PBS洗涤细胞一次，细胞沉淀用1mL冰预冷的PBS重悬，移至Eppendorf管，4°C 12000rpm离心1min，弃上清；2.加入适量NP-40细胞裂解缓冲液（用前新鲜加入蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 每隔10min Vortex一次(每次大约30sec)，4℃12000rpm离心1 min，上清移至新的Eppendorf管；3.蛋白定量，每组取适量（通常100μg-1mg）蛋白，用细胞裂解液调整体积使每组一致（通常总体积500-1000μL），加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠；4.4°C孵育30min – 2h，以去除蛋白与Protein A/G琼脂糖珠的非特异结合（pre-clear）；5.4°C，2500rpm 离心3 min，上清移至新的Eppendorf管；6.加入第一抗体，4°C旋转孵育过夜；7.次日，每管加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠，4°C缓慢旋转孵育1–3h；8.4°C，2500rpm 离心3 min，小心吸去上清，琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3－4次；每次可样品置于4°C缓慢旋转孵育10min；9.最后一次吸干所有液体，加入40μl的1×SDS 上样缓冲液，Vortex，然后用离心机轻甩30sec；10.沸水煮5分钟，12,000rpm离心1min；11.SDS-PAGE并进行Western blot检测。
原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子(用保鲜膜包好后，埋冰下)，离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS;2. 加入预冷的200ul RIPA Buffer (10cm培养皿)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到2.0 EP 管中，4℃，缓慢晃动15min(EP管插冰上，置水平摇床上)4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 取30μl protein A 琼脂糖珠，用冷PBS洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min;7. 将预处理过的30μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育过夜，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;8. 免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入的5×上样缓冲液，沸水煮10分钟;9. Western blotting实验第一步验证nemo与pidd的相互作用关系：（1）5个10cm培养皿培养BV-2细胞（2）每个皿加入200ul的中等强度的RIPA裂解液，裂解细胞a Input组b IgG组c pidd抗体protein A 琼脂糖珠组孵育过夜加入5×上样缓冲液煮10分钟a、b、c组孵育nemo抗体，来证明nemo可以拉出pidda Input组b IgG组c nemo抗体protein A 琼脂糖珠组孵育过夜加入5×上样缓冲液煮10分钟a、b、c组孵育pidd抗体，来证明pidd可以拉出nemo实验第二步分别转染带flag-空载体与flag-pidd-cflag-空载体按上述提取细胞分两组，分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜，分别用flag抗体与nemo抗体flag-pidd-c按上述提取细胞分两组，分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜，分别加入flag抗体与nemo抗体实验第三步分别转染带flag-空载体与flag-pidd-ccflag-空载体按上述提取细胞分两组，分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜，分别用flag抗体与nemo抗体flag-pidd-cc按上述提取细胞分两组，分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜，分别加入flag抗体与nemo抗体。
免疫共沉淀原理图解免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种用于分离和富集特定蛋白质的技术。
基于特异性抗体与目标蛋白质的结合，IP可以用于检测蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用、蛋白质修饰和定位等方面的研究。
下面将介绍免疫共沉淀的原理和流程。
原理：免疫共沉淀是通过特异性抗体与目标蛋白质的结合，来沉淀出目标蛋白质及其相关蛋白质、DNA或RNA等分子的方法。
具体来说，IP通过以下步骤实现：1. 将细胞裂解，使蛋白质溶于缓冲液中。
2. 加入特异性抗体，并使其与目标蛋白质结合。
3. 加入亲和素（一种与抗体结合的蛋白质），再将亲和素固定在磁珠上。
4. 加入磁珠后，亲和素与抗体结合，并沉淀下含有目标蛋白质及其相关分子的复合物。
5. 用洗涤缓冲液洗涤磁珠，并用洗涤液去除非特异性结合的蛋白质。
6. 用洗涤缓冲液或热水溶液将目标蛋白质及其相关分子从磁珠上去除。
7. 最后，用Western blot或其他方法检测目标蛋白质及其相关分子。
流程：IP的具体实验流程如下：1. 细胞溶解：将含有目标蛋白质的细胞或组织裂解并使蛋白质溶于缓冲液中。
2. 抗体结合：加入经过验证的特异性抗体，使其与目标蛋白质结合。
3. 亲和素结合：加入亲和素，使其与抗体结合，并将其固定到具有磁性的磁珠上。
4. 免疫共沉淀：将磁珠加入到蛋白质混合物中，使亲和素与抗体结合并沉淀出目标蛋白质及其相关分子。
5. 洗涤：用洗涤缓冲液将非特异性结合的蛋白质去除，保留目标蛋白质及其相关分子。
6. 去除磁性珠：用洗涤缓冲液或热水溶液将目标蛋白质及其相关分子从磁珠上去除。
7. 分析：用Western blot、质谱等多种技术检测目标蛋白质及其相关分子。
总结：免疫共沉淀是一种非常有用的技术，可以帮助研究者了解蛋白质相互作用、蛋白质修饰及其定位等方面的信息。
虽然技术流程复杂，但只要按照正确的方法进行操作，就能够产生非常有意义的结果。
