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9 蛋白质及氨基酸的测定

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蛋白质与氨基酸测定

蛋白质与氨基酸测定
非必需氨基酸
人体可以自行合成，不必从食物中摄取的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸等。
氨基酸的功能
合成蛋白质
合成其他生物活性物质
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，通 过脱水缩合形成肽链，进而形成蛋白 质。
氨基酸可以作为合成其他生物活性物 质的原料，如嘌呤、嘧啶等。
代谢调节
氨基酸参与多种代谢反应，如糖代谢、 脂肪代谢和氮代谢等，对维持人体正 常生理功能具有重要作用。
生物能源研究
蛋白质和氨基酸在生物能源领域也有应用，如通过测定蛋 白质的分解产物来评估生物燃料的生产效率和可持续性。
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蛋白质含量。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度来测 定蛋白质含量，如双缩脲法、 酚试剂法等。
色谱法
利用色谱技术分离蛋白质，通 过测定各组分的含量来计算蛋 白质含量。
质谱法
通过测定蛋白质的质荷比来鉴 定蛋白质，常用于蛋白质组学
研究。
02
氨基酸测定
氨基酸的种类
必需氨基酸
人体无法自行合成，必须从食物中摄取的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和组氨酸。
蛋白质在生物体内可以水解成氨基酸， 氨基酸通过合成反应形成蛋白质。
蛋白质与氨基酸在生物体内的代谢过程
蛋白质的合成与分解
在生物体内，蛋白质的合成和分解是 一个动态平衡的过程。合成主要发生 在细胞内的核糖体上，而分解则通过 蛋白酶的催化作用进行。
氨基酸的代谢
氨基酸在生物体内经过一系列的代谢 反应，可以转化为其他有机物质，如 葡萄糖、脂肪等。同时，氨基酸也可 以作为合成核苷酸、激素等物质的原 料。

食品中蛋白质和氨基酸的测定(精)

食品中蛋白质和氨基酸的测定(精)
苋菜红 胭脂红 柠檬黄 日落黄 靛蓝 亮蓝
2．合成色素的提取
聚酰胺吸附色素
3．定性分析 14． 定量分析 5 ．薄层层析法、高效液相色谱法测定的基本要 求
三、甜味剂的测定
糖精钠的测定：糖精是应用较为广泛的人工甜味 剂 其学名为邻—磺酰苯甲酰亚胺其结构式为：
1．HPLC法 2．酚磺酞比色法 [原理] 样品中的糖精钠在酸性条件下用乙醚提 取分离后，与酚和硫酸在175 ℃作用，生成酚 磺酞，再与氢氧化钠反应产生红色溶液，与标 准系列比较定量。 [说明] ①本法受温度影响较大，要使糖精充分与 酚在硫酸作用下生成酚磺酞，应严格控制在 175士2℃温度下反应 2小时。②苯甲酸等有机 物对测定有干扰，故要通过碱性氧化铝层析柱 以排除干扰。 3． 紫外分光光度法
二、蛋白质和氨基酸的分类
三、蛋白质的一般性质
1． 物理性质
2 ．化学性质
第二节 蛋白质的测定
蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质 的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质 含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、 酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含 量 。 具体测定方法：凯氏定氮法是最常用的，国内 外应用普遍；双缩脲反应、染料结合反应、酚 试剂法； 国外：红外分析仪
④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大 量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时 应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛 醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制 热源强度。 ⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧 瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继 续加热消化。 ⑥ 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克 试样5 m1的比例增加硫酸用量。
[步骤] 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与 滴 定 1.消化 总反应式： 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4= （NH42SO4+6CO2+12SO2+16H2O

第九章 蛋白质和氨基酸的测定

第九章 蛋白质和氨基酸的测定

4．结果计算
式中
w——氨基酸态氮的质量分数；
C——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；
V1——用中性红作指示剂滴定消耗氢氧化钠标 准溶液的体积，ml；
V2——用百里酚酞作指示剂滴定消耗氢氧化钠 标准溶液的体积，ml； 0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol
m—— 测定用样品溶液相当于样品的质量，g。
思考题：
1．为什么说用凯氏定氮法测定出食品中的蛋白质含量 为粗蛋白含量?
2．在消化过程中加入的硫酸铜试剂有哪些作用?
3．样品消化过程中内容物的颜色发生什么变化?为什 么?
4．样品经消化进行蒸馏之前为什么要加入氢氧化钠？ 这时溶液的颜色会发生什么变化?为什么?如果没有变 化，说明了什么问题?须采取什么措施？ 5．蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中的水为何要用硫 酸调成酸性? 6．蛋白质测定的结果计算为什么要乘上蛋白质系数?
(5) 混合指示剂
甲基红—溴甲酚绿混合指示剂： 5份2g/L溴甲酚绿95％乙醇溶液与1份2g/L甲基红乙 醇溶液混合均匀。终点为灰红色。 或甲基红—亚甲蓝混合指示剂：
一体积的亚甲蓝（0.05%酒精溶液）和二体积的甲 基红指示剂（0.05%酒精溶液）的混合物。终点为紫色。
(6) 饱和硼酸溶液（40g/L）： 称取20g硼酸溶解于500mL热水中，摇匀备用。 (7) 0.1N盐酸标准溶液
第九章 蛋白质和氨基酸的测定
第一节 概述 第二节 蛋白质的测定方法 第三节 氨基酸态氮的测定
第一节 概述
一、pro组成与蛋白质系数 1．组成 pro是由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大 分子化合物。
元素组成百分比：
元素 C H O N S P
百分比 50 7 23
16

10. 蛋白质和氨基酸的测定练习题 (3)

10. 蛋白质和氨基酸的测定练习题 (3)

第十章蛋白质和氨基酸的测定练习题一、填空题1、凯氏定氮法是通过对样品总氮量的测定换算出蛋白质的含量，这是因为。

答案：含氮是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志2．凯氏定氮法消化过程中H2SO4的作用是；CuSO4的主要作用是。

答案：使蛋白质分解，有机氮转化为氨；催化剂3．凯氏定氮法的主要操作步骤分为四个步骤；在消化步骤中，需加入少量辛醇并注意控制热源强度，目的是；在蒸馏步骤中，清洗仪器后从进样口先加入，然后将吸收液置于冷凝管下端并要求，再从进样口加入 20%NaOH至反应管内的溶液有黑色沉淀生成或变成深蓝色，然后通水蒸汽进行蒸馏；蒸馏完毕，首先应，再蒸1分钟后，再停火断气。

答案：消化、蒸馏、吸收、滴定；消泡；样品消化稀释液；冷凝管的下端插入液面下；将冷凝管下端提离液面清洗管口4、消化时还可加入、助氧化剂。

答案：过氧化氢；次氯酸钾5、消化加热应注意，含糖或脂肪多的样品应加入作消泡剂。

答案：辛醇或液体石蜡或硅油6、消化完毕时，溶液应呈颜色。

答案：蓝绿色7、用甲基红－溴甲酚绿混合指示剂，其在碱性溶液中呈色，在中性溶液中呈色，在酸性溶液中呈色。

答案：绿；灰；红8、凯氏定氮法用盐酸标准溶液滴定吸收液，溶液由变为色。

答案：蓝色；微红9、蛋白质分子中因含有两个以上的，与双缩脲结构相似，因此也有双缩脲反应。

答案：肽键10、双指示剂甲醛滴定法测氨基酸总量，所用的指示剂是剂。

此法适用于测定食品中氨基酸。

若样品颜色较深，可用处理或用方法测定。

答案：中性红指示剂和百里面酚酞指示剂；游离；活性碳；电位滴定法11、凯氏定氮法碱化蒸馏后,用作吸收液.。

答案：硼酸12、食品中氨基酸态氮含量的测定方法有和，该方法的作用原理是利用氨基酸的，甲醛的作用是。

答：电位滴定法；双指示剂甲醛滴定法；两性性质；固定氨基13、凯氏定氮法测定蛋白质步骤分为、、和。

答：湿法消化；碱化蒸馏；硼酸吸收；盐酸标定。

14、双指示剂甲醛滴定法测氨基酸总量，取等量的两份样品，在两份样品中分别加入指示剂和，用氢氧化钠标准溶液滴定至终点分别呈和颜色。

食品理化检验分析 第九章 蛋白质和氨基酸的测定

食品理化检验分析 第九章 蛋白质和氨基酸的测定
4.用HCL滴定
二、 自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红 外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消 化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自 动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12 分钟完成1个样。
5.计算： 氨基酸态氮=〔 c×（V2-V1）×0.014×100 ） 〕/W×100 V1——用中性红为指示剂时，碱液所消耗 的体积 V2——用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液 消耗量
0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol。
（二）茚三酮的比色法
原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生 成蓝紫色化合物，可比色定量。（570nm）
一.双缩脲法 1.原理 脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至150~160℃时 ，两分子缩和成双缩脲。 NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色络和 物，此反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键（ —CO—NH—），与双缩 脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定 条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分 光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）
3．双指示剂：
① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。
② 0.1%百里酚酞乙醇溶液，（9.4～10.6）
③ 0.1%中性红 50%乙醇溶液，（6.8～8.0） ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。
4．操作：
取相同两份样品20～30mg→分别于250ml三角瓶→各 加50ml蒸馏水 一份加中性红3滴→用0.1mol/L NaOH 滴定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚 酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→摇匀→用0.1mol/L NaOH 滴至淡兰色。分别记录两次所消耗的碱液ml数。

食品分析与检验蛋白质与氨基酸的测定

食品分析与检验蛋白质与氨基酸的测定

食品分析与检验蛋白质与氨基酸的测定蛋白质与氨基酸的测定在食品分析与检验领域中具有重要意义。

蛋白质是食品中重要的营养组分，而氨基酸是构成蛋白质的基本单元，对于评价食品的品质和安全性具有重要意义。

本文将介绍蛋白质与氨基酸的测定方法及其在食品分析与检验中的应用。

蛋白质的测定方法主要有几种：生物测定法、光谱法和色谱法。

其中，生物测定法主要是通过测定食品中的氮元素含量来间接测定蛋白质含量。

常用的方法有凯氏氮法、造浆法和改良Kjeldahl法等。

光谱法主要是通过根据蛋白质的特征光吸收谱测定其含量。

常用的方法有紫外-可见光谱法、荧光光谱法和红外光谱法等。

色谱法是通过分离和检测蛋白质的各种成分来测定其含量。

常用的方法有凝胶过滤层析法、液相色谱法和气相色谱法等。

氨基酸是构成蛋白质的基本单元，对于评价蛋白质的营养价值和品质具有重要作用。

氨基酸的测定方法主要有色谱法和生物传感器方法。

其中，色谱法是目前最主要的氨基酸定量方法，其主要包括高效液相色谱法和气相色谱法。

高效液相色谱法常用于氨基酸的定性和定量分析，具有灵敏度高、选择性好和分析速度快的特点；气相色谱法通常用于氨基酸的定性分析，具有高分离能力和分析速度快的优势。

生物传感器方法是一种新兴的氨基酸测定方法，通过利用生物传感器对氨基酸的选择性响应来测定其含量。

生物传感器方法具有灵敏度高、反应快和操作简便等特点。

在食品分析与检验中，蛋白质与氨基酸的测定具有广泛的应用。

首先，蛋白质含量是评价食品营养价值的重要指标之一、通过测定食品中蛋白质的含量，可以评估其蛋白质营养价值和食品质量。

其次，氨基酸是判定食品蛋白质种类和品质的重要指标。

通过测定食品中各种氨基酸的含量，可以评价蛋白质的品质和营养价值。

此外，蛋白质与氨基酸的测定还可以用于食品的伪标问题的检验，如检验食品中是否含有非法添加的蛋白质或氨基酸衍生物。

综上所述，蛋白质与氨基酸的测定在食品分析与检验中具有重要意义。

通过选择合适的测定方法，可以准确、快速地测定食品中的蛋白质含量和氨基酸组成，从而评价食品的品质、安全性和营养价值。

蛋白质氨基酸测定

蛋白质氨基酸测定

三聚氰胺(melamine)
是一种有机含氮杂环化合物，学名1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺， 或称为2,4,6-三氨基－1,3,5-三嗪，简称三胺、蜜胺、氰尿 酰胺，是一种重要的化工原料，主要用途是与醛缩合，生 成三聚氰胺-甲醛树脂，生产塑料，这种塑料不易着火，耐 水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀，有良好的绝缘 性能和机械强度，是木材、涂料、造纸、纺织、皮革、电 器等不可缺少的原料。它还可以用来做胶水和阻燃剂，部 分亚洲国家，也被用来制造化肥。
①样品消化 : 准确称取一定量的样品至干燥洁净的 500mL凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.5g（1g）、硫酸钾10g （3g)和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒→轻轻摇匀，以45º斜 支于石棉网上→用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电 炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后→加 大火力(或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸→至 液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭电炉， 取下烧瓶、冷却→转移至100mL容量瓶中，加水定容。
❖ 加入硫酸铜的作用 催化作用：加速有机物的氧化分解 C＋ 2CuSO4 → Cu2SO4 ＋ SO2↑＋ CO2↑ Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋ SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫 酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。
消化完全指示：蓝绿色；
三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高（66 ％），加之其生产工艺简单、成本很低， 给了掺假、造假者极大地利益驱动，有人 估算在植物蛋白粉和饲料中使蛋白质增加 一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实 蛋白原料的1/5。所以“增加”产品的表观 蛋白质含量是添加三聚氰胺的主要原因， 三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什 么气味和味道，掺杂后不易被发现等也成 了掺假、造假者心存侥幸的辅助原因。

食品中氨基酸及蛋白质的测定(实验报告)

食品中氨基酸及蛋白质的测定(实验报告)

测定食品中的蛋白质---2013.3.25组员：***实验目的：（1）会测定食品中粗蛋白的含量。

（2）明确常见的食品蛋白质含量，以及测定原理。

实验原理：将被检样品加入浓硫酸，以硫酸铜，硫酸钾为催化剂共同加热消化食品中蛋白质分解为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，通过碱化蒸馏，使氨分离出来，用硼酸吸收形成硼酸按后，再用盐酸标准溶液滴定，根据消耗的标准盐酸的体积，通过换算系数，可测定食品中蛋白质的含量。

实验仪器：凯氏烧瓶、可调式电炉、定氮蒸馏装置试剂：①硫酸铜CuSO4.5H2O ②硫酸钾③硫酸（密度为1.8149g/L）④40g/L 硼酸溶液⑤混合试剂；1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L亚甲基蓝乙醇溶液，用时按2：1的比例混合。

实验步骤:数据处理：标定0.1000mol /L 盐酸标准溶液微量蒸馏按下式计算：X=⨯⨯⨯⨯-10010m c0.014)(0V V F 100⨯式中 X 食品中蛋白质质量分数，%;V 滴定试样时消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL;V 0 空白试验时消耗盐酸标准滴定溶液的体积mL ；C 盐酸标准滴定溶液的浓度； 0.014 氮的毫摩尔质量，g/mmol; m 试样的质量，g;F 氮换算蛋白质的系数。

注意事项：①本实验对蛋白质含量进行测定，因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。

②为减少实验误差，所有试剂溶液应用无氨蒸馏水配置。

③消化过程要不断转动凯氏烧瓶，以利于附着在烧瓶上的固体残渣被洗下，促进其消化；同时为防止造成氮损失，不要用强火，应保持缓和沸腾。

④样品中含脂肪或糖较多，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫外溢，在消化开始时用小火加热，并时时摇动，并可以加入少量辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂，并控制热源强度。

⑤一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，呈较深绿色。

蛋白质和氨基酸的测定

蛋白质和氨基酸的测定

缬氨酸
丝氨酸
Pro的基本组成单位是氨基酸 几种常见的氨基酸
那什么是 氨基酸呢？
几种常见的氨基酸
这些氨基酸 结构上有什 么共同点？
羧基和氨基 连接在同一 个碳原子上
蛋白质的基石物质：α-氨基酸
氨基酸的缩合
二肽、多肽等
肽键
三、什蛋问么：白样蛋质的白性质的质具性呢有？质
1. 盐析 2. 变性
1. 误食重金属盐,可 以喝大量牛奶进 行紧急处理 ,WHY?
a) 凯氏烧瓶500 mL或250 mL b) 龙科A—凯氏定氮仪 c) 扭力天平 d) 分析天平 e) 5mL移液管 f) 温度可以控制的电炉 g) 小漏斗 h) 滴定管 i) 250 mL锥形瓶 j) 玻璃珠
②仪器
③ 试剂
〔GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》第一法〕
a) 硫酸铜 <CuSO4·5H2O> b) 硫酸钾 c) 硫酸 <密度为1.8419g/L> d) 硼酸溶液 <20g/L> e) 氢氧化钠溶液 <400g/L> f) 盐酸标准滴定溶液[c<HCl>=0.0500 mol/L] 或硫酸标准滴定溶 液[c<1/2H2SO4>=0.0500 mol/L] g) 混合指示液：1份甲基红乙醇溶液 <1g/L> 与5份溴甲酚绿乙醇 溶液<1g/L> ,临用时混合.<也可用2份甲基红乙醇溶液<1g/L>与1 份次甲基蓝乙醇溶液<1g/L>临用时混合>.
36.2
切达干酪
24.9
酸奶(普通的、低脂) 5.3
水果和蔬菜
苹果(生、带皮)
0.2

实验9 蛋白质及氨基酸的颜色反应

实验9 蛋白质及氨基酸的颜色反应

实验9 蛋白质及氨基酸的颜色反应一、目的和要求1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、试剂1.鸡蛋清。

2.蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释10~20倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。

3.10% NaOH溶液；20% NaOH。

4.浓硝酸（比重1.42）；浓盐酸；浓硫酸（分析纯）；冰醋酸（一般含有乙醛酸杂质，故可用冰醋酸代替乙醛酸）。

5.1% CuSO4溶液。

6.10% Pb(Ac)2溶液（醋酸铅溶液）。

7.醋酸铅试纸：将滤纸条浸入10% 醋酸铅溶液中，湿透后取出，100℃烘干即可。

8.0.5% 甘氨酸溶液。

9.0.3% 色氨酸溶液。

10.0.3% 酪氨酸溶液。

11.0.3% 精氨酸。

12.0.3% 组氨酸溶液。

13.0.1% 茚三酮水溶液。

14.0.1% 茚三酮-乙醇溶液（称取0.1g茚三酮，溶于100mL 95% 乙醇。

临用前配制）。

15.头发；指甲屑。

16.0.5% 苯酚溶液。

17.1% α-萘酚乙醇溶液，临用时配制。

18.NaBrO溶液：2克溴溶于100ml 5% NaOH中，置棕色瓶中，可在暗处保存两周。

19.偶氮试剂：溶液A：5克亚硝酸钠溶于1000ml水中。

溶液B：5克对氨基苯磺酸溶于1000ml水中，溶解后再加入5ml浓硫酸。

A、B溶液分别保存在密闭瓶中，用时以等体积混合。

三、实验内容对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、坂口反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等进行定性确定。

（一）双缩脲反应1、实验原理当尿素加热到180℃左右时，两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲，双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物，此呈色反应称为双缩脲反应。

由于蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，故能呈此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。

此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。

2、操作取一支试管，加入蛋白质溶液约1ml 和10% NaOH 溶液2ml ，摇匀，再加1% CuSO 4溶液两滴，随加随摇。

蛋白质及氨基酸分析

蛋白质及氨基酸分析

② 蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓 氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放 出氨气，反应方程式如下： 2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O
③ 吸收与滴定：加热蒸馏所放出的氨，可用 硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用 盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k ＝5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂 的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收 及滴定的反应方程式如下： 2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H30ml离心管→加 1mlClC4→混合→加50ml酒石酸钾钠稳定 剂→盖上盖子离心10min（4000转/分）→ 放置1小时→吸混合液15ml→于20ml离心 管中→离心到完全透明→取上清夜5ml于 →10ml容量瓶→加水定容→于560nm处测 定吸光度，从标准曲线上查出蛋白质含量。
1.蛋白质分析的重要性 (1)生物活性测定 一些蛋白质包括酶或酶抑制因 子和食品科学与营养有关，例如肉类嫩化中的蛋 白酶、水果成熟中的果胶酶以及豆类中的胰蛋白 酶抑制因子都是蛋白质。 (2)功能性质调查 不同种类食品中的蛋白质都有 其独特的食品功能性质，例如小麦面粉中的麦醇 溶蛋白和麦谷蛋白具有成面团性，牛乳中的酪蛋 白在干酪制作中具有凝结作用，而鸡蛋卵清蛋白 具有起泡能力。
二蛋白质的含量测定凯氏定氮法凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确操作较为简单的方法之一可用于所有动植物食品的分析及各种加工食品的分析可同时测定多个样品故国内外应用较为普遍是个经典分析方法至今仍被作为标准检验方法样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化使蛋白质分解其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵

196-习题作业-食品中蛋白质和氨基酸的测定 习题作业

196-习题作业-食品中蛋白质和氨基酸的测定 习题作业

习题九、食品中蛋白质的测定一、填空题1．凯氏定氮法是通过对样品总氮量的测定换算出蛋白质的含量，这是因为。

2．凯氏定氮法消化过程中浓H2SO4的作用是 ；CuSO4的作用是。

3．凯氏定氮法测定蛋白质含量时，在消化步骤中，有时需加入少量辛醇并注意控制热源强度，目的是 ；在蒸馏步骤中，清洗仪器后，然后将吸收液置于冷凝管下端并要求 ，然后从加样口加入 再加入10mL40%NaOH至反应管内的溶液有黑色沉淀生成或变成深蓝色，然后通水蒸汽进行蒸馏；蒸馏完毕，首先应，再停火断气。

4．氨基酸态氮反映的是样品中 的总量。

5．凯氏定氮法测定蛋白质含量过程中，样品经消化进行蒸馏之前加入NaOH的目的是 ，这是溶液的颜色会变为 ，是因为 ，如果颜色没有发生变化，应该 。

6．氨基酸态氮测定时，加入甲醛的作用是 。

7．凯氏定氮法共分四个步骤 、 、 、 。

8．消化加热应注意，含糖或脂肪多的样品应加入 作消泡剂。

9．消化完毕时，溶液应呈 颜色。

10．凯氏定氮法测定蛋白质含量时，滴定用甲基红－溴甲酚绿混合指示剂，其在碱性溶液中呈 色，在酸性溶液中呈 色。

11．凯氏定氮法加入K2SO4的目的是 。

12．构成蛋白质的基本物质是 。

蛋白质区别于其他有机化合物的主要标志是。

13．凯氏定氮法碱化蒸馏后，用 吸收液。

二、判断题1．凯氏定氮法测定蛋白质时，加碱蒸馏前应将冷凝管的下端先没入硼酸吸收液中；蒸馏完毕，直接切断热源即可。

（ ）2．凯氏定氮法测得的蛋白质含量是样品中粗蛋白质的含量。

（ ）3．用复合电极测定溶液的pH时，必须首先进行定位校正。

（ ）4．某实验员在滴定分析中用最小刻度为0.1mL，标称容量为25mL的滴定管进行滴定，最后记录结果为16.4mL。

（ ）三、名词解释粗蛋白含量 蛋白质系数四、问答题1．凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作步骤如何？加入的各种试剂起什么作用？操作过程中有哪些注意事项？2．蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中的水为什么要用硫酸调成酸性？3．凯氏定氮法测定蛋白质含量的测定结果为什么要乘以蛋白质系数？五、综合题现测定某试样中蛋白质的含量。

蛋白质与氨基酸的测定

蛋白质与氨基酸的测定

蛋白质与氨基酸的测定
蛋白质测定可以采用以下方法：
1. 比色法：常用的比色剂有布鲁姆甘蓝G、伯胺蓝、硫酸铜-法明斯试剂等。

比色法的原理是蛋白质与比色剂形成复合物，复合物的颜色与蛋白质的含量成正比。

2. 生物学方法：通过测定蛋白质在生物体中所起的生物学作用，如酶活性、免疫反应等来定量测定蛋白质的含量。

3. 尿素-二元酸法：通过加入细胞膜清洗液中的尿素和二元酸，并利用这两种化合物对蛋白质的溶解性，然后根据其溶解度定量测定蛋白质的含量。

氨基酸的测定可以采用以下方法：
1. 比色法：在酸性条件下，氨基酸与2,4-二硝基苯肼、2,4-二硝基苯胺等发生磺酰化反应，形成淡棕色的产物，比色法根据产物的吸光度来定量测定氨基酸的含量。

2. 二级结构破坏法：通过加热和高浓度酸的处理，使蛋白质的二级结构破坏，进而测定其中的氨基酸含量。

3. 比重法：在油水分离流程中，用比重法分离出有机相，然后加入酸性溶液，
氨基酸与酸反应，形成有颜色的产物，根据产物的吸光度来定量测定氨基酸的含量。

食品分析《蛋白质及氨基酸含量的测定》(第9章)

食品分析《蛋白质及氨基酸含量的测定》(第9章)

同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋
白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。 （560nm）
方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测 定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷 等作物种子及肉类等样品测定。
紫外吸收法测定蛋白质含量
双指示剂： ① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40% 甲醛中和至蓝色。
② 0.1%百里酚酞乙醇溶液，
③ 0.1%中性红50%乙醇溶液， ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。 操作：同时取两份样， ① + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性
物质。
② + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH滴，中和了样液中氨基酸的羧 基与其它酸性物质的总和。二者之差可计算氨基酸含量。
Rf = a / b
溶剂前沿 b 样点 a
点样原点
优点：
① 展开时间短，一般在20—30分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。 ② 层析后得到的斑点小而清晰。 ③ 能够使用多种显色剂。 ④ 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10—100倍） 精确 到0.01ug。 ⑤ 也可用于大量分离＞500 mg，作为样品制备层析。
存于溶液中，过滤后，用凯氏定氮法分别测定沉淀和滤液中 的氮含量。
蛋白质氮和非蛋白质氮的测定
（2）用Cu(OH)2作沉淀剂： 原理：样品经粉碎后加水磨至均匀后，转入离心管中，以 Cu(OH)2沉淀蛋白质，离心分离，并用蒸馏水洗涤。用凯氏 定氮法分别测定溶液中的非蛋白氮和沉淀中的蛋白质氮。
氨基酸的一般定量测定 1、甲醛滴定法 原理：氨基酸本身有碱性 —NH2— 基，又有 酸性 —COOH 基，成中性内盐，加入甲醛 溶 液后，与 —NH2— 结合，碱性消失，再用强碱来滴定 — COOH 基。 特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中 氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）

徐州工程学院食品科学与工程《食品分析》讲义 第十章 蛋白质和氨基酸的测定

徐州工程学院食品科学与工程《食品分析》讲义 第十章 蛋白质和氨基酸的测定






二、双缩脲法 1、原理 当脲被小心地加热至150～160 ℃时，可由两个分子同 脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应 如下。 H2NCONH2+H—N(H)—CO—NH2→ ℃H2NCONHCONH2+NH3↑ 双缩脲在碱性条件下，能与硫酸铜作用生成紫红色的 配合物，称为双缩脲反应。 由于蛋白质分子中含有肽键（—CO—NH—），与双缩 脲结构相似，所以也能呈现此反应而生成紫红色配合 物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比， 据此可用吸光度法来测蛋白质含量。该配合物在540～ 560 nm波长有最大吸收。 适用范围：本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在 生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。

（2）样品测定：吸取一定量的样品稀释 液于比色管中，按上述标准曲线绘制方 法操作，以空白管调零，测定A595 nm 值，从标准曲线上查出蛋白质的质量浓 度，求出样品的蛋白质的含量。


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4、注意事项 （1）所有玻璃仪器要清洗干净并要干燥， 取样要准确。 （2）在试剂加入后的5～20 min内测定 吸光度，因为在这段时间内颜色是最稳 定的。测定中，蛋白质－染料复合物会 有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后 可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

3、操作步骤 (1)标准曲线绘制：取7支比色管，分别加入 标准蛋白质溶液、水和考马斯亮蓝试剂， 即用0.1 mg/mL的标准蛋白质溶液给各比色 管分别加入0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL，然后用无离 子水补充到1 mL。最后各试管中分别加入 5.0 mL考马斯亮蓝G-250试剂，每加完一管， 立即混合。用标准蛋白质含量为横坐标， 用吸光度值A595 nm为纵坐标，作图，即得 到一条标准曲线。
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5．操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为
标准样绘标准曲线。
三．紫外吸收法
1．原理：利用蛋白质的特有基团，
R │ （— NH—CH—CO） 对紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度与蛋白 质浓度成直线关系，求含量。
2．适用范围：常用于生物化学工作，因为 干扰因素多，故在食品分析领域应用不广 泛。
硫酸铜的作用
① 催化剂 2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2 ↑ C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+CO2↑
Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后， 不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清 澈的蓝绿色。
② 可以指示消化终点的到达
⑦蒸馏过程应注意接头处无松漏现象，蒸馏完毕，
先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附 着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸 收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源， 否则吸收液将发生倒吸。
⑧硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸
收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。
⑨混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液
9 蛋白质及氨基酸的测定
概述
蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主
要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质 中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。
在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包 括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水 化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色 素）。
0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol；
F—蛋白质系数；
m—样品质量，g。
改 进 后 的 水 化 装 置
硫酸钾的作用
加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物 的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应 温度其反应式如下：
K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3 一般纯硫酸的沸点在340℃左右，而添加硫酸 钾后，可使温度提高到400℃以上，原因主要在于 随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出 而使硫酸钾浓度增大 ，故沸点升高。 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度 过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损 失： （NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O
不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如 玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为 5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦 粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。
蛋白质含量测定最常用的方法
•
凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的
蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中含有少量非蛋
常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧 化钛。
常量凯氏定氮法 (1) 原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使 蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和 水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结 合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼 酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据 标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
4. 结果计算
氨基酸态氮（%） (V2 V1) c 0.014 100 m
式中 c ——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L; V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液 的体积，mL; V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶 液的体积，mL; m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014——氮的毫摩尔质量，g/m mol
2．特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮
量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食 品中游离氨基酸的测定）
3. 操作方法：同时取两份样：
① + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中 和样液中其它酸性物质。
② + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。
二者之差可计算氨基酸含量。
④硫酸铜起到催化作用，加速氧化分解。硫酸铜
也是蒸馏时样品液碱化的指示剂，若所加碱量 不足，分解液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需 再增加氢氧化钠用量。
⑤若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试
样5ml的比例增加硫酸用量。
⑥消化时间一般约4小时左右即可，消0 分钟即可.
中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。
蛋白质的分光光度测定法
1、原理 样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使
蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸 铵。然后在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中， 铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二 乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氢化吡啶化合物。 在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比 较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含 量。
3．主要仪器： ① 紫外分光光度计 ② 离心机（3000 — 5000 r/min）
4．操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线
氨基酸态氮的测定
(一）双指示剂甲醛滴定法：
1.原理：氨基酸本身有碱性 —NH2— 基，又有 酸性 —COOH 基，成中性内盐，加入甲醛 溶液后，与 —NH2— 结合，碱性消失，再 用强碱来滴定 —COOH 基。并用间接的方 法测定氨基酸的总量。反应式如下：
在接受瓶中加入10ml 40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷 凝管下端插入液面以下。
③ 滴定
取下接收瓶，以0.01000mol/L盐酸标 准溶液滴定至微红色为终点。
④ 结果计算W
(V1
V0) c m
0.014
V2
100
F
100
式中W—蛋白质的含量，g/100g；
V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C—盐酸标准液的浓度，mol/L；
是个经典分析方法，至今仍 被作为标准检验方法。
•
此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。
凯氏定氮法：常量法、微量法及经改 进后的改良凯氏定氮法
微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少， 且有一套微量凯氏定氮器。
目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、 微量凯氏定氮法。
在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中 氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题， 即分解试样所用的催化剂。
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，所含的主要 化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有 微 量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别 其他有机化合物的主要标志。
（3）蛋白质系数
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同， 故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋 白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份 蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。
微量凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 滴定用盐酸浓度由0.05 mol/L→ 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。
① 样品消化 将消化完全的消化液冷却后，完全转入
100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。
② 蒸馏
按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至 2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈 酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
③ 下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
（5） 注意事项
①所用试剂应用无氨蒸馏水配制。加指
示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈 酸性。
②若样品含脂肪或糖较多时，应注意发
生的大量泡沫 应加入少量辛醇或液体 石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外， 并注意适当控制热源强度。
③若样品消化液不易澄清透明，可加入
300g/L2~3mL过氧化氢后再加热。
白质用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了
核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白
质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。
凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单
的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食
品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，
①消化
消化反应方程式如下：
2NH2(CH2)2COOH ＋ 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O
浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸又具有氧化性,将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还 原成二氧化硫 2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2
（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自 动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12 分钟完成1个样。
北京福德泰和科技有限公司 产品名称： 凯氏定氮仪
蛋白质测定仪
双缩脲法
传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度 高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境 污染。 新开发的：双缩脲法、
紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。
③ 吸收与滴定
加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收， 待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微 弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的 变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应 方程式如下：
2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
3. 说明及注意事项： ① 加入甲醛以后应立即滴定，不宜放置 时间过长，以免甲醛聚合，影响测定结 果。 ② 样品中若含有铵盐，由于胺离子也能 与甲醛反应，将使测定结果偏高：
4NH4++6HCHO→(CH2)6N4+6H2O+4H+