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纳豆激酶的发酵、纯化条件的优化及开发应用纳豆激酶的发酵、纯化条件的优化及开发应用引言：纳豆激酶(Nattokinase)是一种来源于传统日本食品纳豆中的蛋白酶，具有多种生物活性，如溶栓、抗凝血、抗炎等。
在过去的几十年里，人们对纳豆激酶的研究逐渐增多。
本文将重点讨论纳豆激酶的发酵过程、纯化条件的优化以及其在医药和食品工业中的应用。
纳豆激酶发酵的条件优化：纳豆激酶产生菌株的筛选和培养基的优化是纳豆激酶发酵的首要步骤。
选择产纳豆激酶能力较高的菌株，并通过基因工程方法来提高其产酶能力，可以大大增加纳豆激酶的生产效率。
培养基的研究也是优化纳豆激酶发酵条件的重要环节。
适当调整培养基的pH值、碳源、氮源和有机酸等参数，可以显著提高纳豆激酶的产量。
纳豆激酶的纯化方法：纳豆激酶是一种具有较高分子量的蛋白酶，因此采用离子交换、凝胶层析、亲和层析等技术进行纯化是常见的方法。
离子交换层析是利用蛋白质与离子交换柱上的固定相之间的静电作用进行分离，该方法具有简便、高效的特点。
凝胶层析则是基于蛋白质在固定相的排阻效应分离的技术，可以纯化目标蛋白酶。
亲和层析则是利用目标蛋白酶与亲和基质之间的特异结合来纯化蛋白质。
综合应用这些方法，可以得到较纯的纳豆激酶。
纳豆激酶的应用前景：纳豆激酶具有多种生物活性，因此在医药、保健品和食品工业中具有广阔的市场前景。
首先，在医药领域，纳豆激酶被广泛应用于溶栓治疗，可以降低血栓形成的风险。
同时，纳豆激酶还具有抗凝血、抗炎、降低血脂等功能，因此也可以用于治疗心血管疾病。
其次，纳豆激酶可以作为保健品，用于改善心脑血管健康、抗衰老和增强免疫等作用。
此外，纳豆激酶还可以用作食品添加剂，以增加食品的营养价值和保鲜效果。
结论：纳豆激酶发酵、纯化条件的优化以及其在医药和食品工业中的应用有着巨大的潜力。
通过选择高产纳豆激酶菌株和优化培养基条件，可以提高纳豆激酶的产量。
同时，离子交换、凝胶层析和亲和层析等技术可以有效纯化纳豆激酶。
纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基的优化帅明黄占旺牛丽亚（江西农业大学食品科学与工程学院南昌330045）摘要为优化纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基，采用微生物固态发酵技术，以固态发酵后的活菌数、芽孢数、蛋白酶及α-淀粉酶活力为指标，对纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基组成及配比，添加碳源、氮源种类及浓度，培养基的含水量进行优化研究。
试验结果表明，在玉米粉与麦麸配比3∶7、葡萄糖2%、硝酸铵0.5%、水60%条件下发酵效果最好。
关键词纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基文章编号1009-7848（2009）01-0143-05纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto ）具有改善宿主肠道微生物菌群平衡的功能[1]，近年来被广泛用于食品行业和养殖业。
纳豆芽孢杆菌是从日本的发酵食品———纳豆中发现并分离出来的，属细菌科、芽孢杆菌属，其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种[2]。
纳豆芽孢杆菌具有溶血栓、降血压、抗肿瘤、抗菌、防止骨质疏松、调节肠道内环境等功能[3]，是近年来研究的热点。
目前的研究主要集中在纳豆激酶高产菌株的筛选、溶栓作用等方面，对其固态发酵技术的研究较少。
本文对纳豆芽孢杆菌固态发酵培养基进行优化，为工业大规模生产提供理论和技术支持。
1材料与方法1.1材料1.1.1发酵培养基麦麸、玉米粉、豆渣、豆粕，购于农大农贸市场。
1.1.2菌种来源纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto ）B1由江西农业大学食品微生物实验室人员分离保存。
1.1.3菌种培养基[4]牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基。
1.1.4试剂葡萄糖、乳糖、蔗糖、棉子糖、尿素、硫酸铵、硝酸铵，均为分析纯试剂。
1.2仪器与设备754紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；SPX-150B 生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；HZQ-F160全温振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术公司；101A-4B 电热鼓风干燥箱，上海实验仪器总厂；LDZX-40B 自动立式电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；HH －2数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。
《毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》一、引言随着生物技术的快速发展，酶类物质在工业、医药及生物工程等领域的应用日益广泛。
纳豆激酶作为一种天然存在的溶栓酶，因其具有良好的生物活性和稳定性而备受关注。
本文选取毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013作为纳豆激酶的生产菌株，通过对其发酵过程进行优化及发酵动力学研究，以期提高纳豆激酶的产量及发酵效率。
二、材料与方法2.1 材料本研究所用材料包括毕赤酵母LNF013菌株、发酵培养基、酶活性检测试剂等。
2.2 方法（1）发酵过程优化：通过调整培养基组成、发酵温度、pH 值、接种量等参数，对毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的发酵过程进行优化。
（2）发酵动力学研究：采用动力学模型对发酵过程进行描述，分析各参数对纳豆激酶产量的影响，并建立相应的数学模型。
三、结果与分析3.1 发酵过程优化结果通过调整各参数，我们发现：（1）培养基组成：适当增加碳源、氮源浓度有助于提高纳豆激酶的产量。
（2）发酵温度：在30℃左右，毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的活性较高。
（3）pH值：pH值为6.5左右时，菌株生长及纳豆激酶产量达到最佳状态。
（4）接种量：适宜的接种量有助于提高菌株的生长速度及纳豆激酶的产量。
3.2 发酵动力学研究结果通过建立动力学模型，我们发现：（1）菌体生长与纳豆激酶产量之间存在明显的相关性，可通过监测菌体生长情况来预测纳豆激酶的产量。
（2）各参数对纳豆激酶产量的影响程度不同，其中培养基组成、温度和pH值对纳豆激酶产量的影响最为显著。
四、讨论通过对毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的发酵过程进行优化及发酵动力学研究，我们找到了提高纳豆激酶产量的关键因素。
在实际生产中，可根据实际情况调整这些参数，以实现更高的纳豆激酶产量及发酵效率。
此外，建立的动力学模型有助于预测和调控发酵过程，为工业化生产提供有力支持。
ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎＬｉｑｕｉｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｏＰｒｏｄｕｃｅＮａｔｔｏｋｉｎａｓｅａｎｄＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＢａｃｔｅｒｉｕｍｏｆＮａｔｔｏｋｉｎａｓｅＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＳｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｐａｒｔｉａｌｆｕｌｆｉｌｌｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅＢｙＦｅｉｆｅｉＺＨＡＮＧＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＱｉａｎｇＸＩＯＮＧＭａｙ２０１２摘要摘要纳豆（Ｎａｔｔｏ）是大豆经纳豆枯草芽孢杆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮａｔｔｏ）发酵而成的日本传统食品。
在纳豆的发酵过程中，发现一种具有高溶纤维活性的丝氨酸蛋白酶，须见洋行博士将其命名为纳豆激酶（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ，ＮＫ）。
纳豆激酶以直接及间接的方式作用于纤维蛋白，从而达到溶栓目的。
另外，纳豆激酶在自然条件下酶活性质比较稳定，安全性高，无毒副作用，半衰期长，分子量小，易被人体吸收，可作口服，作用直接迅速，且药效发挥持续时间长，可由微生物发酵生产，或基因工程技术制备，是一种很有潜力的新型溶血栓药物。
本课题对纳豆激酶的液态发酵条件做了进一步的优化研究，在此基础上，又进行了基因工程制备的研究，为改变纳豆激酶的传统发酵工艺做一定的基础。
首先，研究了摇瓶培养和发酵罐培养时培养基组分和培养条件对纳豆枯草芽孢杆菌产酶的影响。
采用摇瓶液体发酵时，利用单因素实验对碳源、氮源、金属离子、起始ｐＨ、温度、时间、接种量进行研究，运用ｓｔａｎｄａｒｄ．ｄｅｓｉｇｎｓ设计实验获得显著影响因子，以及采用响应面分析实验确定关键因素的最佳水平；之后应用７．５Ｌ发酵罐对搅拌转速、发酵过程的温度、ｐＨ、补料的添加、发酵时间等进行了实验研究。
结果表明：最佳发酵培养基为可溶性淀粉１９ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ：０．２４ｇ／Ｌ、豆粕粉１３．５ｇ／Ｌ、酵母膏１３．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰ０。
《毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》摘要：本研究针对毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF03菌株在生产纳豆激酶过程中的发酵工艺进行优化，并通过发酵动力学研究其生长和产酶规律。
首先通过分析发酵过程中的关键因素，对发酵条件进行优化；随后建立了基于实际数据基础的发酵动力学模型，探讨了LNF03菌株在产酶过程中的变化趋势，旨在提高纳豆激酶的产量与质量。
一、引言纳豆激酶作为一种具有广泛用途的生物酶，在医药、食品和化工等领域具有重要价值。
毕赤酵母（Pichia pastoris）作为一种高效的异源蛋白表达系统，被广泛应用于各种酶类产物的生产。
本研究的LNF03菌株具有高表达纳豆激酶的能力，因此对其实施发酵优化和动力学研究具有重要意义。
二、材料与方法1. 材料（1）菌种：毕赤酵母LNF03；（2）主要试剂及培养基：常规培养基和化学试剂等。
2. 方法（1）菌种活化及预培养；（2）不同条件下的发酵实验；（3）纳豆激酶的提取与活性检测；（4）建立发酵动力学模型。
三、实验结果与分析1. 发酵条件优化（1）pH值对纳豆激酶产量的影响：通过调整发酵过程中的pH值，发现pH 5.5时纳豆激酶产量最高。
（2）温度对纳豆激酶活性的影响：在28℃至32℃之间，随着温度的升高，纳豆激酶活性增加；当超过此范围后，酶活性有所降低。
（3）底物浓度及种类对产酶效果的影响：经过对比实验，确定了最佳底物浓度及种类。
2. 发酵动力学研究（1）菌体生长曲线：根据实验数据绘制了菌体生长曲线，发现LNF03菌株在特定时间点进入对数生长期和稳定生长期。
（2）纳豆激酶生成曲线：随着发酵时间的延长，纳豆激酶的生成量逐渐增加，达到一定时间后趋于稳定。
（3）建立发酵动力学模型：基于实验数据，建立了描述菌体生长和纳豆激酶生成的数学模型，对产酶过程进行定量分析。
四、讨论与结论通过本次实验发现，调整发酵条件可以有效提高毕赤酵母LNF03产纳豆激酶的产量和活性。
纳豆激酶发酵培养基的优化
姓名: 黄江坤
班级：制药132
学号：201304040225
纳豆激酶发酵培养基的优化
一、菌种选择
选用纳豆枯草杆菌为发酵菌种
二、纳豆菌的特性
纳豆菌，通常为（0.7-0.8）um×(2.0-3.0)um,革兰氏阳性。
生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。
芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。
生长温度最高为45-55℃，最低为5-20℃。
孢子耐热性强。
三、纳豆激酶基因的表达
NK基因起始密码子为GTG,其上游1b7p处为核糖体结合位点AAAGGAG,SD序列上游为刀T含量高达2%的转录调控区域,1143bp的阅读框架编码29个氨基酸的信号肚,77个氨基酸的前导肽及275个氨基酸的成熟肽。
结构基因的3末端为连续3个终止密码子TAA、TAG、TAA,终止密码子之后一段序列可形成茎环结构,即因子非依赖性终止顺序。
NK的最初产物是381氨基酸的蛋白前体。
其中N端的1一23氨基酸残基是信号肽,24一106氨基酸残基是前导肽。
蛋白前体切除N 端的106个氨基酸残基成为275氨基酸残基的成熟纳豆激酶;而去掉信号肽的产物(含前导肽和成熟肽)称为纳豆激酶酶原。
信号肽包含一个带3个正电荷的亲水氮端以及一段不带电荷的疏水残基序列,其功能是使NK正常分泌出胞外,其切割位点位于Ala一Glu一Aal保守序列之后。
信号肽与成熟肽之间具有的前导肽具有帮助NK正常折叠形成活性构象的功能,目前己发现一些与NK基因同源的枯草杆菌素蛋白及链激酶有与此相似的前肽区域。
四、纳豆激酶的蛋白质结构及生化性质：
纳豆激酶（NK）是一种丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸组成的单链多肽结构。
NK肽链无二硫键,活性中心在Asp32,His64和Ser221,与底物结合部位在Serl25,Lenl26和Glyl27处。
NK与大多数枯草杆菌蛋白酶在核苷酸序列上和肽链链氨基酸组成上具有高度同源性,它与B.subtilis1168产生的枯草杆菌蛋白酶E仅有13个核苷酸不同,在肽链组成上仅有2个氨基酸不同,它们成熟肽链一级结构的相同性为99.5%;纳豆激酶等电点为pH8.6,纳豆激酶在pH6.0一12.0范围内稳定,pH低于5.0则不稳定。
40℃保温30mni活力无变化,温度超过50℃,
活力逐渐丧失,超过60℃时则因蛋白变性而迅速失活,反复融冻对酶活影响不大。
五、以普通发酵培养基为基础培养基，分别改变培养基的组成和含量考察培养基组成对纳豆芽孢杆菌液体发酵产纳豆激酶活力的影响
1氮源
纳豆激酶是种诱导酶，菌株分泌纳豆激酶的目的是利用它水解环境中的蛋白质及肽类,以提供自身生长所需的氨基酸。
通过比较大豆蛋白胨、豆渣、豆浆和胰蛋白胨对产酶的影响,结果发现大豆蛋白胨最佳,豆渣和豆浆次之,而胰蛋白胨几乎不产纳豆激酶。
而且还发现在大豆蛋白胨中存在诱导菌体分泌纳豆激酶的前体。
2碳源
目前在碳源优化研究中,已考察的碳源包括木糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉,一般结论是木糖为最优。
其中,用葡萄糖作碳源时菌株产酶比较快,但产酶不多。
这可能是葡萄糖代谢阻遏造成的,也可能与纳豆激酶表达启动子的性质有关。
3发酵液pH
发酵液的pH会影响菌体对基质的利用速度、细胞形态结构及细胞内外各种酶的活性,从而影响菌体的生长和产物的合成。
各种菌株都有自己适宜的生长和产物合成的pH范围,而且这两者间还可能不同,因此要把发酵液pH值控制在需要的范围内。
而在发酵过程中,随着碳源的利用,发酵液pH有下降的趋势;同时胰蛋白胨被水解生成铵离子又会使pH上升,因此需要加入缓冲体系以控制发酵液pH。
所以选用NaH2PO4—Na2HPO4缓冲体系,除了这种体系简单易得,缓冲能力适宜外,还考虑到磷是核酸和蛋白质的必要成分,也是重要的能量传递者一三磷酸腺普(ATP)的成分;而且磷有利于糖代谢的进行,能促进微生物的生长繁殖。
但研究中发现过量的磷也会抑制许多产物的合成。
4无机盐离子
镁离子是许多重要酶的激活剂,还能影响蛋白质的合成;同时镁离子对纳豆激酶稳定性有利。
而硫是含硫氨基酸的组成部分,纳豆激酶恰好具有含硫氨基酸。
因此在培养基中加入了一定量的MgSO。
钙离子对纳豆激酶也有促进酶活稳定的
作用,所以还加入了CaCl2。
但应该注意的是,MgHPO4和CaHPO4都是难溶物质。
因此在配制培养基时应注意各组份添加顺序,避免产生沉淀、影响缓冲体系的缓冲能力。
在本研究配制培养基时,先取水溶解胰蛋白陈和木糖,然后加入NaH2PO4，Na2HPO4,最后边搅拌边加入MgSO和GaC12,较好的避免了沉淀的产生。
5酶稳定剂
当与血清蛋白、胃粘液蛋白以及煮沸过的小麦或大米提取液和肉汤混合后,纳豆激酶的稳定性显著增加,甚至在酸性条件下,酶活性也不会完全丧失。
这说明纳豆激酶在胃环境中能保持一定的活性,可食用纳豆达到溶栓目的。
还有研究发现,K+、Fe2+对酶稳定性无明显影响,而Zn2+、Co2+、A13+、Ca2+和Mn2+等则表现出不同程度的抑制作用,Hg2+可使纳豆激酶完全失活,Mg2+和Co2+对酶有明显激活作用。
因此，可以选用大豆蛋白胨为氮源，木糖为碳源，NaH2PO4—Na2HPO4 MgSO CaCl2 为无机离子，煮沸的小麦提取液为酶稳定剂在pH在7—8条件下对基础培养基进行优化来获得优化的纳豆激酶发酵培养基。
青霉素发酵培养基的优化
姓名: 王俊
班级：制药131
学号：201304040130。
