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第十一章荧光分析法.ppt

第十一章荧光分析法.ppt

散射光干扰及消除
散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分 被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的 光。
散射光包括瑞利散射光和拉曼光
瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发
拉曼光： 有能量转移， λ散射> <λ激发
干扰的消除
1）改变激发光的波长；
单色器1
样品池
单色器2
垂直方向
放大 与
记录
检测器
荧光仪特点
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，
常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器
闪耀光栅
3 检测器 光电倍增管
5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成 强荧光衍生物以提高测量灵敏度。
故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可 用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚 广。
思考题
• 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？
• 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？
• 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。
6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。
7. 荧光光谱的特征？
1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射 出比入射光( )。
A. 波长长的光线
B. 波长短的光线
C. 能量大的光线
D. 频率高的光线
2. 下列说法正确的是(
)
A 荧光发射波长永远大于激发波长
B 荧光发射波长永远小于激发波长

荧光分析法ppt课件

荧光分析法ppt课件
特点：发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所需时间约 为10-7～10-9秒。
结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭
或
19
续前
返回2 返2回0
11.2.2 激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
3
续前 荧光分析法分类：根据光源不同进行分类
激发光源
紫外－可见光
X射线
原子特征谱线
荧光分析法
分子荧光法（Molecular Fluorometry) X射线荧光法（X-ray Fluorometry) 原子荧光法（Atomic Fluorometry)
荧光分析法与可见紫外吸收光谱比较
相同点
本质
不同点
过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠 时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低 电子能级，这种过程称为内部能量转换
特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
或
11
续前
注：
➢ 处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级
➢激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的依据
荧光
磷光
9
续前 1、振动弛豫（vibrational relexation）
过程：从电子激发态的某一振动能级以非辐射跃迁的方式， 回到同一电子激发态的最低振动能级的过程为振动驰豫
特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时 间约10-12秒。

第十三章-荧光分析法PPT课件

第十三章-荧光分析法PPT课件
内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs

分析化学第11章--荧光分析法

分析化学第11章--荧光分析法
第11章 荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03

分析化学课件-荧光分析法基本原理

分析化学课件-荧光分析法基本原理

仪器的校正
灵敏度 以能被检出的最低信号来表示
波长
在选定条件下用稳定荧光物质校正 用汞灯标准谱线校正
激发光谱和荧光光谱
双光束仪器时，误差可抵消
二、其他荧光分析技术简介
1.激光荧光分析 2.时间分辨荧光 3.同步荧光分析 4.胶束增敏荧光
谢谢
溶剂
水 乙醇 环己烷 CCl4 CHCl3
激 发 光（nm） 248 313 365 405 436 271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 —— 320 375 418 450 —— 346 410 461 502
第二节 荧光定量分析方法
荧光分析法基本原理
一、分子荧光
（一）分子荧光的产生 1．分子的电子能级与激发过程
hc =
E
S0
S1*
T1*
电子能级的多重性 M＝2s＋1
振动驰豫
内转换 体系间跨越
磷光
吸收
荧光
外转换
（二）激发光谱与发射光谱
excitation spectrum
横坐标ex，纵坐标 发射光强度
fluorescence spectrum
一、荧光强度与物质浓度的关系
F=K’(I0-I) I=I010-ECL
F= K’I0(1-10-ECL) = K’I0(1-e-2.3ECL) 若c很小，Ecl ≤0.05 则
F=2.3K’I0Ecl=Kc
F=2.3K’I0ECL=KC
ECl≤0.05 F C ECl >0.05 F 与C不成正比
荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法

荧光法
F

第四章荧光分析法。

第四章荧光分析法。

重态的最低振动能级。
内转换
振动弛豫
内转换
系间跨越
S2*
能
S1*
T2* T1*
量 吸 收
发 射
外转换
荧
发
射 振动弛豫 磷
光
光
S0 l 1
l 2 l 2
l3
（二）荧光的产生
5、外转换：激发分子与溶剂或其他溶质分子之间产生相互 作用而转移能量的非辐射跃迁。 外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。 6、系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射 跃迁。
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
三、荧光与分子结构的关系
（一）荧光效率 （二）荧光寿命 （三）分子结构与荧光的关系
电子激发态的多重态 M=2S+1
（二）荧光的产生
内转换
振动弛豫
内转换
系间跨越
S2*
S1*
T2*
能
T1*
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷 振动弛豫
光
光
S0 l 1
l 2 l 2
l3
（二）荧光的产生
处于激发态的分子是不稳定的，它可通过辐射跃迁和非辐射 跃迁的形式释放多余能量而返回基态。 辐射跃迁主要涉及荧光、延迟荧光、磷光发射。 无辐射跃迁指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、 内部能量转换、体系间跨越、外部能量转换。
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光 系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
（二）荧光的产生
1、荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态
（多为S1→S0跃迁），发射波长λ′2 的荧光。

第十四章荧光分析法


如果标准曲线通过零点，可用比例法进行 测定。配制一标准溶液，使其浓度在线性范 围内，测定荧光强度FS，然后在同样条件下 测定试样溶液的荧光强度FX。由标准溶液的 浓度CS和两种溶液的荧光强度比，求得试样 中荧光物质的浓度CX或含量。
3．解线性方程法
多组分混合物的荧光分析也可以象 吸收分光光度法一样利用荧光强度 的加和性质，采用解线性方程组的 方法、双波长及多波长等方法从混 合物中不经分离即可测得被测组分 的含量。
ln F0 t
Ft f
二、荧光强度与分子结构的关系
一个化合物能否产生荧光，荧光强度的大小， λex(max)和λem(max)的波长位置均与其分子 结构有关。下面简述影响分子荧光强弱的一 些结构规律。
(一) 跃迁类型 (二) 共轭效应
(三)刚性结构和共平面效应 (四) 取代基效应
三、影响荧光强度的外界因素
4．体系间跨越(intersystem crossing)
又称体系间交叉跃迁，指不同多线态间的无 辐射跃迁。如内转换一样，若两电子能态的 振动能级重迭，将会使这一跃迁几率增大。 图14-2中S→ T的跃迁即为体系间跨越。激发 单线态的最低振动能级同三线态的较高振动 能级重迭，因而发生电子自旋状态改变的体 系间跨越就有了较大的可能性。
分子所处的外界环境，如溶剂、温度、pH、 重原子、荧光熄灭剂等都会影响荧光效率， 甚至影响分子结构及立体构象，从而影响荧 光光谱和荧光强度。
(一) 溶剂的影响 (四) 氢键的影响 (二) 温度的影响 (五) 散射光的影响 (三) pH值的影响
(六)荧光熄灭剂(quenching medium) 的影响
1．直接荧光法 2．荧光衍生物法 3．化学引导荧光法 4．荧光熄灭法 5．胶束增敏荧光分析法

分析化学课件 PPT讲义 荧光分析法

药物分析教研室
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
▪ 温度 ▪ 溶剂 ▪ pH值 ▪ 荧光熄灭剂 ▪ 散射光
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
荧光光谱
激发 320nm
激发350nm
荧光448nm
§2.1 荧光强度与物质浓度的关系
荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别
UV-vis
0
100%
T=0，A=∞
T=100%，A=0
关闭光闸，光不透 空白溶液，光全透
过，全吸收
过，不吸收
荧光分析法
F=0 空白溶液，不发射
荧光
F=100% 对照品溶液Cmax
F=50%(Cmid)
药物分析教研室
的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间。用f表示。
• 荧光效率(fluorescence efficiemcy)：又称荧光量子产率
(fluorescence quantum yield)是指激发态分子发射荧光的光子数 与基态分子吸收激发光的光子数之比。f
• 荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要参数！
分析化学 Analytical Chemistry
药物分析教研室
药物分析教研室
概述
• 发光(phosphorescence)：物质受到一定波长的光照射后， 外层电子跃迁后返回基态时，以光辐射的形式释放能量，这 种现象称为发光。(荧光、磷光)
• 荧光(fluorescence)：物质分子接受光子能量被激发后，从 激发态的最低振动能级返回基万言书时发射出的光。

第十二章荧光分析法(Fluorometry)


kF
+ kVR
+ kIC
kF + kISC
+ kEC
+ kP
❖ 凡使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素 均可增加荧光量子产率。
❖ kF通常由分子结构决定，而其它参数则由化学
环境和结构共同决定。
2020年7月11日星期六
16
※ 3、荧光产生的条件
❖ 产生并可观察到荧光的条件： 1）分子必须具有吸收一定频率紫外光的特定 结构； 2）物质吸收特征频率的辐射后，必须具有较 高的荧光效率
13
2020年7月11日星期六
14
二、荧光与分子结构的关系
1、荧光寿命：
❖ 去除激发光源后，分子荧光强度降低到最大荧光强度 的1/e所需的时间，用τf 表示。
❖ 根据指数衰减定律可求出荧光寿命：
Ft = F0e－Kt
若t = τ f ,则Ft = ( 1 / e )F0 ,K = 1 / τ f
2020年7月11日星期六
6
（3）外转换（External Conversion，EC）
❖ 受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使 荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或 “猝灭”。常发生在第一激发单重态或激发三重态的最 低振动能级向基态转换的过程中。
（4）系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC）
基态：M=2S+1=1
激发态： S=0，M=2S+1=1 S=1，M=2S+1=3
S*1
T*1
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荧光和磷光产生示意图
2020年7月11日星期六
5
2. 去活化过程（Deactivation）
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结果：这种跨越会导致荧光强度减弱，甚至熄灭。
13
续前 影响体系间跨越几率增大的因素：
含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。 原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运 动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反 转的发生。
在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体 Leabharlann 间跨越的发生几率。返回18
续前 6、外部能量转换（external conversion)
过程：如果分子在溶液中被激发，激发分子之间、分子与溶剂 之间会发生碰撞而失去能量，这种非辐射跃迁的过程称 为外部能量转换
特点：发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所需时间约 为10-7～10-9秒。
结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭
或
19
续前
返回2 返20回
11.2.2 激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
21
激发光（谱二：）（与激吸发收光光谱谱类与似荧）表光示光不谱同激发波长的辐射引起
或
11
续前
注：
处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级
过程：振动弛豫→内部能量交换→振动弛豫
返回12
续前 3、体系间跨越（intersystem crossing)
过程：处于激发态的电子自旋方向发生改变，而使电子能级的 多重性发生变化的过程
特点：激发单重态与激发三重态振动能级重叠时，产生体系间 的跨越（S1*→T1 ）。
3
续前 荧光分析法分类：根据光源不同进行分类
激发光源
紫外－可见光
X射线
原子特征谱线
荧光分析法
分子荧光法（Molecular Fluorometry) X射线荧光法（X-ray Fluorometry) 原子荧光法（Atomic Fluorometry)
荧光分析法与可见紫外吸收光谱比较
相同点 本质
不同点 灵敏度 选择性
22 多重性 M 1
三重态：两电子自旋方向相同， 自旋量子数分别为 1 和 1
22
triplet state 总自旋量子数 S 1 1 1
22
多重性 M 3
6
续前 基态单重态S0
能
π*
量
激发单重态S*
π* π*
激发三重态T
π
π
π
A
B
C
单重态和三重态电子分布
A：基态单重态 B：激发单重态 C：激发三重态 7
激发光谱 激发光谱
荧荧光光光光谱 谱
返16回
续前 5、磷光（phosporescence）
过程：电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的 任一振动能级而发射的光量子为磷光
特点：发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。分子在三 重态的最低振动能级上可以存活一段时间，发射时间约 为10-4～10 s。
磷光
9
续前 1、振动弛豫（vibrational relexation）
过程：从电子激发态的某一振动能级以非辐射跃迁的方式， 回到同一电子激发态的最低振动能级的过程为振动驰豫
特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时 间约10-12秒。
或
返回10
续前 2、内部能量转换（internal conversion) 过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠 时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低 电子能级，这种过程称为内部能量转换 特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
续前
跃迁类型的比较
跃迁类型 基态→激发单重态S*
所需能量
大
自旋方向 跃迁几率
不变 接近于1
基态→激发三重态T* 小 改变
10－6（光学禁阻）
8
续前
二、荧光的产生
处于激发态的分子返回到基态共有以下几种途径：
回基态途径
无辐射跃迁
1
2 36
振动 弛豫
内部能 量转换
体系间 外部能量
跨越
转换
辐射跃迁
45
荧光
返回14
续前 4、荧光（fluorescence）
过程：电子由单重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的 任一振动能级而发射的光量子为荧光
特点：发生在激发单重态最低振动能级与基态之间。时间约为 10-7～10-9 s。
注：
发射荧光的能量比吸收的能量小
1 > 0
即发射波长 > 激发波长
15
硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱
分析化学Ⅱ
第十一章 荧光分析法
分析化学教研室
1
荧光分析法（Fluorometry)
概述 基本原理 荧光定量分析方法 荧光分析技术与应用 小结
2
11.1 概述
物质 基态
光照射
吸收
特定光
激发态
无辐射跃迁 放出热能或动能
光致发光 发射荧光和磷光
水溶性荧光黄
物质 基态
荧光分析法：基于对化合物的荧光测量建立起来的分析方法 荧光测量包括：荧光谱线位置及荧光强度
物质发射某一波长荧光所得的光谱。 方法：固定发射光波长λ em，依次改变激发波长λex，测
荧光强度F，以F-λ ex作图得荧光物质的激发光谱。
发射光谱：（荧光光谱）固定激发光波长λ ex，依次改变发射 波长λ em，测荧光强度F，以F-λ em作图得荧光光谱。
一、分子能级与电子能级的多重性
分子的能级包括：电子能级（10ev）、振动能级(0.1ev)
及转动能级(0.001ev)
电子能级的多重性M:M=2S+1；S为总自旋量子数
单重态：两电子自旋方向相反， 自旋量子数分别为 1 和 1
22
singlet state 总自旋量子数 S 1 ( 1) 0
注：
发射磷光的能量比荧光的能量小 2>1 > 0 即磷光波长 > 荧光波长 > 激发波长
17
续前
荧光与磷光的比较
跃迁
荧光
激发单重态 最低振动能级→基态
磷光
激发三重态 最低振动能级→基态
光电子能量
E激发＞ E荧光＞E磷光
波长 发射时间
λ激发＜ λ荧光＜ λ磷光
10-9~10-7秒
10-4~10秒
荧光 分子光谱 发射光谱 10-8~10-10g/ml
高
可见紫外
分子光谱
吸收光谱
10-5~10-7g/ml
一般
返4回
11.2 基本原理
11.2.1 分子荧光光谱的产生 11.2.2 激发光谱与发射光谱 11.2.3 分子结构与荧光的关系 11.2.4 影响荧光强度的外部因素
5
11.2.1 分子荧光光谱的产生