原料奶嗜冷菌快速检测方法研究进展

DEFT 方法的优点在于检测过程的操作时间很短
(＜ 1h)，与传统上工业使用的平板计数法(7～10d)相 比，在时间上有很大优越性。如果在紫外显微镜下使 用图象分析仪对细菌进行计数，一个操作人员可在 1h 内 对 50 个样本玻片进行计数，检测数量大[8]。
DEFT 方法的缺点在于，对于测定样品中含量很少 的细菌，需要预先进行预培养以增加样品中目标微生物 的数量，这样在检测时，结果的精确度才高。而这个 预培养的时间一般是很长的(24～48h 或更长)，而且在实 践中，样品中的细菌量要在 103～105 个 /ml 时才会有很好 的线性关系存在。再者这个方法需要仪器较昂贵。这些 都是这个方法在工业应用上需要解决的问题。 1.2 电阻抗方法(impedimetric determination)
自从发明了聚合酶链式反应扩增技术(PCR 技术)， 科研人员开发了一系列基于 PCR 技术来快速测定食品中 致病微生物的新方法，如检测牡蛎中的弧菌、软质奶 酪中的利斯特菌、原料乳中的梭菌等。这种检测方法 操作简单、具有高灵敏度和高特异性，是快速检测食 品微生物的一个重要方法。
Research Progress on Rapid Methods for Detecting Psychrophilic Bacteria in Raw Milk
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LU Yuan，YIN Yuan-ming，TANG Jia-ni，LIU Dong-hong，YE Xing-qian* (School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)
enzymes are still active and continue to decompose the fat and protein in raw milk so that the quality of dairy products decreases.
Therefore, recently more and more researchers focus the attention on the rapid and exact detection of psychrophilic bacteria in
中图分类号：TS252.1
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2009)03-0274-07
食品的安全性是当今国际社会的热点话题。这不仅 是消费者关心的问题，同时也是生产者、销售者、消 费者和政府职能部门关心的问题，吸引了众多科学家的 注意[1]。原料奶营养丰富，是人类理想的营养食品，但 同时也是微生物的良好培养基，属高危险性的食品原 料。在众多微生物污染中，嗜冷菌污染是影响原料奶 保质期的主要因素。嗜冷菌在原料奶低温冷藏时会大量 繁殖，虽然这些菌经过巴氏杀菌和 UHT 灭菌阶段可以 被完全杀死，但它们中的某些菌属如假单胞菌属可产生 极其耐热的蛋白酶和脂肪酶。这些酶即使在经过高温处 理后，仍会有少量的残留。这些残留的耐热酶在奶制 品储藏的过程中被激活，继续分解奶制品中的脂肪和蛋 白质，从而导致产品品质发生变化，出现苦味、腐败 味、脂肪氧化味或形成胶凝，严重影响乳品品质和乳 品工业的发展[2-3]。
1 检测方法
国外对嗜冷菌检测的标准方法很多，这些方法也 在不断地改进，检测的时间也不断地缩短。以国际乳 品联合会的检测标准(IDF 标准)为例，IDF Standard 101A 中嗜冷菌数的检测方法为：在 6.5℃条件下培养 10d，计数[5]；IDF Standard 132A 中嗜冷菌数的检测方 法为：在 21℃条件下培养 25h，计数[6]。这些标准方 法的检测时间很长，达不到工厂快速检测的要求。由 此，在二十世纪八、九十年代，国外研究者就不断地 对嗜冷菌的检测方法进行研究和改进，以期得到一个即 快速又准确，而且适合工业化应用的检测方法。虽然 一些方法现在还未见在嗜冷菌检测中的报道，但是对于 检测原料奶中其他细菌的报道也可为检测原料奶中的嗜 冷菌提供理论基础。 1.1 直接荧光过滤法( d i r e c t e p i f l u o r e s c e n t f i l t e r technique，DEFT)
电阻抗方法是通过测量微生物代谢引起的培养基电 特性变化来测定样品微生物含量的一种快速检测方法。 微生物在培养过程中，生理代谢作用使培养基中的电惰 性物质激活。随着微生物增长，培养基中电活性分子 和离子逐渐取代了电惰性分子，使导电性增强，电阻 抗降低。研究表明，电导率随时间的变化曲线与微生 物生长曲线非常相似。当微生物的起始数量不同时，出 现指数增长期的时间也不同，通过建立二者之间的关 系，就能通过检测培养基电特性变化推演出微生物的原 始菌量[12]。
这个方法的优点在于检测时间比传统的标准平板计 数法需要的时间要缩短很多，而且这个方法是利用仪器 对样品进行测定，从而大大减少人力的投入。从这一 点来看，电阻抗方法在工业应用上比平板计数法具有优 越性。
这个方法的缺点在于，对于现代工业有大量待测原 料奶样品的现状来说，10～21h 的检测时间还是很长， 限制了电阻抗法在工业上的推广利用。 1.3 PCR-ELISA 法
※专题论述
食品科学
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料奶受微生物污染问题日益突显出来，成为限制乳品工 业发展的主要原因。越来越多的原料奶被冷藏保存，嗜 冷菌在低温下对原料奶的破坏作用也就成为一项影响奶 品质的重要因素。由于我国对这一方面的研究开始的较 晚，现在尚处于探索阶段，所以国内对于原料奶中嗜 冷菌的研究和检测方法方面的报道还比较少。
Fontana 等使用电阻抗的方法检测了原料奶中的梭 菌孢子。从结果显示，常规检测方法 M P N 法与电阻抗
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食品科学
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法测得的孢子数量之间存在的相关度很高(r =0.9796)，而且 电阻抗法极大的缩短了检测的时间(＜ 48h) 。 [18]
在 20 世纪 80 年代，电阻抗方法就已经被欧美国家 用于牛奶、乳制品、肉和其他食品中细菌的检测中。 起初 Cady、O'Connor、Gnan 等分别使用电阻抗的方法 测定原料奶中嗜冷菌的数量和细菌总数，但是测得的结 果与标准平板计数方法之间的相关度都很低[13-15]。Gnan 认为，这种相关性低的原因可能是培养基或是温度没有 选择好[15]。Firstenberg 等通过对培养基和培养温度的控 制，优化了微生物的生长条件，在测定原料奶中细菌 总数、嗜温菌数量和嗜冷菌数量时，得到了电阻抗测 定结果和标准平板计数结果之间很高的相关系数(r= － 0. 96)，使电阻抗方法在原料奶检测方面的应用步伐向前推 进了一大步。在 Firstenberg 的实验中，样品中嗜冷菌 的数量达到 1 × 105CFU/ml 以上时，测定时间为 21h，而 以往的平板计数法则需要 10d 的时间[16]。
由于经济发展条件的制约，我国乳品产业发展起步 较晚。改革开放以后，随着居民生活水平的提高，人 们营养保健意识增强，国内牛奶消耗量大幅上升，原
收稿日期：2008-01-12 基金项目：国家科技攻关计划重大专题项目(2006BAD04A08) 作者简介：吕元( 1 9 8 5 - ) ，女，硕士研究生，研究方向为食品安全。E - m a i l ：9 6 3 3 1 9 8 @ 1 6 3 . c o m * 通讯作者：叶兴乾(1962-)，男，教授，博士，研究方向为乳品快捷分析、加工与质量控制。E-mail：psu@
DEFT 方法是对样品中的活细胞进行计数的一种检测 方法。将样品过滤，样品中的微生物就被留在过滤器 里。用吖啶橙着染后置于紫外显微镜下进行观察。“存 活”的细胞被染成橘红色，橘黄色或橘灰色，而“死 亡”的细胞则被染成绿色的荧光。最后通过仪器对玻 片上的细菌进行计数[7]。
这个方法在对原料奶和其他食品中细菌的计数上得 到了很好的应用[8]。Neaves 等用此方法检测八个奶制品 实验室里保存的原料奶的卫生学质量，并将计数结果与 菌落培养计数法得出的结果进行对比。结果表明，菌 落培养计数的结果和 DEFT 方法测定的结果之间存在很好 的线性关系(r=0.87)，这说明 DEFT 可以提供与那些菌落 计数法相似的结果[9]。Couto 等用这种方法快速检测葡 萄酒中的乳酸菌并对其数量进行估计。结果表明，当 样品中乳酸菌的数量在 5 × 102～4 × 109 之间时，DEFT 方法计数结果和平板计数结果之间存在很高的相关系数 (r=0.92)。Couto 认为出于实践考虑，在葡萄酒制作过程 中的质量控制环节，DEFT 方法作为一种快速的检测方 法相对于传统培养计数检测方法，有较好的改进[10]。 Tortorello 等还将 DEFT 方法和荧光抗体结合用于测定牛 奶和果汁中大肠杆菌 O157:H7 的数量[11]。
Abstract ：Being the preponderant microorganism in refrigerated raw milk, psychrophilic bacteria increase very swiftly and
produce some cellular enzymes with high thermal stability such as lipases and proteases. After treated at high temperature, these
raw milk. This paper discussed many detection methods and compared their advantages and disadvantages.
Key words：psychrophilic；raw milk；rapid detection method
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食品科学
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