铁皮石斛及金钗石斛菌根真菌的分离及其生物活性测定

铁皮石斛及金钗石斛菌根真菌的分离及其生物活性测定郭顺星,曹文芩,高微微(中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所,北京　100094)[摘要]　目的:对我国云南、四川等地采集的野生铁皮石斛Dendrobium candidum和金钗石斛D.nobile根中的内生真菌进行分离并测定其生物活性。

方法:采用平板分离法分离内生真菌;所获得真菌分别与铁皮石斛种子、铁皮石斛及金钗石斛无菌苗共培养测定其生物活性。

结果:分离获得内生真菌25种,主要属于担子菌B asidiomy2 cotina和半知菌Deuteromycotina;生物活性测定结果表明,其中5种真菌可促进铁皮石斛种子萌发;7种真菌可与铁皮石斛和金钗石斛幼苗形成共生关系,但仅有3种真菌对幼菌有促生作用。

结论:分离和筛选促进石斛生长发育的适宜菌根真菌,是菌根技术应用于石斛生产的关键问题之一。

[关键词]　铁皮石斛;金钗石斛;菌根真菌[中图分类号]S567　[文献标识码]B　[文章编号]100125302(2000)0620338204 兰科O rchi daceae植物是与真菌形成典型共生关系的特殊类群,因内外学者对兰科植物内生真菌进行了大量研究[1,2],但对铁皮石斛和金钗石斛菌根真菌的分离,尤其是菌根真菌对这两种植物的生物活性报道很少。

铁皮石斛及金钗石斛是我国宝贵的药用植物,由于自然资源少,采挖过度,目前已濒临灭绝;加之组培无菌苗移栽成活率低,生长缓慢,难以规模生产[3]。

为此,作者从兰科植物特殊的菌根关系入手,先后对这两种兰科药用植物的菌根真菌进行了分离,并对其生物活性进行了初步筛选,现报道其研究结果,为全面深入研究菌根真菌对兰科药用植物的促生机理提供参考。

1　材料和方法1.1　材料供分离菌根真菌的材料,分别采自四川、云南、福建等地的野生铁皮石斛Dendrobi um candi dum Wall.ex Lindl.和金钗石斛D.nobile Linkl1。

1.2　方法1.2.1　菌根真菌分离及分类　内生真菌分离方法参考有关文献改进[1,4],野生铁皮石斛、金钗石斛的根分别用流水冲洗干净,并用无菌水充分洗净切成0.5～1cm小段,0.1%HgCl2溶液表面清毒8[收稿日期]　1999211218[资助项目]　高等学校全国优秀博士学位论文作者专项基金资助(199950)～10min,无菌水冲净消毒液,再用75%乙醇消毒5 s,无菌水冲洗后接种于含有PDA培养基的平皿内, 25℃恒温培养。

观察到根内部(皮层)有菌丝长入培养基时,及时挑取真菌菌丝顶端并转到另一含有PDA培养基的试管或平皿纯化培养。

根据菌落的平皿培养特征、并利用光学显微镜观察菌丝及产孢结构,参考并比较已报道过的兰科植物内生真菌[5～10]对所获得的内生真菌进行分类、鉴定,见表1。

1.2.2　生物活性测定[5]　①取成熟未裂的铁皮石斛果实,表面消毒后将种子分别轻弹于上述23种菌根真菌纯培养的树叶上,45d时分别统计发芽率。

②将菌根真菌分别接种于瓶培的铁皮石斛、金钗石斛的无菌苗周围,50d时观察苗2菌共培养情况,见表2。

2　结果2.1　菌根真菌的分离作者分别在四川、云南、福建等地采集野生铁皮石斛植株,截取分离根段105个,其中有43个根段分离到有内生真菌,占此分离总根数的40195%。

从获得的内生真菌中,经纯化和初步分类比较,得到不同形态特征的菌株14个。

其中7种属于担子菌类,6种属于半知菌类,1种未鉴定。

金钗石斛截取根段83个,其中有20个根段长出菌根真菌,占所分离根数的25.00%,根据生长和形态特征,经纯化和・833・剔除相同菌株,到内生真菌11种。

其中担子菌3种,半知菌5种,未鉴定3种。

2.2　菌根真菌对铁皮石斛种子萌发的生物活性测定用上述25种菌根真菌分别培养无菌树叶,约20 d,菌丝基本布满树叶,将铁皮石斛种子轻弹播于染菌树叶上。

培养45d时,测定其种子发芽率。

从表2可以看出,仅DC23,DC213,DN22,DN26和DN27对铁皮石斛种子萌发有作用,其中DN26和DC213对种子萌发较好,可达51.48%,42.00%。

其余菌株与无菌树叶(对照)相同均对铁皮石斛种子无萌发作用。

2.3　菌根真菌对铁皮石斛幼苗生长影响将23种菌根真菌分别接种至瓶培的铁皮石斛无菌苗中,培养50d时观察,发现12种菌根真菌对铁皮石斛幼苗有致死作用,即真菌成了铁皮石斛的寄生物;8种真菌对幼苗无伤害作用,不形成内生菌根结构,菌丝在根围生长,对幼苗也无促生作用;仅有DC28,DC213和DN23对铁皮石斛幼苗比对照有促生长作用,切片观察也有菌根结构[11,12]。

2.4　菌根真菌对金钗石斛幼苗生长影响菌根真菌与金钗石斛幼苗共培养结果显示,8种真菌可使金钗石斛苗死亡,培养50d时,真菌菌丝布满整个植株。

11种真菌对金钗石斛既无促生作用,也无菌根结构。

DN21和DN28两种真菌对幼苗生长虽无促生作用,但解剖发现,菌丝可侵染至根的表皮和少量皮层细胞,幼苗也生长正常。

DN23对金钗石斛有明显促生长作用,但菌丝不侵入根细胞,仅在根围生长。

DC27,DC28和DC213既与金钗石斛的根形成菌根结构,又对幼苗有促生效果。

3　讨论虽然几乎所有自然界兰科植物均具菌根结构,但并不是兰科植物所有根内均有真菌存在。

一般菌根真菌多存在于较老的根中。

从作者分别4次采集的铁皮石斛和金钗石斛根的分离情况可以看出,铁皮石斛根段上仅有40.95%能分离出菌根真菌,金钗石斛为24.66%。

从我们多年分离兰科菌根真菌经验分析,被分离的根段表面必须消毒彻底,一般表1　铁皮石斛和金钗石斛菌根真菌分离植物名称分离根段数长菌段数菌株数菌株号分类 DC21柱孢霉属Cyli ndrocarpon sp. DC22枝顶孢霉属Acremoni um sp. DC23瘤菌根菌属Epulorhiz a sp. DC24瘤菌根菌属 E.sp. DC25蚀丝霉属Myceliophthoreae sp. DC26头孢霉属Cephalospori um sp.铁皮石斛1054314DC27头孢霉属Cephalospori um sp. Dendrobi um DC28瘤菌根菌属Epulorhiz a sp.candi dum DC29角菌根菌属Ceratorhiz a sp. DC210未鉴定 DC211简梗孢霉属Chromospori um sp. DC212丝核菌属Rhizoctomia sp. DC213石斛小菇Mycena dendrobii DC214念珠菌根菌属Moniliopsis sp. DN21丝核菌属R.sp. DN22丝核菌属R.sp. DN23粘帚霉属Gloiocladi um sp. DN24未鉴定金钗石斛832011DN25未鉴定D.nobile DN26兰小菇Mycena orchi dicola DN27粘帚霉属Gliocladi um sp. DN28盘多毛孢属Pestaloti na sp. DN29未鉴定 DN210念珠菌根菌属Moniliopsis sp. DN211角菌根菌属Ceratorhiz a sp.・933・表2　菌根真菌对石斛种子萌发及幼苗生长的生物活性菌株伴播铁皮石斛种子萌发率/%对铁皮石斛幼苗生长影响对金钗石斛幼苗生长影响DC21无萌发幼苗死亡幼苗正常,无菌根关系DC22无萌发幼苗死亡幼苗死亡DC2310.10形成菌根关系,无明显促生作用幼苗正常,无菌根关系DC24无萌发幼苗死亡幼苗死亡DC25无萌发幼苗死亡幼苗死亡DC26无萌发幼苗正常,但无菌根关系不促进生长幼苗正常,无菌根关系DC27无萌发幼苗死亡形成菌根结构,对幼苗有促生作用DC28无萌发形成菌根关系,有明显促生作用形成菌根关系,有明显促生作用DC29无萌发幼苗死亡幼苗死亡DC210无萌发幼苗正常,不形成菌根关系,不促进生长幼苗正常,无菌根关系DC211无萌发幼苗正常,不形成菌根关系,不促进生长幼苗正常,无菌根关系DC212无萌发幼苗死亡幼苗死亡DC21342.00形成菌根关系,有明显促生作用形成菌根关系,有明显促生作用DC214无萌发幼苗死亡幼苗正常,无菌根关系DN21无萌发形成菌根关系,但无明显促生作用形成菌根关系,但无促生作用DN2221.86形成菌根关系,但无明显促生作用幼苗正常,无菌根关系DN23无萌发形成菌根关系,有明显促生作用不形成菌根关系,但有明显促生作用DN24无萌发幼苗死亡幼苗死亡DN25无萌发幼苗死亡幼苗死亡DN2651.48形成菌根关系,但无促生作用幼苗正常,无菌根关系DN27 6.00幼苗正常,不形成菌根关系幼苗正常,无菌根关系DN28无萌发幼苗死亡形成菌根关系,但无促生作用DN29无萌发幼苗死亡幼苗死亡DN210无萌发幼苗正常,不形成菌根结构幼苗正常,不形成菌根结构DN211无萌发幼苗正常,不形成菌根结构幼苗正常,不形成菌根结构对照(CK)无萌发幼苗正常幼苗正常0.1%升汞消毒8min以上,否则很容易得到大量杂菌,而非真正的兰科菌根真菌,后者一般存在于兰根的皮层部位。

本文所提及的对石斛有菌根结构形成,即指真菌能侵入石斛根的表皮或皮层细胞内所形成的菌根结构。

从本文试验结果可以看出,对铁皮石斛种子萌发有促进作用的5种菌根真菌,并非都对两种石斛的幼苗生长有促进作用,即在植物的不同发育阶段可能需要与不同的真菌共生。

一般情况下,对兰科植物生长有促进作用的真菌,往往与该植物形成菌根关系,但本试验中的DN23虽然解剖结果未观察到与金钗石斛有菌根结构,但对该植物生长有明显的促进作用,其促生作用机理仍待深入研究。

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