荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青-PPT文档资料

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荧光分析法ppt2

任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激发光谱和荧光光谱。 ⒈荧光激发光谱激发光谱是通过固定发射波长，扫描激发波长而获得的荧光强度(F)—激发波长(λex)的关系曲线。激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，不同激发波长激发的荧光的相对效率。激发光谱可以用于荧光物质的鉴别，并作为进行荧光测定时供选择恰当的激发波长。
(4)磷光发射激发态分子经过系间跨越到达激发三重态后，并迅速的以振动弛豫到达第一激发三重态 (T1)的最低振动能级上，第一激发三重态分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光。磷光发射是不同多重态之间的跃迁(T1→ S0) 属于“禁阻”跃迁，因此磷光的寿命比荧光要长的多，约为10-3s～10s。所以，将激发光从磷光样品移走后，还常可观察到发光现象，而荧光发射却观察不到该现象。
五颜六色的荧光棒
荧光增白剂
荧光增白剂是一种荧光染料，或称为白色染料，也是一种复杂的有机化合物。它的特性是能激发入射光线产生荧光，使所染物质获得类似荧石的闪闪发光的效应，使肉眼看到的物质很白，达到增白的效果。
荧光笔

荧光笔有荧光剂，它遇到紫外线（太阳光、日光灯、水银灯比较多）时会产生荧光效应，发出白光，从而使颜色看起来有刺眼的荧光感觉。
分子吸收和发射过程的Jablonski能级能级图
S2 3 2 1 0 2 1 T 0 2 4 3 2 1 T1 0
S1
3 2 1 0
3 2
S0
1 0
λ1 吸收
λ2 吸收
λ3 荧光
λ 磷光
(2)荧光发射
当分子处于第一激发单重态S1的最低振动能级时，分子可能通过发射光子跃迁回到基态S0的各振动能级上，这个过程称为荧光发射。荧光发射过程约为10-8s. (3)外部能量转换激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或 “熄灭”。

第3章荧光分析法ppt课件

3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N
CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有
荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有强
⑶ 取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而吸电子取代基则使荧光强度降低。
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 长共轭结构示例比较：λex (nm)/ λem (nm)/ f
苯 205/278/0.11
萘 286/321/0.29
蒽 356/404/0.36
2. 荧光和磷光的产生
➢ 辐射跃迁－发光失活荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>
2. 荧光和磷光的产生
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素
➢ 例如：硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和
散射光谱
H
O H3C
H HO
N H
CH CH2
1/2H2SO4 H2O
N
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素

荧光分析法课件

注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。
荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发光波长为最大激发波长，而让荧光物质发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。
荧光分析法
荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从第一激发单重态的最低振动能级返回基态时发射出的光。荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。优点：灵敏度高；选择性好；试样量少；方法简单。
缺点：应用范围小。
第一节荧光分析法的基本原理
一、分子荧光（一）分子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程
磷光发射：激发分子由第一激发三重态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。
内转换
振动弛豫内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2
l 2
外转换
l3
T1 T2
发射磷振动弛豫光
水乙醇环己烷 CCl4 CHCl3
激发光(nm)
248 313 365 405 436
271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 — 320 375 418 450 — 346 410 461 502
第二节荧光定量分析方法

第十三章-荧光分析法PPT课件

内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度溶剂酸度散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团－NH2、－OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs

《荧光分析法》课件

通过改进技术手段，实现多组分的同步检测，提高检测效率。
微型化与便携化
智能化与自动化
随着技术的进步，荧光分析仪器将更加微型化和便携化，方便现场快速检测。
结合人工智能和自动化技术，实现荧光分析的智能化和自动化，减少人为误差和操作复杂度。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
成和含量。
荧光分析法的应用领域
环境监测
荧光分析法可以用于检测水体、土壤和空气中的污染物，如
重金属、有机物和农药等。
生物医学研究
荧光分析法可以用于检测生物体内的标记物、蛋白质、核酸和细胞等，有助于生物医学研究和诊断。
食品安全检测
荧光分析法可以用于检测食品中的添加剂、农药残留和有害物质等，保障食品安全。
高特异性
荧光分析法可以针对特定的化学物质或生物分子，提供高度特异性的检测，降低误报率。
可视化结果
荧光分析法的结果可以通过肉眼直接观察或使用荧光显微镜进行观察，方便快捷。
应用广泛
荧光分析法可以应用于多种领域，如生物医学、环境监测、食品安全等。
荧光分析法的缺点
01
02
03
04
样品处理复杂
荧光分析法通常需要对待测样品进行预处理，如提取、纯化
荧光寿命的测量
通过测量荧光物质在激发光停止后荧光强度随时间的变化，可以了解荧光物质从激发态回到基态的速率常数和荧光寿命。
时间分辨荧光光谱的测量
通过测量不同时间点的荧光光谱，可以了解荧光物质在激发态的动态过程和能量转移过程。
荧光量子产率的实验技术
荧光量子产率的测量
通过测量荧光物质在特定波长激发下的荧光发射光子数和激发光子数，可以计算出荧光量子产率，了解荧光物质的光致发光效率。

荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青

31
尿液中维生素B2的测定
维生素B2（核黄素）在430 - 440 nm 蓝光照射下会发出绿色荧光，λ em为535 nm。它在pH 6-7 的溶液中荧光强度最大，而在pH 11时荧光消失；
但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在酸性KMnO4 氧化下都会生成荧光强度比维生素B2强得多的黄光素，并可溶于氯仿。利用此性质可提高测定的灵敏度和选择性。
* 基态→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；
* 激发态→基态：弛豫过程，多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
Instrumental Analysis
5
2.电子激发态的多重度
* 大多数有机分子的基态处于单重态； * 电子激发态有单重态与三重态之分（取决于电子的自旋方向
移能量的非辐射跃迁；
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。
Instrumental Analysis
9
辐射能量传递过程
荧光发射：第一激发单重态的最低振动能级→基态
（ S1→ S0跃迁） 10-7～10 -9s
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态
Instrumental Analysis
2
第一节
分子荧光原理
Principle of Fluorescence
一、分子荧光的产生过程二、荧光的产生与分子结构的关系三、影响荧光强度的因素
Instrumental Analysis
第二节分子荧光分析法
Fluorescence Analysis
两个单色器分别是： 1）选择激发光波长的第一单色器 2）选择发射光(测量)波长的第二单色器

荧光分析法.ppt

或
续前
返回2 返回
11.2.2
激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
&激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex &荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
激发光谱：（与吸收光谱类似）表示不同激发波长的辐射引起
激发光谱激发光谱
荧光光谱荧光光谱
返回
续前
5、磷光（phosporescence）
过程：电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的任一振动能级而发射的光量子为磷光特点：发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。分子在三重态的最低振动能级上可以存活一段时间，发射时间约
为10-4～10 s。
特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时
间约10-12秒。
或
返回
续前
2、内部能量转换（internal conversion)
过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠
时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低电子能级，这种过程称为内部能量转换特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有重叠；时间约10-1～10-13秒。
结果：这种跨越会导致荧光强度减弱，甚至熄灭。
续前影响体系间跨越几率增大的因素：
Ø含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。
原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运
动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反
转的发生。 Ø在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体
系间跨越的发生几率。
返回
注：
发射磷光的能量比荧光的能量小

【精品】第五章-荧光分析法.PPT课件

光的量子数之比，常用 Φ表示。
23
24
（重点） 252627 Nhomakorabea28
29
30
三、影响荧光强度的外部因素 1、温度 2、溶剂：极性、粘度 3、酸度：荧光物质自身最适宜的pH范围 4、荧光熄灭剂：主要四种类型 5、散射光：瑞利光、拉曼光
31
五、影响荧光强度的外部因素
1）温度温度降低，荧光效率和荧光强度升高。
39
1、定量依据
荧光强度 If 正比于吸收的光强度 Ia 和荧光
量子产率Φ ：
I f Ia
由朗伯-比耳定律得：
Ia I0 It I0 110bC
荧光强度 If ：
I f I0 110bC I0 1 e2.303bC
40
对于稀溶液，当 2.303bC < 0.05时：
I f 2.303 f I0 bC
2）溶剂随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π* 跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低；溶剂应达到足够的纯度。
32
3）pH值
➢具酸或碱性基团的荧光物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。荧光物质都自身最适宜的pH范围。
NH3+
13
振动弛豫
内转换
内转换
S2
系间窜跃
S1
能
T1 T2
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷
光
光
S0
l3
l1
l2
l 2
振动弛豫
荧光和磷光产生示意图
14
二、激发光谱与荧光光谱
激发光谱（excitation spectrum）：使不同激发波长的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固定发射波长的单色器而照到检测器上，测定不同激发波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光谱。

荧光分析法ppt课件

37
28
续前
给电子基团
3、pH影响对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4、荧光熄灭的影响荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象。引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物。
29
续前
返3回5
小结：掌握
• 基本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨越及磷光；激发光谱与荧光光谱
• 基本理论：溶液荧光光谱的特征；物质发射荧光的条件；荧光定量分析的依据、条件及方法
• 熟悉：影响荧光强度的因素（分子结构和外界条件）
了解
• 荧光分析仪器
36
练习：
P297，思考题 3、5，8
13
续前影响体系间跨越几率增大的因素：
➢含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反转的发生。
➢在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体系间跨越的发生几率。
返回14
续前 4、荧光（fluorescence）
30
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
荧光光谱
瑞利光320nm
散射光谱
拉曼光360nm
瑞利光350nm 拉曼光400nm
返3回1
11.3 荧光定量分析
1、荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。
受激后，可在各个方向发射荧光，在透过光的方向不易测定F。
5、散射光的干扰散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，

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现代表征方法与技术------
荧光分析法
Fluorescence Analysis
Instrumental Analysis
1
参考书《荧光分析法》第三版
许金钩、王尊本主编，科学出版社
《Principles of Fluorescence Spectroscopy》(II、III), J. R. Laowisz, Kluwer Academic/Plenum Publisher
Instrumental Analysis
2
第一节
分子荧光原理
Principle of Fluorescence
一、分子荧光的产生过程二、荧光的产生与分子结构的关系
三、影响荧光强度的因素
Instrumental Analysis
3
第二节分子荧光分析法
Fluorescence Analysis
Instrumental Analysis
12
2.有机化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高。这是因为→* 跃迁的摩尔吸收系数比 n → *大，且 →*跃迁的寿命比n → *要短。（ 2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。（ 3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（ 4）取代基效应：芳环上有
9
辐射能量传递过程荧光发射：第一激发单重态的最低振动能级→基态
（ S1→ S0跃迁） 10-7～10 -9s
磷光发射：电子由第激发三重态的最低振动能级→基态
（ T1 → S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程： S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间窜跃→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～10 s ，即光照停止后，可持续一段时间。（ S0 → T1禁阻跃迁）
发射荧光的分子数激发分子的总数
F
kF kF
ki
i 1
n
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；
kF主要取决于化学结构，而Ski则主要取决于化学环境，同时也与结构有关。
大多数荧光物质的量子产率在0.1~1之间。

浓度很低时，bc < 0.05，则可近似写成： If = 2.3 I0 l c = Kc 定量分析的基础低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系，高浓度时，由于自吸收和自熄灭等原因，线性关系不成立。
Instrumental Analysis
16
影响荧光强度的外部因素
2.溶剂的影响
溶剂的介电常数越大，荧光峰的波长越长，荧光效率越大；
S0→T1 属于禁阻跃迁，需要通过其他途径进入，而且进入的几率小；
Instrumental Analysis
6
3.激发态→基态的能量传递途径
传递途径辐射跃迁无辐射跃迁
荧光
磷光
系间窜越内转换
外转换
振动弛豫
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。
Instrumental Analysis
10
S0
荧光的光物理本质
速率竞争决定光活化电子能量迁移的途径！
Instrumental Analysis
11
二、荧光的产生与分子结构的关系
Relation Between Fluorescence and Molecular Structure
1. 荧光量子产率
一、仪器与结构流程
二、激发光谱与荧光光谱
三、荧光分析法和应用
Instrumental Analysis
4
一、荧光的产生过程
Luminescence Process of Molecular Fluorescence
1. 分子能级与跃迁
* 分子能级比原子能级复杂，分子所具有的能级数目远多
于原子能级数目。在每个分子的电子能级上，都存在振动、转动能级； * 基态 →激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； * 激发态→基态：弛豫过程，多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
内转换：同多重态电子能级中,不同能级间的无辐射能级交换
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。
Instrumental Analysis
Instrumental Analysis
7
内转换 S2
内转换振动弛豫系间窜跃
S1
能量吸收 T1 发射荧光 T2
外转换
发射磷振动弛豫光
S0
l1
l2
l 2
l3
非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级
至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。
供电基，使荧光增强。重原子效应。
Instrumental Analysis
13
Instrumental Analysis
14
小结：
强荧光物质往往具备以下特征：
• • • • 具有大的共轭键结构；具有刚性平面结构；具有最低的单线电子激发态S1为 *型取代基团为给电子取代基
Instrumental Analysis
15
三、影响荧光强度的因素
1.荧光强度和溶液浓度的关系荧光强度 If正比于体系吸收的激发光的光强，即： If = K’( I0 - I )
由朗-比耳定律： I / I0= 10- b c
代入，得： If = K’I0(1-10- b c ) 将此式展开，即
2( 3 ( 2 . 3) b c 2 . 3) b c I K ' I [ 2 . 3 b c ] F 0 2 ! 3 !
Instrumental Analysis
5
2.电子激发态的多重度
* 大多数有机分子的基态处于单重态； * 电子激发态有单重态与三重态之分（取决于电子的自旋方向 M=2S+1，S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；
* 根据洪特规则，平行自旋（三重态）比成对自旋（单重态）
稳定，因此，三重态能级比相应单重态能级低；