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高产辅酶Q_10_类球红细菌的化学诱变筛选及其发酵培养基优化_扶教龙

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产辅酶Q_(10)菌株选育及发酵过程优化研究

产辅酶Q_(10)菌株选育及发酵过程优化研究

产辅酶Q_(10)菌株选育及发酵过程优化研究辅酶Q10(CoQ10)作为细胞有氧呼吸链中的一个重要递氢体,广泛应用于医药和食品行业。

近年来,CoQ1o作为一种辅助药物,在治疗心脏衰竭方面,使用比例逐年增加,因此对CoQ1o的需求也不断增长。

对产CoQ1o微生物的开发利用也愈发重要。

本文以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)为出发菌,研究了该菌的诱变选育、培养基优化和补料分批发酵工艺。

1.对比皂化法、超声波破碎法、反复冻融法、酸热法和酸热辅助超声法对CoQ1o提取效果的影响,确定了酸热辅助超声破胞方法的可行性。

并通过单因素实验、正交法实验确定其最佳提取工艺条件。

酸热辅助超声法提取类球红细菌中CoQ1o最优的提取条件是加入300μL的盐酸、80 ℃、400w超声处理20min。

此时,CoQ1o得率为3.738mg/g。

2.以自然筛选获得的R.spl-11为出发菌株,经过紫外-LiCl、NTG结合VK3、NaN3和PHB 复合抗性诱变,获得一株遗传性状良好的CoQ1o高产菌株,其产量为71.23mg/L,比出发菌株提高了132.17%。

通过单因素实验对R.sp3-7菌株发酵条件进行优化,得到最优条件为：32℃、初始pH为7.0、接种量8%及装液量为40mL/250mL, CoQ10产量为82.70mg/L。

3.对R.sp3-7生产CoQ1o的发酵培养基进行优化,首先通过单因素筛选确定了培养基最佳碳源、氮源和需添加的金属离子。

通过Plackett-Burman设计对培养基中的9种成分进行筛选,获得影响发酵的3个重要成分：葡萄糖、玉米浆干粉和硫酸镁,再采用Box-Behnken响应面试验对上述三种成分进行优化,获得最佳浓度：葡萄糖36.9g/L、玉米浆干粉5.3g/L、MgSO4 14.4g/L。

优化后CoQ1o产量达到135.20mg/L,比优化前提高了68.62%。

4.在5L发酵罐中考察了pH、溶氧(DO)水平对CoQ1o合成的影响,结果发现CoQ1o合成的最适pH为6.8。

一种辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法[发明专利]

一种辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法[发明专利]

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510502813.5(22)申请日 2015.08.14C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)(71)申请人航天神舟生物科技集团有限公司地址100000 北京市海淀区中关村南大街31号14号楼501-517室(72)发明人李可俊 徐侃彦(74)专利代理机构北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙) 11371代理人栾波(54)发明名称一种辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法(57)摘要本发明涉及类球红细菌噬菌体检测领域，特别涉及一种辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体快速检测方法，选择特定的三对引物中的任一对引物，并以每对引物对应的探针进行荧光定量PCR 检测即可。

该检测方法针对辅酶Q10发酵生产过程中污染类球红细菌的状况，选用特定的引物及其探针测定类球红细菌的污染情况，检测快速且灵敏度高，直接取任一阶段和规模的发酵生产中的发酵物提取基因组DNA，通过荧光定量PCR检测即可，方法简单，检测全过程大概需要两个小时，实现了快速准确的噬菌体检测，若发现有噬菌体污染，立即停止本次发酵产物的扩大生产，这样可以完全避免后一阶段的扩大生产中的噬菌体污染事件发生，减少不必要的损失。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书7页序列表4页CN 105087562 A 2015.11.25C N 105087562A1.一种类球红细菌噬菌体的基因组片段，其特征在于，如SEQ ID No.1所示。

2.一种辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法，其特征在于，选择以下三对引物中的任一对引物，并以每对引物对应的探针进行荧光定量PCR检测即可；每对引物及其对应的探针如下所示：组1：以PF1和PR1作为引物，并以probe1作为探针进行荧光定量PCR检测，其中，PF1：GCGCTCTATTTCATCCCCGA；PR1：CGGTATATTATGACCGGCGC；probe1：CGGAACACTTTGTCAAGCGA；组2：以PF2和PR2作为引物，并以probe2作为探针进行荧光定量PCR检测，其中，PF2：CTCGTCGCCATTCCAATCGG；PR2：CGGGGCCACAAACTTAGGTA；probe2：GCTCGGACTGCCAGAAAATC；组3：以PF3和PR3作为引物，并以probe3作为探针进行荧光定量PCR检测，其中，PF3：ATGAACGCGACCCTTAAGCT；PR3：ACGATTATGTTGGGCGTTGC；probe3：GTCCTGAAAATGCGAGGGTG。

提高微生物发酵辅酶Q10产量的研究进展[1]

提高微生物发酵辅酶Q10产量的研究进展[1]
［"］ 菌， 发现了许多高产菌株 （ 见表 ( ）。
图 (! 异戊烯基侧链的生物合成路线 :GK. ( N9FAO96 2H ?G2I6DFA3IGI 2H IGC3 EA9G4 2H GI2976@343 K82DB
(L (! 营养缺陷型突变株筛选! 由异戊烯基侧链及芳香环 的生物合成途径路线， 选育营养缺陷型突变株， 有利于提 ［-］ 高所需产物的浓度。 P@I24 和 MDC436 发现类胡萝卜素 与 12+(# 均以聚异戊二烯为前体进行合成代谢， 减少类胡 萝卜素的生成量可能会促进 12+(# 的生物合成。 Q2IAGC9
从表 ( 可以看出， 光合细菌菌体中 12+(# 的含量普遍较
! !
"##$ % #& % ’# 收稿日期： （ ()*" ） ， 作者简介： 张千 男， 硕士研究生， 主要从事微生物发酵研究。
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[)I. 0%1 Z). & 第 0% 卷第 & 期 生 物 学 杂 志 1 1 ;BK ， 0++, 年 0 月 WX9YZ8T X; >NXTXS# 0++, !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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高， 因此是产 12+(# 菌种的理想选择之一。但野生型菌株产 12+(# 能力不能满足生产需要， 这就需要利用常规诱变及基
［’］ 因工程技术对其进行遗传改造。MDC436 于 ()0$ 年在关于 12+(# 的国际会议上， 提出了 12+(# 的微生物合成途二烯基侧链的生物合成路线 ， 图 "） 根据这两种生物合成途径再结合细菌的代谢调节机 制， 我们就可以有目的的对产 12+(# 菌株进行筛选。

沼泽红假单胞菌高产辅酶Q10菌株的诱变选育研究

沼泽红假单胞菌高产辅酶Q10菌株的诱变选育研究
１ ． １ ． ３ 主要 仪 器
超净工作台、光照培养箱、高压锅、Ｐ Ｈ仪、 电子天平、可见分光光度计． １ ． ２ 方法 １ ． ２ ． １ 茵种活化 将保存菌种接种于斜面活化培养基， ３ ０ ℃ 光照活化 ４ ８ ｈ后取一环生长良好的菌落接种于种子培养基， 厌氧 培养直至观察培养基变红， 放入冰箱冷藏待用． １ ． ２ ． ２ 辅酶 Ｑ １ ０ 含量测定（ Ｃ ｒ ａ ｖ ｅ ｎ ． ｔ ｅ ｓ ｔ 法） 氰 乙酸乙酯在碱性条件下， 可取代 Ｃ ｏ Ｑ１ ０上的甲氧基， 并可发生颜色反应， 生成蓝色 中间产物， 该产物在 ６ ２ ０ ｎ ｍ 处有最大吸收峰， 并且反应体系中 Ｃ ｏ Ｑ １ ０的浓度与溶液的 Ｏ Ｄ ６ ２ ０值成 良好的正比关系． 根据这一原理， 可以根据辅酶 Ｑ１ ０ 标准品配置成各浓度， 绘制标准曲线． 参照此标准曲线方程， 可得发酵提取液中 Ｃ ｏ Ｏ ］ ０ 的浓 度【 ５ Ｊ ＿ １ ． ２ ． ３ 辅酶 Ｑｌ Ｏ 标准曲线的绘制 取 １ ０ ｍｇ辅酶 Ｑｌ Ｏ标准品，用 ５ ０ ｍ ｌ 无水乙醇定容， 制成 ２ ０ ０ ｇ ｇ ／ ｍ ｌ的母液， 然后用无水 乙醇稀释， 制成 ４ ｇ ｇ ／ ｍｌ 、８ １ ． ｔ ｇ ／ ｍｌ 、１ ２ ｇ ｇ ／ ｍｌ 、１ ６ ｇ ｇ ／ ｍｌ 、２ ０ ｇ ｇ ／ ｍｌ 、２ ４ ｇ ｇ ／ ｍｌ ， ２ ８ ￣ ｔ ｇ ／ ｍｌ 、３ ２ ｇ ｇ ／ ｍｌ 、３ ６ ￣ ｔ ｇ ／ ｍｌ 、４ ０ １ ａ ｇ ／ ｍｌ 的标 准溶 液．取 标准品溶液 １ ０ ０ ｐ ｌ ， 加入氰乙酸乙酯 ８ ０ ｇ ｌ ， 移液枪混合均匀后加入 Ｏ ． ８ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ的甲醇钠甲醇溶液 ２ ０ １ ａ ｌ ， 移液器混 匀． 设置可见分光光度计的检测波长为 ６ ２ ０ ｎ ｍ ， 每分钟记录一次Ｏ Ｄ ６ ２ ０ 值， 直到吸光度不再变化， 记为最大值【 ｏ Ｊ ． 以各浓度 的 Ｏ Ｄ ６ ２ ０ 最大值对标准品浓度做线性 回归曲线得到 Ｃ ｒ ａ ｖ ｅ ｎ ． ｔ ｅ ｓ ｔ 法Ｃ ｏ Ｑ１ ０ 标准曲线． １ ． ２ ． ４ Ｃｏ Ｑｌ Ｏ提 取 （ １ ）细 胞 破碎 以 ５ ％接种量将种子培养基接种于发酵培养基中， ３ ０ ￣ Ｃ ， 光照培养 ９ ６ ｈ ． 取 ｌ ０ ｍ ｌ发酵液， ８ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离心 １ ０ ｍ ｉ ｎ ， 弃掉上清液， 沉淀用 Ｐ Ｂ Ｓ缓冲液冲洗 ３ 次， 得到湿茵体． 将菌体置于冰箱冷冻 区冰冻 ｌ ｈ ， ｌ ： ｌ 比例加入丙 酮， 采用超声波法破壁， 超声波细胞破碎仪工作条件设为 』 ： ５ ０ ０ Ｗ， 工作与 间隔时间为 １ ０ ／ １ ０ ｓ ， 工作时间 １ ５ ｍｉ ｎ ，

辅酶Q10生物合成与生产研究进展

辅酶Q10生物合成与生产研究进展

辅酶Q10生物合成与生产研究进展李家洲;张冬青;肖玉平;黄荣林;赵鑫【摘要】微生物发酵法是生产辅酶Q10的最佳工艺.辅酶Q10的生物合成途径包括异戊二烯焦磷酸合成、聚十异戊二烯焦磷酸合成、苯环修饰等过程.1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶、聚十异戊二烯焦磷酸合成酶、对羟基笨甲酸聚十异戊二烯焦磷酸转移酶等是Q10合成的关键酶.生产辅酶Q10的菌种可通过诱变、基因重组和支路敲除等方法获得.氧化还原电位控制、pH控制补料分批发酵、发酵萃取耦合技术等新工艺逐浙应用于辅酶Q10生产.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)010【总页数】6页(P37-42)【关键词】辅酶Q10;生物合成;菌种构建;生产工艺;代谢调节【作者】李家洲;张冬青;肖玉平;黄荣林;赵鑫【作者单位】广东轻工职业技术学院食品与生物工程系,广州510300;广东轻工职业技术学院食品与生物工程系,广州510300;广东轻工职业技术学院食品与生物工程系,广州510300;广东轻工职业技术学院食品与生物工程系,广州510300;广东轻工职业技术学院食品与生物工程系,广州510300【正文语种】中文辅酶Q(Ubiquinone，CoQ)普遍存在于各类生物体中，从高等生物到低等生物，均含有辅酶Q。

辅酶Q的基本结构如图1所示。

图1中n为侧链聚异戊二烯基的聚合数目，根据n的不同，常见的辅酶Q可分为CoQ6、CoQ7、CoQ8、CoQ9和CoQ10等。

不同生物中所含辅酶Q有所差异，例如人体内以CoQ10为主[1]，但同时还含有少量CoQ9;老鼠体内则以CoQ9为主，同时含少量CoQ10;大肠杆菌中以CoQ8为主;酵母系统中，从CoQ6到CoQ10均有合成[1]。

辅酶Q存在于各种生物膜中，包括线粒体膜、高尔基体膜、过氧化酶体膜及细胞膜中[2]。

CoQ具有重要的生理功能和应用价值。

CoQ是生物呼吸粒上电子传递的一环，同时还是生物膜的抗氧化屏障[3]，并参与蛋白二硫键的形成[4]及作为酶的辅酶[5]。

红细菌发酵辅酶Q10的研究

红细菌发酵辅酶Q10的研究

Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｃｏｅｎｚｙｍｅ ＱＩ Ｏ ｉｓ ａｌｌ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｑｕｉｎｉｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｒｇａｎｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｌｏｃａｔｅｄ
ｃｙｔｏｄ咖ｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ
ｂ，ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＣｏＱ ｈｏｍｏｌｏｇｓ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ＣｏＱ １ ０ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ， ｗｈｉｃｈ ｌａｙｓ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：
论文作者签名：
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年月 日
学位论文使用授权说明
本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关部门或机
构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影 印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文：在不以赢利为目的的前提下，学 校可以公开学位论文的部分或全部内容。（保密论文在解密后遵守此规定）
作者签名： 指导教师ห้องสมุดไป่ตู้名：
日期： 日期：

辅酶Q_10_的生物合成途径及发酵工艺优化

辅酶Q_10_的生物合成途径及发酵工艺优化
辅酶 Q10是一种醌类化合物 。其结构式如图 1 。从其结 构可看出 ,它是以 2 ,32二甲氧基252甲基苯醌为核心 ,连接有 1 条聚222甲基丁烯 (2) 基侧链[5] 。
醌核的前体对羟基苯甲酸在细菌和高等真核生物中分
收稿日期 : 2005209216 ; 修回日期 : 2005212205 作者简介 : 王普 (19652) ,女 ,河北石家庄人 ,博士 ,教授 ,主要从 事生物转化及微生物制药研究 ,E2mail :wangpu @zjut . edu. cn 。
180
中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2006 年第 27 卷第 3 期
图 4 细菌体内侧链前体合成途径[11] Fig4 Pathway for biosynthesis of the polyprenyl tail precursors in bacteria
图 5 E. coli 和 S . cerevisiae 体内辅酶 Q10侧链的合成途径[7] Fig 5 Pathway for the biosynthesis of polyprenyl diphosphate in E. coli and S . cerevisiae 2 辅酶 Q10发酵工艺优化 2. 1 生产菌株
摘 要 :辅酶 Q10作为生物体有氧呼吸链中不可缺少的电子递氢体 ,广泛应用于生物医药 、化妆品和保健品等 领域 。微生物发酵法生产辅酶 Q10具有产物活性高 、原料成本低等优点 。此文对辅酶 Q10的生物合成途径和发酵工 艺优化进行了综述 。
关键词 : 辅酶Q10 ; 生物合成 ; 发酵 ; 优化 中图分类号 :Q552 文献标识码 :A 文章编号 :100521678 (2006) 0320178204

类球红细菌产辅酶Q10发酵工艺的优化

类球红细菌产辅酶Q10发酵工艺的优化

类球红细菌产辅酶Q10发酵工艺的优化杨威;柯崇榕;邵庆伟;朱勇峰;黄建忠【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2013(039)002【摘要】类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是一类高产辅酶Q10的光合细菌,该研究对R.sphaeroides EIM-8产辅酶Q1o的发酵条件和培养基进行了优化.采用单因素结合响应面设计优化后的培养基组成为:葡萄糖27.8 g/L、(NH4)2SO44.9 g/L、谷氨酸4.7 g/L、玉米浆粉2.5 g/L、MgSO49.5 g/L、FeSO41.5 g/L,NaC1 3.5 g/L,KH2PO44.0 g/L、辅液15.0 mL/L;通过单因素试验方法确定的培养条件为:pH 6.5、温度32℃、接种量10％、装液量40mL/250 mL,此条件下辅酶Q1o产量可达128.9 mg/L,比优化前提高了89.0％.【总页数】5页(P75-79)【作者】杨威;柯崇榕;邵庆伟;朱勇峰;黄建忠【作者单位】福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心生命科学学院福建省现代发酵技术工程研究中心,福建福州,350108【正文语种】中文【相关文献】1.高产辅酶Q10类球红细菌的化学诱变筛选及其发酵培养基优化 [J], 扶教龙;钱大伟;吴晨奇;徐敏强;胡翠英;李良智2.类球红细菌辅酶Q10发酵培养基的优化 [J], 周勇;郑毅3.响应面法优化类球红细菌中辅酶Q10超声提取工艺 [J], 林勤;徐文雅;董斌;陈艳芬;赵越4.酶法辅助超声波法提取类球红细菌辅酶Q10条件优化 [J], 李祖明;常平;高丽萍;惠伯棣;白志辉5.类球红细菌辅酶Q10高产菌株选育及发酵工艺研究 [J], 丁亚莲; 李春玲; 牛春; 张萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

高产辅酶Q10类球红细菌的选育及发酵优化

高产辅酶Q10类球红细菌的选育及发酵优化

高产辅酶Q10类球红细菌的选育及发酵优化李文鑫;曾伟主;周景文【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2022(48)23【摘要】辅酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)是一种淡黄色的脂溶性醌类,常见于动植物和微生物的细胞内膜中,是天然的抗氧化剂和细胞代谢激活剂。

该研究以1株具有CoQ10生产能力的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)为出发菌株,其在摇瓶水平上初始CoQ10产量为136.47 mg/L,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变和多孔板高通量筛选相结合的方法,确定了ARTP诱变处理的时间为120 s,致死率为90%。

在孔板初筛阶段,从5184株菌的突变菌库采用高通量筛选方法获得8株高产菌株,经过复筛得到1株CoQ10的高产突变菌株7p22,其摇瓶水平CoQ10产量达到158.44 mg/L,相比出发菌株提高了16.1%。

验证其遗传稳定性后,进一步优化了碳源、前体物质、金属离子等,提高了辅酶Q10的产量。

最后,在5 L发酵罐上对突变菌株进行培养条件的优化,CoQ10产量提高至1640.6 mg/L。

该研究所使用的结合筛选因子和Craven test检测法的高通量筛选方法可以实现简单、高效地获得高产CoQ10突变菌株。

【总页数】9页(P34-41)【作者】李文鑫;曾伟主;周景文【作者单位】江南大学生物工程学院;粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学);江南大学未来食品科学中心【正文语种】中文【中图分类】TQ9【相关文献】1.类球红细菌产辅酶Q10发酵工艺的优化2.高产辅酶Q10类球红细菌的化学诱变筛选及其发酵培养基优化3.类球红细菌辅酶Q10发酵培养基的优化4.类球红细菌辅酶Q10高产菌株选育及发酵工艺研究5.56Fe17+重离子诱变选育高产辅酶Q10类球红细菌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

诱变育种推理选育类球红细菌CoQ10高产菌株正突变库的研究

诱变育种推理选育类球红细菌CoQ10高产菌株正突变库的研究




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图 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 紫外照射时间对致死率的影响
2.1.2 NTG诱变最适剂量 分别改变NTG工作浓度0，
0.2，0.4，0.5，0.8mg/L，获得NTG诱变致死曲线，结果见图
2。当NTG浓度为0.6mg/mL时，致死率已达99%，由于是初
2.2.1 抗性因子胁迫浓度 初始抗性因子筛选浓度太低 起不到胁迫作用，太高起不到筛选作用，通过改变平板培
养基中抗性因子浓度，使出发菌株在平板上无法生长的
临界浓度，作为抗性因子胁迫浓度。改变平板培养基罗 红霉素、卡那霉素、PHB及叠氮钠浓度，获得抑制菌体生 长的临界浓度，结果如表1，获得4种抗性因子筛选胁迫浓 度。
106个/mL），经一定工作浓度NTG振荡处理18min后，稀释 涂布，32℃培养7d后，挑选突变菌落，进一步定向初筛、复 筛，构建NTG诱变正突变库。 1.2.4 抗性因子快速推理选育CoQ10正突变株 将紫外和 NTG诱变获得突变菌落，通过罗红霉素、对羟基苯甲酸 （PHB）、叠氮钠和卡那霉素4种抗性因子胁迫选择，实现 定向快速筛选CoQ10高产菌株。
19






/5( NHN-
图 2 NTG 浓度对致死率的影响
2.2 抗性因子推理选育CoQ10正突变株 根据CoQ10的生 理功能，利用抗性因子筛选作用，实现定向推理选育高产 菌株。CoQ10具有清除自由基的作用，而罗红霉素易与氧分 子结合发生电荷转移形成超氧阴离子，CoQ10还原性能够有 效抑制卡那霉素的氧化作用，有效解毒叠氮钠对呼吸链的
霉素及卡那霉素等抗性筛选因子，实现快速推理选育辅酶 Q10高产菌株，成功构建了 2 个正突变库，并从库中

一株产CoQ_(10)的类球红细菌分离鉴定及诱变选育

一株产CoQ_(10)的类球红细菌分离鉴定及诱变选育

一株产CoQ io的类球红细菌分离鉴定及诱变选育姚丽莉12,许齐纯2,刘晓萌$,李鸿鑫1,高鑫誉！，徐梧皓！，吕常江*2'4，曹宏伟1(1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆163000；2.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江杭州310023；3.南京市产品质量监督检验院，江苏南京210029；4.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122)摘要：辅酶Q10(C o Q m)是天然存在的抗氧化剂和细胞代谢激活剂，具有消除自由基、维持细胞膜通透性、提高机体免疫功能等多种生理作用％选育C o Q m高产菌株并通过发酵法实现该功能化合物的高效合成具有重要价值％作者从污水处理厂的淤泥中分离纯化获得了一株C o Q m高产菌株YLL-13,通过形态观察、生化特性分析及16S rDNA序列比对,细菌(Rhodobacter sphaeroides),命名为R.sphaeroides YLL-13。

随后，以R.sphaeroides YLL-13为出发菌株，以维生素K3和4-疑基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid,pHBA)为复合筛选标记，通过亚硝基孤化学诱变，筛选高产突变菌株，并了其生产C o Q10特性。

结果显示，选育获取了一株遗传稳定的C o Q10高产突变株R.sphaeroides YLL-13-T,其具有相对低类胡萝卜素合成、高生长速率和高C o Q10积累特性％在的发酵体系中，发酵120h后突变菌株YLL-13-T的生物量、C o Q10产和CoQ m产率达到83.5$1.04g/L和12.46mg/g，比出发菌株分别提高了12.3%、42.5%和23.6%,展现出良好的工业化应用前景％关键词：类球红细菌；亚硝基孤;化学诱变；辅酶Q10；类胡萝卜素中图分类号:Q815文章编号：1673-1689(2021)02-0032-09D01:10.3969/j.issn.1673-1689.2021.02.005Isolation,Identification and Mutation of a Rhodobacter sphaeroideswith High Yield of Coenzyme Q i0YAO Lili1"2,XU Qichun2,LIU Xiaomeng3,LI Hongxin1,GA0Xinyu1,XU Wuhao1,LYU Changjiang'1,4,CAO Hongwei1(1.College of Life Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing163000,China;2. School of Biological and Chemical Engineering,Zhejiang University of Science and Technology,Hangzhou 310023,China; 3.Nanjing Product Quality Supervision and Inspection Institute,Nanjing210029,China; 4. School of Bioengineering,Jiangnan University,Wuxi214122,China)收稿日期：2020-07-07基金项目：国家自然科学基金项目(31670804,31971372)；江苏省博士后基金资助项目(2020Z074)；浙江省自然科学基金青年基金项目(LQ18B060002)。

辅酶Q10发酵废水循环利用研究

辅酶Q10发酵废水循环利用研究

辅酶Q10发酵废水循环利用研究
王锡洪;吕锡霞;顾旭明;孙新强
【期刊名称】《绍兴文理学院学报》
【年(卷),期】2012(000)008
【摘要】对辅酶Q10发酵废水膜浓缩工艺进行了研究，确定最佳浓缩工艺为：首先在发酵废水中添加质量浓度为0．5g／L的聚丙烯酰胺；然后进行孔径为10um 的PE微滤；调节pH值为6．5～7．0，再采用200Da纳滤膜连续浓缩，最经济的浓缩倍数为4．可以截留80％以上功能性成分，去除60％以上有害离子，浓缩液可满足后续肥料生产或进一步浓缩干燥的需要．
【总页数】5页(P48-51,61)
【作者】王锡洪;吕锡霞;顾旭明;孙新强
【作者单位】浙江医药股份有限公司新昌制药厂,浙江新昌312500;浙江医药股份有限公司新昌制药厂,浙江新昌312500;浙江医药股份有限公司新昌制药厂,浙江新昌312500;浙江医药股份有限公司新昌制药厂,浙江新昌312500
【正文语种】中文
【中图分类】X703.1
【相关文献】
1.产辅酶Q10根瘤土壤杆菌的紫外诱变选育及其发酵培养基优化 [J], 施磊;扶教龙;吴晨奇;钱大伟;徐敏强;鞠鑫;李良智
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坚
3.高产辅酶Q10类球红细菌的化学诱变筛选及其发酵培养基优化 [J], 扶教龙;钱大伟;吴晨奇;徐敏强;胡翠英;李良智
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FU Jiaolong, QIAN Dawei*, WU Chenqi, XU Minqiang, HU Cuiying, LI Liangzhi
(School of Chemical and Biological Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China)
中图分类号：TS201.3
文章编号：0254-5071（2016）06-0090-06
doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.019
Screening of high CoQ10-produc mutagenesis and its fermentation medium optimization
类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）：由浙江大学于 洪巍教授赠送。 1.1.2 培养基
种子培养基：葡萄糖3 g/L，酵母提取物8 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO4 1.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，1 mL/L辅液； 用NaOH调pH至7.2。121 ℃灭菌20 min。
2016 Vol.35 No．6
·90· Serial No．292
China Brewing
Research Report
高产辅酶Q10类球红细菌的化学诱变筛选及其发酵培养基优化
扶教龙，钱大伟*，吴晨奇，徐敏强，胡翠英，李良智
（苏州科技大学 化学与生物工程学院，江苏 苏州 215000）
摘 要：利用菌株对（维生素K3+叠氮化钠+对羟基苯甲酸）的复合抗性作为筛选标记，对产辅酶Q10的类球红细菌（Rhodobacter
Abstract: Using multiple resistance of vitamin K3, NaN3 and p-hydroxybenzoie acid (PHBA) as selective marker, CoQ10-producing Rhodobacter sphaeroides was mutated by nitrosoguanidine (NTG), and the high CoQ10-producing strains was screened. The fermentation medium was optimized by response surface methodology. Results showed that a strain R.sp3-7 with genetic stability and high CoQ10-production was obtained by mutation breeding. The optimum component of fermentation medium was glucose 31.7 g/L, corn steep powder 5.6 g/L, (NH4)2SO4 5.3 g/L, sodium glutamate 3.0 g/L, NaCl 3.0 g/L, MgSO4·7H2O 12.5 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, CaCO3 2.0 g/L and auxiliary fluids 1 ml/L. Under the conditions, the yield of CoQ10 produced by mutant strain R.sp3-7 was up to (93.63±0.59) mg/L, which was increased by 116.8% than that produced by original strain. Key words: CoQ10; resistant plate; chemical mutagenesis; response surface methodology; Rhodobacter sphaeroides
（1）菌悬液的制备 取10 mL对 数 生 长 期 的 类 球 红 细 菌 种 子 培 养 液 ， 5 000 r/min离心10 min，弃上清，用无菌生理盐水洗涤两 次，重新悬浮10 mL生理盐水中，即得菌悬液。 （2）抗性浓度确定 将稀释后菌悬液分别涂布在含有不同质量浓度叠氮 化钠（NaN3）、对羟基苯甲酸（PHBA）、维生素K（3 VK3）和空 白的平板培养基中，32 ℃条件下，培养5 d，观察菌落生 长情况。 （3）化学诱变方法 取1 mL质量浓度为5 mg/mL的亚硝基胍母液加入 9 mL菌悬液中，调节终质量浓度为0.5 mg/mL，30 ℃恒温水 浴振荡处理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 后，离心终止反应，稀释涂布到平板培养基中，后置于32 ℃ 避光培养5 d培养，计算活菌数，绘制致死率曲线。致死率 计算公式如下：
收稿日期：2016-03-27 基金项目：苏州市科技计划项目（sYN201317）；苏州科技学院科研基金项目（XKZ201411） 作者简介：扶教龙（1969-），男，副教授，博士，研究方向为生物化工、发酵工程。 *通讯作者：钱大伟（1991-），男，硕士研究生，研究方向为生物化工、微生物育种。
研究报告
LC-20AT高效液相色谱：日本岛津企业管理（中国）有 限公司；UNE500灭菌烘箱：德国MEMMERT公司；SW-CJ2FD超净台：苏州净化设备有限公司；TS-2102型摇床：上 海天呈科技有限公司；GHP隔水式恒温培养箱：上海精宏 实验设备有限公司。 1.3 实验方法 1.3.1 菌种活化和种子培养液的制备
发酵培养基：葡萄糖40 g/L，玉米浆干粉3 g/L，谷氨酸钠 3 g/L，NaCl 3 g/L，硫酸铵3 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO·4 7H2O 12.5 g/L，CaCO3 2 g/L，1 mL/L辅液；用NaOH调pH至7.2。 121 ℃灭菌20 min。
辅液：盐酸硫胺1 g/L，生物素0.015 g/L，烟酸1 g/L 。 [11] 1.1.3 化学试剂
提高菌株生产CoQ10的能力，以实现CoQ10的工业化生产[5]。 由于CoQ10的生物合成途径比较复杂，涉及到超过20
种中间产物和调控相关反应的酶类。目前通过基因工程 方法通过改变某一或某几个关键酶基因的表达来提高发 酵菌株中CoQ10的含量并实现工业化生产仍存在一定困 难，传统的物理化学诱变育种手段仍是获得CoQ10高产菌 株的有效方法。郑君等[6]以球形红假单胞菌（Rhodopseudomlonas sphaeroides）1.1737T为出发菌株，经紫外线和亚 硝基胍诱变，并结合罗红霉素和对羟基苯甲酸抗性突变 株筛选，获得了一株CoQ10产量为50.6 mg/L的高产突变株 PHBR-2，较出发菌株产量提高了90.9%。YOSHIDA H等[7] 对 类 球 红 细 菌（Rhodobacter sphaeroides）KY-4113 进 行 NTG诱变筛选耐L-乙硫氨基酪酸的突变株，获得的一株绿 色突变株，该株菌可能丧失合成红色类胡萝卜素的能力而
辅酶Q1（0 coenzyme Q10，CoQ10）广泛存在于高等动物 线粒体内膜中的一种内源性物质，是呼吸链的重要递氢体， 是生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的必需成 分[1]。它具有抗氧化性、清除自由基、提高机体免疫力等功 效，可预防和治疗多种疾病，在治疗心脏衰竭 、延缓皮 肤 衰老等方面具有较广泛的应用[2-4]。因此，经济生产CoQ10 的途径也变得尤为重要。目前，CoQ10的主要生产方法有： 动植物提取法、植物细胞培养法、化学合成法和微生物发 酵法。相比其他三种方法，微生物发酵法生产CoQ10具有分 离过程相对简单、产品活性好、可规模放大生产能力等优 点，成为最有发展潜力的CoQ10生产方法。要实现发酵法 工业化生产CoQ10首先要解决的问题是获得一株高产菌 株。但是自然筛选获得的菌株产量都很低，需要通过诱变 育种、构建工程菌、优化发酵工艺等策略，来最大限度地
采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）法进行CoQ10含量的测定。HPLC色谱条件： Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为 甲醇∶异丙醇=3∶1（V/V）；柱温40 ℃；检测波长 275 nm；流 速 1 mL/min；进样量 20 μL。
将甘油管保存的菌种稀释涂布到基础平板培养基 上，32 ℃条件下静置培养7 d；待菌落生长成熟后，挑起平 板上单个菌落接入种子培养基，于32 ℃条件下200 r/min振 荡培养24 h。装液量均为50 mL/250 mL。
1.3.2 发酵培养 取种子培养液以8%（V/V）接种量接入发酵培养基，
于32 ℃条件下200 r/min振荡培养72 h。 1.3.3 CoQ10的超声辅助酸热破壁提取
取发酵液1 mL，加入200 μL 0.02 mol/L HCl，70 ℃、 500 W超声水浴处理15 min。5 000 r/min离心10 min，弃尽 上清。加入5 mL提取液（乙酸乙酯∶乙醇=5∶3，V/V），混匀后 置 于 超 声 波 清 洗 仪 中 超 声 提 取 10 min ， 暗 室 中 抽 提 15 min，每隔5 min摇匀一次。将抽提液10 000 r/min离心 10 min，得CoQ10提取液[12]。 1.3.4 CoQ10含量的测定
中国酿造
2016 年 第 35 卷 第 6 期
总第 292 期
·91·
表达细菌叶绿素，故在肉汤琼脂培养基上呈绿色菌落，该 菌株CoQ10含量比野生株提高20%。
本研究采用超声辅助酸热法对类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）进行CoQ10破壁提取，可实现批量提取 菌体中CoQ10。使用紫外-氯化锂（LiCl）、亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）最佳诱变剂量诱变处理，筛选耐维生素K3 （vitamin K3，VK3）、叠氮化钠（NaN3）、对羟基苯甲酸（para hydroxy benzoic acid，PHBA）等前体物质的CoQ10生产菌株。 经过摇瓶发酵初筛、复筛获得CoQ10高产菌株，并使用单因 素与响应面法结合进一步对其发酵培养基组分进行优化 [8-10]，以进一步提高CoQ10产量，为CoQ10在国内的工业化生 产奠定一定的科学基础。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 菌种