免疫共沉淀Immunoprecipitation

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法一、基本概念免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。

免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。

其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。

与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。

不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。

在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。

二、抗体的选择（一）多克隆抗体多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。

但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。

（二）单克隆抗体与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。

但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。

三、免疫沉淀方法免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。

若为前者，免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，只需压片即可检测到靶蛋白的存在；若为后者，经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后，尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。

（一）所需试剂及溶液改良的RIPA液（细胞裂解液）、稀释缓冲液（常用PBS溶液）、TSA溶液、0.05mol/lTris（pH6.8）、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。

免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP是利用特异性抗体从样品中特异性“捕捉”目的蛋白/片段的技术，其首要条件是将特异性抗体作固相化固定，目前常Frdbio用的思路是利用Protein A/G的琼脂糖凝胶，通过与抗体的Fc段特异性结合，间接固定特异性抗体；特异性抗体固定以后。

目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，就可以特异性抓取目的蛋白/抗原/片段，与亲和层析纯化的原理完全相同，实验过程：利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原/蛋白/片段。

实验步骤：样品前处理：以细胞为例1、蛋白量的估算：一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)；实验者根据自己实验用量自己选择；福因德科技2、细胞的裂解：（溶液配制见附录，配制溶液需要加蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。

注意抑制剂的要现加现用。

）1）冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4）洗1遍，加入细胞裂解液200ul/孔（3×106细胞），冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中；2）超声：强度45％，5秒×10次。

（如果效果不好需要适当调整超声波的强度）3）离心细胞裂解液：4℃10000rpm 10 分钟，取上清。

3、Agrose-proteinA/G清洗：取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul 1×PBS（4℃）清洗（1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G），5000rpm×2分钟，吸掉上清，如此重复清洗3次以上。

4、细胞裂解液预清洗：Friendbio将步骤2裂解的细胞与步骤3清洗好的Agrose-proteinA/G 4℃摇床孵育1个小时，5000rpm×2分钟，取上清备用。

1.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：A.蛋白样品的准备：A1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。

可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。

A2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。

A3.对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。

注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。

对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。

如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。

B.去除非特异性结合(可选做)：B1.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。

B2.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。

注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。

通过和nor mal IgG和Protein G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。

C.免疫沉淀：C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。

C2.再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。

(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升。

免疫共沉淀质谱免疫共沉淀质谱（immunoprecipitation-massspectrometry，简称IP-MS）是一种常用的蛋白质相互作用分析技术。

该技术结合了免疫沉淀和质谱分析，能够鉴定蛋白质相互作用和识别蛋白质复合物的成员，广泛应用于生命科学、疾病诊断和治疗等领域。

一、IP-MS 的基本原理IP-MS 技术的基本原理是利用特异性抗体将目标蛋白质从混合物中沉淀下来，然后用质谱分析鉴定沉淀物中的蛋白质。

该技术主要包括以下步骤：1. 样品制备：将需要分析的生物样品（如细胞、组织、血清等）进行处理，如细胞裂解、组织切片等，得到蛋白质混合物。

2. 免疫沉淀：将特异性抗体与目标蛋白质结合，形成抗原抗体复合物。

然后将混合物与抗原抗体复合物一起孵育，使复合物形成。

接着用亲和树脂或磁珠等材料将复合物捕获下来，得到免疫沉淀物。

3. 洗涤：用缓冲液对免疫沉淀物进行多次洗涤，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

4. 质谱分析：将免疫沉淀物用电泳或染色分析等方法进行分离，然后用质谱分析仪器对分离后的蛋白质进行鉴定和定量。

二、IP-MS 的应用1. 鉴定蛋白质相互作用：利用 IP-MS 技术可以鉴定蛋白质相互作用，例如鉴定蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质、蛋白质与小分子等的相互作用。

这些相互作用对于细胞信号转导、代谢途径、基因表达等生命过程起着重要作用。

2. 识别蛋白质复合物的成员：许多生物过程涉及到蛋白质复合物的形成，如核糖体、酶复合物等。

利用 IP-MS 技术可以识别蛋白质复合物的成员，进而揭示其功能和调控机制。

3. 疾病诊断和治疗：许多疾病的发生和发展都与蛋白质相互作用和复合物形成有关。

利用 IP-MS 技术可以鉴定疾病相关的蛋白质相互作用和复合物，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。

三、IP-MS 的优缺点IP-MS 技术具有以下优点：1. 特异性高：利用特异性抗体进行免疫沉淀，可以选择性地捕获目标蛋白质。

免疫共沉淀裂解液介绍免疫共沉淀裂解液（immunoprecipitation lysate）是生物学领域常用的一种实验技术。

通过利用抗体的特异结合性，将目标蛋白与周围环境中的其他蛋白分离开来，从而研究蛋白相互作用、信号传导等生物过程。

本文将深入探讨免疫共沉淀裂解液的原理、方法以及其在科研中的应用。

原理免疫共沉淀裂解液的原理基于抗体的选择性结合性。

在免疫共沉淀实验中，首先需要制备兔抗体或小鼠抗体，并与抗原进行免疫反应。

抗体与抗原的结合形成特异性复合物，可用于将目标蛋白与周围环境中的其他蛋白区分开来。

方法1.细胞裂解–收集细胞或组织样品，并迅速冰冻保存以阻止蛋白质的降解。

–加入裂解液（含有蛋白酶抑制剂）并彻底悬浮细胞或组织。

–放入低温培养箱中离心，收集上清液（裂解液）。

2.抗体结合–将收集的裂解液与特异性抗体一起孵育，使抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物。

–可根据实验需求是否添加交联剂，如二甲亚砜（DMS）、氯化亚铊（Thio）、二甲亚砜和Thio的混合物等，增强免疫复合物的稳定性。

3.共沉淀及洗涤–添加蛋白A/G琼脂糖或其他蛋白A/G亲和柱材料，促使免疫复合物与之结合。

–将样品加入柱材料中，并反复冲洗以去除非特异性结合的蛋白和其他杂质。

–收集洗涤液中的目标蛋白，可用于进一步的分析和检测。

4.目标蛋白的检测–使用SDS-PAGE分离复合物中的蛋白。

–将蛋白转移到膜上，并进行免疫印迹（Western blotting）或质谱分析等技术，检测目标蛋白。

应用免疫共沉淀裂解液在生物学研究中应用广泛，主要用于以下领域：1.蛋白相互作用研究–免疫共沉淀可以用于鉴定和验证蛋白－蛋白相互作用。

通过将抗体与目标蛋白结合，可以共沉淀与其相互作用的蛋白，进一步阐明细胞中各个蛋白之间的相互关系。

2.信号转导研究–免疫共沉淀可以用于研究信号转导通路中的蛋白质复合物。

通过免疫共沉淀，可以分离出参与信号转导的关键蛋白，进一步了解其在信号传导过程中的功能和调控机制。

一原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A 珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。

COIP免疫共沉淀实验原理COIP（Co-immunoprecipitation）又称为共沉淀法，是一种常用的蛋白质相互作用研究方法。

该方法通过特异性抗体结合可以与靶蛋白相互作用的蛋白进行共沉淀，进而检测目标蛋白与其相互作用蛋白的存在。

COIP 方法可以用于研究蛋白质相互作用的结构、功能和动力学等方面。

COIP方法的原理可以总结为以下几个步骤：1.细胞裂解：首先需要获取含有目标蛋白的样品，可以是细胞裂解液或组织提取物。

样品需要经过适当的处理，最常用的是利用磷酸缓冲液含有盐洗涤细胞，从而打破细胞膜，使蛋白质裂解。

2.共沉淀试剂的制备：共沉淀试剂通常由特异性抗体与载体蛋白（如蛋白A/G或青霉素酰胺等）结合而成。

特异性抗体用于识别目标蛋白，载体蛋白则用于固定和沉淀抗体-抗原复合物。

载体蛋白通常具有亲和力，能够与抗体结合形成稳定的复合物。

3.共沉淀试剂的结合：将共沉淀试剂加入细胞裂解液中，使其与目标蛋白结合形成复合物。

目标蛋白与抗体结合后，与载体蛋白的特异性结合使复合物能够稳定。

4.免疫共沉淀：此步骤是COIP方法的核心，其目的是将目标蛋白及其相关蛋白质结合的复合物从细胞裂解液中沉淀下来。

常用的方法有加入蛋白A/G琼脂糖磁珠或微珠，使其与抗体-抗原复合物相互结合形成稳定的复合物，然后通过磁力或离心沉淀下来。

此步骤通常需要进行数次洗涤以去除非特异性结合的蛋白质。

5. 分离和分析：最后将COIP得到的蛋白复合物溶解或电泳分离，然后通过Western blot等方法检测目标蛋白及其相互作用的蛋白质。

总的来说，COIP（共沉淀法）通过特异性抗体和载体蛋白的结合形成稳定的复合物，实现了目标蛋白及其相互作用蛋白的共沉淀。

通过COIP 方法可以探究蛋白质相互作用的结构、功能和动力学等方面的研究。

免疫共沉淀原理及步骤免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。

目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。

通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。

免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min， 12,000g 离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。

免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。

免疫共沉淀联合质谱
免疫共沉淀联合质谱（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry, IP-MS）是一种新型的蛋白质互作分析方法，它将免疫共沉淀（IP）和质谱技术（MS）相结合，可以有效地确定蛋白质间的互作关系，为研究蛋白质组学提供重要帮助。

IP-MS技术包括三个主要步骤：1）特异性免疫共沉淀；2）共沉淀物的鉴定；3）蛋白质互作网络的建立。

1、特异性免疫共沉淀
免疫共沉淀是一种用于研究蛋白质之间相互作用的常用技术，它能够特异性地捕获细胞内的蛋白质或多肽结合到表位抗原的抗体上。

这一步需要选择有特异性的抗体，并将抗体与细胞内的抗原结合，使其能够特异性地结合到细胞内的蛋白质或多肽上。

2、共沉淀物的鉴定
一般情况下，IP技术能够捕获蛋白质，但无法鉴定出捕获的蛋白质是什么，因此需要进一步将共沉淀物分离，并用质谱技术对共沉淀物进行分析，以确定其组成成分。

质谱技术可以高精度地测定蛋白质的分子量，并利用蛋白质数据库来鉴定出所捕获的蛋白质是什么。

3、蛋白质互作网络的建立
根据共沉淀物的鉴定结果，可以建立蛋白质互作网络，从而可以更好地理解蛋白质之间的互作关系，以及蛋白质组学中的生物学调控网络。

IP-MS技术具有高灵敏度、高特异性和快速分析的优势，在研究蛋白质组学方面有着重要的应用价值。

它不仅可以用于鉴定蛋白质相互作用，还可以用于研究蛋白质的结构和功能，从而为生物学研究提供重要的参考。