第八章 C1063 Annexin V FITC细胞凋亡检测试剂盒

Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit一、试剂盒说明在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS ）由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca 2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V 进行荧光素FITC 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI ）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。

二、试剂盒组份 组份(20 assays) (50 assays) (100 assays) 储存条件 AnnexinV-FITC100 μL 250μL 500 μL Propidium Iodide100 μL 250μL 500 μL Binding Buffer 10.0 mL 25 mL 50 mL 注：1、Annexin V-FITC 组份建议按需分装小份冻存于-20℃，避免反复冻融； 2、Propidium Iodide 和Binding Buffer 组份不用时可放置于4℃保存，Propidium Iodide 需要避光。

3、Store at -20℃ for 12 months三、试剂盒以外自备仪器和试剂流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器 1.5m L Microtube 、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS 、不含EDTA 的胰酶消化液四、使用注意事项1.微量试剂取用前请离心集液。

Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。

Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。

以标记了FITC的Annexin Ⅴ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

将Annexin Ⅴ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。

产品组成（50／25次反应）：· Annexin V-FITC 500ul／250ul（20ug /ml）· Binding Buffer 40ml／20 ml· Propidium Iodide (PI) 250ul／125ul（50ug /ml）保存条件: 2-8℃储存，有效期一年。

注意事项：1.为保证得到理想的实验结果，在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项；2.试剂（尤其是小瓶装的试剂）在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落；3.Propidium iodide（PI）能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用；4.此试剂盒仅供科研使用，不宜用于临床诊断；5.本试剂盒中提供的PBS为随试剂赠送，并非试剂盒的真正组成成分；细胞的洗涤同常规方法。

操作注意要点：1.整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作；2.反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变；3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光；4.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的；5.在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果；6.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。

请在使用前仔细阅读说明书Annexin V,FITC 凋亡检测试剂盒(100次)产品名称货号规格储存条件运输条件Annexin V,FITC结合物AD01-10 100次×1 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温PI Solution AD02-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温10×Annexin V Binding Buffer AD03-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温*注：规格中的每“次”是以细胞浓度1×106 cells/ml计算产品描述细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。

例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。

然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。

细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。

目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、磷脂酰丝氨酸的外翻等。

Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。

在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V 是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

用绿色荧光FITC标记的Annexin V 通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。

所需的设备和材料-合适量程的移液枪-样品和诱导剂-细胞培养用6，12，24，96孔板-PBS、去离子水-流式细胞仪或荧光显微镜。

细胞凋亡实验详细步骤及说明实验概述本实验旨在研究细胞凋亡的过程和机制。

细胞凋亡是一种正常的细胞死亡方式，对于维持组织的稳态具有重要作用。

通过本实验，我们可以了解细胞凋亡的特征和调控通路，以及一些常用的检测方法。

实验材料- 培养皿- 细胞培养基- 不同处理条件下的细胞（例如药物处理、基因敲除等）- Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒- 显微镜实验步骤1. 培养细胞：将细胞按照常规方法培养至适当的细胞数目。

2. 细胞处理：根据实验设计，在细胞培养基中添加不同处理条件下所需的药物。

3. 收集细胞：根据实验设计决定收集细胞的时间点，使用适当的方法将细胞收集到离心管中。

4. 染色试剂处理：根据实验需求，使用 Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒中的染色试剂进行细胞染色，按照试剂盒说明书的操作步骤进行。

5. 检测细胞凋亡：将染色后的细胞标本放置在显微镜下观察，并使用适当的过滤器和荧光镜头进行观察。

6. 数据分析：根据观察结果，统计和分析不同处理条件下细胞凋亡的数量和特征。

实验注意事项- 操作过程中应严格遵守实验室安全规范，确保个人和实验室安全。

- 细胞培养过程中，注意细胞接种密度和培养基条件的控制，以维持细胞的正常生长状态。

- 在染色试剂处理过程中，按照试剂盒说明书的要求进行操作，避免试剂污染和误操作。

- 在显微镜观察过程中，注意调整适当的放大倍数和聚焦，以获得清晰的细胞图像。

实验结果与讨论根据实验结果可以获得不同处理条件下细胞凋亡数量和特征的数据。

结合相关文献和已有知识，可以对细胞凋亡的机制和调控通路进行深入的讨论。

实验结果可以为进一步研究细胞凋亡的相关领域提供有价值的数据基础。

以上是细胞凋亡实验的详细步骤及说明。

希望对你的研究有所帮助！。

第1页，共3页ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书注意：本产品试剂浓度发生变化，使用前请仔细阅读说明书。

货号：CA1020规格：20T/50T /100T保存：2-8°C ，避光保存，有效期1年。

产品说明：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS 暴露在细胞膜外表面。

PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS 暴露在细胞膜外。

Annexin V 具有易于结合到磷脂类如PS 的特性，对PS 有高度的亲和性。

因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS 。

PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。

两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。

因此，可以采用Annexin V 与PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。

操作步骤:1.细胞样品的准备：a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。

用不含EDTA 的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。

再次收集到离心管内。

1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。

对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。

加入约1ml 4℃预冷的PBS ，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

b)对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。

对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。

Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒上海优宁维生物科技有限公司一、概述在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。

AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。

图Annexin V 检测细胞凋亡原理三、实验步骤贴壁细胞需用0.25%的胰酶消化。

注意过度消化可损伤细胞。

在消化时可加2％的BSA 可防止消化过度。

如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须彻底清除EDTA：在标记前用1×PBS或1×bindingbuffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2＋螯合，影响Annexin V的结合。

（1）用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer；（2）细胞收集。

悬浮细胞收集：离心5分钟；贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合），于室温2000rpm离心5～10分钟，收集细胞；（3）细胞洗涤：用预冷1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞；（4）加入300μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞；（5）Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；（6）PI标记：上机前5分钟再加入5μL的PI染色。

AnnexinV-FITCPI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作说明细胞凋亡是细胞的基本特征之一,它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。

在细胞凋亡过程中,细胞内膜的磷酯酰丝氨酸外翻到细胞外膜,而Annexin V(膜联蛋白V)对其有天然的高亲和能力,故可以用FITC标记(绿色荧光)的Annexin V来检测细胞凋亡,但本方法的缺点是不能区分早期和晚期的凋亡细胞。

早期和晚期的凋亡细胞的一个重要区别在于细胞膜的完整性(凋亡早期细胞没有丧失膜的完整性),故可以用碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)来染色加以区分。

图源：网络Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒特点：1. 即开即用,不需要专门花时间准备各种成分。

2. 整合了Annexin V-FITC和PI检测法的优点,提高了凋亡细胞检测的灵敏度和特异性,本方法是目前极为灵敏的细胞凋亡检测方法。

3. 跟流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测兼容。

Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作步骤：(一)获得目的基因1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

(二)构建重组表达载体1、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

(三) 获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp 或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。

一文掌握AnnexinV-FITCPI细胞凋亡实验方法一、技术原理细胞凋亡（apoptosis）是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制控制，按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。

细胞凋亡受凋亡相关基因调控，故又称为程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。

一般来说，凋亡早期，主要涉及胞内一些蛋白的变化，例如蛋白量的增高、位置的迁移、状态的改变等，还有一些磷脂、Ca2+的变化等；中晚期则伴随着DNA的断裂、凋亡小体的形成；而细胞形态的改变则伴随着整个凋亡过程。

二、产品应用目前可以采用单染色法和双染色法对细胞进行染色，流式细胞仪检测或荧光显微镜观察来检测细胞凋亡，其中Annexin V/PI法是当下较为流行的检测细胞凋亡的方法。

正常细胞中，磷脂酰丝氨（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡细胞中，PS会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。

用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生；碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。

因此将Annexin-V 与PI结合使用，就可以检测出细胞群体中的早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞。

Apoptosis-AnnexinV 检测示意图碘化丙啶PI检测示意图三、使用方法1悬浮细胞，2000rpm离心5min收集细胞;对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短(过长细胞膜破碎，造成假阳性，过短，细胞黏连影响检测)最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶消化液，加入细胞培养液终止消化，，2000rpm离心5min收集细胞；24℃预冷PBS，洗涤细胞2次（2000rpm x 5min）,收集细胞2～5×105 ；3离心弃上清，加入500μL结合缓冲液，轻轻吹打重悬细胞；4加入5μL Annexin V-FITC，轻轻吹打混匀，加入5μL PI 轻轻吹打混匀,室温避光孵育5-15min。