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1 目的为规范人羊膜来源间充质干细胞原代分离培养的标准操作，特制订本规程。
2范围适用于酶消化法分离培养人羊膜来源间充质干细胞的生产工艺流程。
3职责技术人员负责实施本规程，质量控制人员负责监督技术人员的实际操作和相关记录。
4工作程序4.1 材料健康胎盘羊膜组织4.2仪器设备超净工作台、倒置显微镜、CO2培养箱、电动移液枪、手动移液枪、离心机、37℃恒温气浴摇床、Countstar计数仪、计时器。
4.3试剂耗材4.3.1试剂完全培养基（高糖DMEM培养基+10% FBS+1%NEAA）、1ug/mL EGF、PBS缓冲液、0.5%I 型胶原酶、胰蛋白酶（0.25%胰酶+0.02%EDTA）、75%酒精、95%酒精、0.4%台盼蓝。
4.3.2耗材50mL离心管及离心管架、15mL离心管及离心管架、一次性移液管（2mL、10 mL、25 mL）、巴氏吸管、EP管及EP管架、10cm培养皿、移液枪头（10uL、200uL、1000uL)、镊罐、酒棉罐、酒精灯、酒精喷壶、打火机、无菌纱布无菌、250mL一次性储液瓶。
4.3.3器具4.3.3.1羊膜制作包1（1个肾形盘，2把18cm平镊、2把16cm止血钳、2把16cm组织镊、2 把12.5cm眼科剪、2把16cm弯剪、2把16cm直剪）。
4.3.3.2羊膜制作包2（2把18cm平镊、2把16cm直剪、2把16cm组织镊）4.3.3.3无菌100ml烧杯、、无菌15cm玻璃培养皿、无菌粗漏、无菌100目筛网、无菌废液杯、无菌不锈钢方盘。
4.4操作步骤4.4.1入洁净区之前用抑菌洗手液洗手，用75%酒精擦拭消毒双手，按照规定穿洁净服、戴口罩、戴帽子和手套。
4.4.2开恒温气浴摇床预热，打开超净台紫外灯消毒30min。
同时将实验所需培养基、0. 5%I 型胶原酶、胰蛋白酶、PBS缓冲液放置室温。
4.4.3 关紫外灯，打开通风10min，用无菌纱布单向擦拭消毒超净台，点燃酒精灯。
人羊水干细胞的分离培养及鉴定罗敏;焦志勇;赵家峰;黄从云【摘要】目的：分离培养人羊水干细胞（ hAFSC ）并鉴定。
方法：使用贴壁法分离培养羊水干细胞，细胞免疫荧光法和Western blot鉴定hAFSC。
结果：分离的羊水干细胞均表达特异性标记物Oct-4、c-kit、SSEA-4、CD105。
结论：成功分离及培养hAFSC，可作为种子细胞用于干细胞移植治疗肝纤维化。
%Objective:To isolate,culture and identify the stem cells de-rived form human amniotic fluid(hAFSC).Methods:hAFSCs were isola-ted and cultured with adherent method ,and identified by cell immune flu-orescence and Western blotting.Results:Generally,the isolated amniotic stem cells expressed specific markers of Oct-4, c-kit, SSEA-4, andCD105.Conclusion:hAFSC is successfully isolated and cultured,which can be used as the seed cells for management of hepatic fibrosis through stem cell transplantation.【期刊名称】《皖南医学院学报》【年(卷),期】2013(000)004【总页数】3页(P259-261)【关键词】人羊水干细胞;培养;鉴定【作者】罗敏;焦志勇;赵家峰;黄从云【作者单位】粤北人民医院重症医学科，广东韶关 512026;粤北人民医院消化内科，广东韶关 512026;粤北人民医院肝胆外科，广东韶关 512026;粤北人民医院肝胆外科，广东韶关 512026【正文语种】中文【中图分类】R394.2人羊水干细胞(human amniotic fluid stem cells，hAFSC)是一类具有胚胎干细胞增殖分化特性的细胞，通过羊水穿刺获取，较胚胎干细胞ESC易获取、具有复制和增殖能力强、分化能力强而且稳定、可能避免应用免疫抑制剂和伦理问题等诸多独特的优势［1－4］。
人羊膜成纤维细胞的分离和鉴定张啸环;段明华;闫玉礼;潘新;李海清;周长龙;赵天倚【摘要】目的:建立人羊膜成纤维细胞的体外培养方法,通过细胞的形态特征和免疫组织化学进行鉴定,从而获得人羊膜成纤维细胞,为后续的干细胞研究奠定基础.方法:从足月分娩人胎盘剥离羊膜,胰蛋白酶和胶原酶消化后分离人羊膜成纤维细胞,采用含表皮生长因子(EGF)的DMEM培养基进行培养.显微镜下观察细胞形态表现,采用HE染色和免疫组织化学染色分析细胞特征,采用流式细胞术(FCM)分析人羊膜成纤维细胞的纯度.结果:采用胰蛋白酶和胶原酶先后消化获得人羊膜成纤维细胞,显微镜下观察,细胞呈放射状或旋涡状生长.免疫组织化学染色,人羊膜成纤维细胞明显表达成纤维细胞标志物波形蛋白(Vimentin),不同程度地表达S100钙结合蛋白A4(S100A4),不表达上皮细胞标志物角蛋白19(CK19).流式细胞术分析,人羊膜成纤维细胞的纯度为86.1％.结论:成功建立了人羊膜成纤维细胞分离和鉴定方法,获得的细胞具有成纤维细胞的特异标志和表型特征.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2018(044)004【总页数】5页(P845-848,封3)【关键词】人羊膜成纤维细胞;HE染色;免疫组织化学;流式细胞术【作者】张啸环;段明华;闫玉礼;潘新;李海清;周长龙;赵天倚【作者单位】长春中医药大学药学院中药炮制教研室,吉林长春 130107;长春中医药大学药学院中药炮制教研室,吉林长春 130107;长春中医药大学药学院中药炮制教研室,吉林长春 130107;空军航空大学,吉林长春 130022;空军航空大学,吉林长春 130022;空军航空大学,吉林长春 130022;长春中医药大学药学院中药炮制教研室,吉林长春 130107【正文语种】中文【中图分类】Q813.1人羊膜是一种胎膜，分为人羊膜上皮层细胞[1]和人羊膜间充质基质细胞[2]，其中人羊膜成纤维细胞属于间充质基质细胞。
人羊膜间充质干细胞体外构建组织工程角膜上皮层的实验研究肖盼;陈剑【期刊名称】《中华实验眼科杂志》【年(卷),期】2015(033)011【摘要】背景目前角膜移植手术是治疗严重角膜病变的主要方法,角膜供体来源的匮乏限制该疗法的应用.组织工程角膜为角膜疾病的治疗开辟了新的途径. 目的探讨人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)构建组织工程角膜上皮层的可能性. 方法新鲜羊膜组织剪成6 cm×6 cm大小的组织块后用胰蛋白酶+EDTA消化液消化,将人羊膜上皮细胞(AECs)刮除干净,然后将羊膜组织剪碎,用胶原酶Ⅱ进行消化,分离原代hAMSCs并进行培养.分离新西兰白兔的角膜基质片后按随机数字表法分为2个组,实验组将培养至第3代的hAMSCs以1×105/ml的密度种植于去角膜上皮细胞的兔角膜基质片上进行培养,空白对照组为不种植细胞的空白角膜基质片.待细胞达80％～ 90％融合时再将兔角膜基质片移至插入式培养皿中进行气液界面诱导分化培养,培养至14 d时将兔角膜基质片在质量分数4％多聚甲醛中固定,制备组织切片,行苏木精-伊红染色,观察兔角膜基质片的形态.采用免疫组织化学染色和免疫荧光技术检测兔角膜基质片上诱导分化的hAMSCs中细胞角蛋白3(CK3)和CK12的表达. 结果实验组hAMSCs种植于去角膜上皮细胞的兔角膜基质片上气液界面培养14d 后可形成3～5层的复层细胞,可见兔角膜基底膜的hAMSCs细胞核呈椭圆形,表层的hAMSCs细胞核呈长梭形,形态与正常角膜上皮层相似;而空白对照组兔角膜基质上无细胞生长.免疫组织化学染色显示兔角膜基底膜上的hAMSCs对CK3、CK12呈阳性反应,为细胞质中棕黄色染色,而阴性对照组未见CK3、CK12染色.免疫荧光检测显示兔角膜基底膜上的hAMSCs细胞质中可见CK3、CK12呈绿色荧光,而阴性对照片细胞质荧光缺失.结论 hAMSCs在兔角膜基质片气液界面上可成功诱导分化为角膜样上皮细胞.%Background Corneal transplantation is an effective treatment to severe corneal diseases,but the shortage of cornea donor limits its application.Tissue-engineered cornea is being a new approach to corneal diseases.Objective This study was to investigate the possibility of construction of tissue-engineered corneal epithelium by culturing human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs) in vitro.Methods Fresh human amniotic membranes were obtained under the approval of Ethic Committee of Affiliated First Hospital of Jinan University and informed consent of maternal women.The 6 cm×6 cm amniotic membrane tissue explant was digested using trypsin+ EDTA,and then the amniotic epithelial cells (AECs) were scraped before putting into collagenase Ⅱ digestion medium to isolate hAMSCs.hAMSCs of passage 3 were cultured to achive 80％-90％ confluence,and then the ceils were incubated on rabbit deepithelial cornea l stroma at a 1 ×105/ml density.The corneal stroma was co-cuhured with hAMSCs at an air-liquid interface till 14 days.Rabbit deepithelial corneal stroma with and without hAMSCs (experimental group and control group) were fixed in 4％ para formaldehyde, and sections were prepared for histopathological examination.Immunochemistry and immunofluorescence were empoyed to detect the expressions of cytokeratin3 (CK3) and CK12 in hAMSCs.Results hAMSCs grew well and formed a stratified epidermal structure resembling native corneal epithelium on rabbit corneal stroma in cultured 14 days in the experimental group,with the oval nucleus at basement and fusiformnucleus on the surface of corneal stroma.There was no cell structure in the control group.Immunochemistry revealed brown staining for CK3, CK12 in cytoplasm of hAMSCs on the rabbits corneal stroma,and the green fluorescence for CK3 and CK12 was also seen in the hAMSCs.However,the response for CK3 and CK12 was absent in the control sections either immunochemistry or immunofluorescence test.Conclusions hAMSCs can be induced to differentiate into corneal epithelioid cells at an air-liquid interface on the rabbit corneal stroma.【总页数】5页(P991-995)【作者】肖盼;陈剑【作者单位】215500 常熟市第二人民医院眼科;516032广州,暨南大学附属第一医院眼科【正文语种】中文【相关文献】1.体外构建组织工程化心肌片层的实验研究 [J], 王静;王常勇;何文俊;段翠密;吕双红2.人羊膜间充质干细胞体外构建组织工程角膜上皮层的实验研究 [J], 肖盼;陈剑;3.丝素蛋白和乳酸-己内酯共聚物纳米纤维支架构建组织工程化角膜上皮的实验研究 [J], 李纲;钱婷婷;洪佳旭;徐建江;吴继红;崔呈俊;莫秀梅4.用MDCK细胞为种子细胞体外构建组织工程化肾小管片层的实验研究 [J], 高群;刘宇娜;吴杰;段翠密;王常勇;章烨;王滟濛;李德雪;吕双红5.复式滋养层培养法构建组织工程化小鼠角膜上皮的实验研究 [J], 马小力;孔珺;张劲松;刘汉强;赵江月因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人羊膜间充质干细胞培养方法的改进崔冬冰;范安然;何志旭【摘要】目的：建立一种高效分离培养人羊膜间充质干细胞的方法。
方法：分别用酶消化法、传统组织块贴壁法和改进的组织块贴壁法分离出hAMSCs，观察3种方法所获得hAMSCs细胞形态、获得时间，流式细胞学检测其免疫表型；并用不同的诱导体系将hAMSCs向成骨细胞、成神经细胞进行诱导分化，鉴定其分化潜能。
结果：改进的组织块贴壁法获得hAMSCs细胞的纯度更高，传代次数更多，相同的培养时间里，获得的细胞数量是酶消化法的3~4倍，是传统组织块贴壁法的1~2倍；hAMSCs细胞高表达CD73、CD90、CD44和CD105，不表达CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR；茜素红染色和神经元特异性烯醇化酶检测证实hAMSCs细胞可诱导分化为成骨细胞和神经细胞。
结论：改进的hAMSCs分离培养方法可获得较大数量细胞，且保留了向神经细胞或成骨细胞可分化潜能。
%[ Abstract]Objective:To investigate and improve the method of human amnion mesenchymal stem cellsseparation and culture( hAMSCs). Methods:The hAMSCs were established with the methods oftrypsin,collagenase II,traditional and improved tissueattachment,respectively. The cell morphology and the growth time of hAMSCs were observed,and the immunophenotype were also detected with flow cytometry. In addition,hAMSCs were induced to differentiate into osteoblast and neuroblast with dif-ferent system and the derived osteoblast and neuroblast were identified then. Results:The hAMSCs obtained with the improved separation method obtain higher purity and can be passaged more times, and the quantity of obtained hAMSCs can bereached up to 3~4 times of enzyme digestion,and 1~2 times of traditional tissue attachment method within the same culture time;furthermore,the obtained hAMSCs highly express CD73,CD90,CD44 and CD105 while did not express CD11b,CD19,CD34, CD45 and HLA-DR;the alizarin staining and neuron-specific enolase detection demonstrated that hAMSCs could be induced into osteoblast and neuroblast. Conclusions:The methods of hAMSCs sepa-ration and culture are improved and will provide the basis for the research and application of hAMSC.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2016(041)004【总页数】5页(P414-417,426)【关键词】人羊膜间充质干细胞;细胞培养;鉴定;诱导【作者】崔冬冰;范安然;何志旭【作者单位】贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R329.3间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有高度增殖和多向分化潜能的成体干细胞，来源广泛，可从多个器官或组织中分离获得，因具有低免疫原性等特点，而成为细胞疗法的主要种子细胞，有着广阔的应用前景[1]。
人羊膜上皮细胞和间质细胞的分离培养刘 芳,漆洪波(重庆医科大学附属第一医院妇产科,重庆 400016)提要:目的:探讨人羊膜上皮细胞和羊膜间质细胞的分离、培养及鉴定。
方法:取足月妊娠剖宫产术中的羊膜组织剪成碎片,胰蛋白酶消化15min,共四次,取消化液1000rpm 离心5min 收集细胞。
剩余羊膜组织加入1.0g/L 的胶原酶和0.1g/L 的D NA 酶,39e 消化120min,消化液1000rpm 离心5min 收集细胞。
用含10%胎牛血清的D MEM /F12培养液培养、传代。
倒置显微镜下观察其细胞形态及细胞生长情况。
通过免疫细胞化学的方法对细胞进行细胞鉴定。
结果:通过不同的酶消化分离法可以将羊膜上皮细胞和间质细胞进行细胞分离培养,羊膜细胞体外一段时间内表现出良好的细胞增殖能力和传代能力。
胰蛋白酶消化的细胞角蛋白染色呈阳性,波形蛋白染色呈阴性。
胶原酶消化的细胞波形蛋白色阳性,角蛋白染色阴性。
结论:羊膜上皮细胞和间质细胞能够在体外分离、扩增。
这为羊膜细胞进行细胞治疗和组织工程技术奠定了实验基础。
关键词:羊膜上皮细胞;羊膜间质细胞;细胞培养;细胞鉴定中图分类号:TN248.1 文献标识码:A 文章编号:0253-2743(2008)02-0086-02The primary culture and isolation of human amnion epithelial and mesenchymalLIU Fang,QI Hong-bo(The Fi rs t Affili ated Hos pital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,Chi na)Abs tract:O bjective:To investigate the isolation,culture and identification of human amniotic epithelial cells and mesenchymal cells.Methods :Amnion tis -sues were collected i mmediately af ter elective cesarean s ection from term placentas.The harvested pieces of tis sue were mechanically mi nced and treated 4times with 0.25%trypsin for 15minutes.The cells obtained duri ng trypsin treat ments were collec ted by centrifugation at 1000rpm for 5minutes.The remaining tis sue were i ncubated with 1.0g/L collagenas e and 0.l g/L DNase at 37e for 120mi nutes.The cells were collected by centrifugation at 1000rpm for 5minutes.Both cell types were c ultured in a complete medium c onsisting of D MEM /FI2and 10%fetal bovine serum for pri mary c ulture and pas sage.The cultured cells were in -ves tigated morphol ogically under i nverted microscope and were identified by i mmunohistochemistry.Resu lts:Human amniotic cells can be successfully i solated by trypsi n and colagenase res pectively,and the cells can proliferate and pas saged in vitro.for a certain peri od.Cells dispersed with trypsin stained posi ti ve for cytok -eratin and negative for Vimentin.Cell dis pers ed with collagenase stained negati ve for c ytokerati n and positive for Vi mentin.Conclus ion:Human amniotic epithelial and mesenchymal cells can be is olated and proli ferated in vitro.These findings suggest that amnion cells may be a practical cell source for cell therapy and tis sue engi neering.K ey words :amniotic epi theli al cells;amniotic mesenchymal cells;cell cul ture;cell identificati on 收稿日期:2008-01-08基金项目:国家自然科学基金项目(30772336)作者简介:刘 芳,重庆医科大学附属第一医院妇产科。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811259326.0(22)申请日 2018.10.26(71)申请人 陕西九州细胞基因工程有限公司地址 710000 陕西省西安市高新技术产业开发区科技六路196号(72)发明人 宋少锐 聂苏秦 朱艳丽 张博 (74)专利代理机构 北京汇信合知识产权代理有限公司 11335代理人 吴甘棠(51)Int.Cl.C12N 5/073(2010.01)C12N 5/0775(2010.01)(54)发明名称一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法(57)摘要一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于，包括：一、试剂；二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞；三、羊膜间充质干细胞传代培养。
本发明与现有的羊膜间充质干细胞分离方法相比，使用两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞，第一步去除羊膜上皮细胞，且消化两次，使羊膜上皮细胞去除的更充分，获得的羊膜间充质干细胞纯度更高，并且操作简单，无需组织及细胞过滤，使用DNase Ⅰ避免羊膜间充质干细胞进入消化粘液中而无法分离，获得的干细胞数量更多。
整个分离过程无动物源性成分，安全性好，便于后续的研究应用。
权利要求书2页 说明书5页 附图2页CN 109321517 A 2019.02.12C N 109321517A1.一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于，包括：一、试剂二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞三、羊膜间充质干细胞传代培养。
2.根据权利要求1所述的一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于：其中，一、试剂包括：1.胎盘保存液及清洗液；2.胰蛋白酶储存液；3.EDTA储存液；4.胶原酶Ⅰ储存液；5.DNaseⅠ储存液；6.培养基及原代培养基。
3.根据权利要求1所述的一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于：其中，二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞1.胎盘运输；2.羊膜分离组织分离；3.羊膜上皮细胞分离；4.羊膜间充质干细胞分离；5.原代换液。
(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210244029.9(22)申请日 2022.03.14(71)申请人 湖南源品细胞生物科技有限公司地址 410131 湖南省长沙市长沙经济技术开发区东五路南段102号中南源品干细胞科技园(72)发明人 颜腾龙 郑春兵 张群锋 谭湘芳 薛婷 刘珏 焦妙 张震 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569专利代理师 薛红凡(51)Int.Cl.C12N 9/76(2006.01)C12N 9/50(2006.01)C12N 5/0775(2010.01)(54)发明名称一种人羊膜间充质干细胞原代细胞分离用蛋白酶组合物及分离培养方法(57)摘要本发明提供了一种人羊膜间充质干细胞原代细胞分离用蛋白酶组合物及分离培养方法，属于原代细胞分离培养技术领域。
一种人羊膜间充质干细胞原代细胞分离用蛋白酶组合物，包括胰蛋白酶和复合型胶原酶。
本发明以羊膜组织为材料，采用胰蛋白酶去除羊膜上皮干细胞，利用复合型胶原酶进行组织消化，首次获得大量原代细胞，并且分离过程对细胞损伤小，获得的原代细胞增殖能力更强，细胞纯度更高；同时还可明显缩短组织消化时间，提高生产效率。
可见，本发明提供的分离培养方法为临床存储、间充质干细胞应用以及产业化转型提供基础。
权利要求书1页 说明书7页 附图8页CN 114457060 A 2022.05.10C N 114457060A1.一种人羊膜间充质干细胞原代细胞分离用蛋白酶组合物，其特征在于，包括胰蛋白酶和复合型胶原酶。
2.根据权利要求1所述蛋白酶组合物，其特征在于，所述复合型胶原酶的比活力为0.3～0.4U/ml。
3.一种人羊膜间充质干细胞原代细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将羊膜组织细化，经胰蛋白酶消化，得到消化后的羊膜组织块；所述消化后的羊膜组织块经复合型胶原酶消化，加入生理盐水，吹打混匀，分离细胞得到人羊膜间充质干细胞原代细胞。
动物细胞培养用“胰蛋白酶”还是“胶原蛋白酶”人教版高中生物学《选择性必修3·生物技术与工程》，对于细胞培养提到用“胰蛋白酶”、“胶原蛋白酶”处理，但没有说明二者区别并辨析相关原因。
从学生对相关问题的作答情况来看，不清楚“胰蛋白酶”和“胶原蛋白酶”的作用特点及情况。
那么，“胰蛋白酶”和“胶原蛋白酶”有什么区别？尽管胰蛋白酶和胶原蛋白酶都是细胞培养中常用于将体积较小的组织块分散成细胞团或单细胞的消化液，但它们的作用机制及适用情况并不相同。
1. 胰蛋白酶和胶原蛋白酶的作用特点1.1 胰蛋白酶的作用特点胰蛋白酶分离自牛、猪等动物的胰，作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽链，除去细胞间黏蛋白及糖蛋白，从而使细胞分离，是应用广泛的消化物，适于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织以及传代细胞等。
胰蛋白酶的消化作用与酶的浓度、pH、温度、组织块的大小以及组织的硬度都有关系。
胰蛋白酶浓度过大或消化时间太长，会导致细胞被消化；但反之消化不充分也达不到分散细胞的目的。
此外，血清明显抑制胰蛋白酶的活性，Ca2+和Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定抑制作用。
1.2 胶原蛋白酶的作用特点胶原蛋白酶是能在一定的pH 和温度下切割胶原蛋白主体螺旋多肽链的酶类，主要用于水解结缔组织中的胶原蛋白，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。
当拟消化的组织较硬，内含较多的结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞效果较差，可采用胶原酶解离细胞法。
钙、镁离子以及血清不会影响胶原酶的消化作用，其消化作用缓和，且无需机械振荡（表1）。
与胰蛋白酶不同的是许多动物的组织细胞和微生物都是它的来源，其中细菌是微生物胶原蛋白的主要来源，已发现40 多种。
目前商业化提供的细菌胶原酶主要根据胶原酶活性的差异，分为 4 种类型：（1）胶原酶Ⅰ型：含有比较均匀的各种酶活力（包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性），通常用作上皮细胞、肝、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的制备。
不同消化时间下胶原酶对人脐带间充质干细胞分离的影响郝世凯;苏相相;洪敬欣【期刊名称】《中国民族民间医药》【年(卷),期】2014(000)024【摘要】目的：比较胶原酶的不同消化时间，观察所获得的间充质干细胞的数量，确定最为理想的消化时间。
方法：分别采用3h、5h、7h的消化时间分离脐带间充质干细胞；通过传代进行纯化和扩增培养，绘制生长曲线；用流式细胞仪检测其表面标志。
结果：分离出的间充质干细胞贴壁后为梭形，呈平行排列生长或漩涡状生长，并且消化时间为5h时收获到的细胞数量最多；流式细胞仪检测结果显示，获得的间充质干细胞均表达CD73、CD105、HLA－ABC，不表达CD34、CD45、HLA－DR。
结论：胶原酶消化法从人脐带中分离培养的细胞具有间充质干细胞的生物学特性，并且消化5h收获得的间充质干细胞数量最多，生长状况最好。
【总页数】5页(P36-40)【作者】郝世凯;苏相相;洪敬欣【作者单位】协和干细胞基因工程有限公司，天津 300384;协和干细胞基因工程有限公司，天津 300384;协和干细胞基因工程有限公司，天津 300384【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.人羊膜间充质干细胞分离培养：胰蛋白酶及胶原酶消化时间及浓度的选择 [J], 张惠娟;丛姗;梁美萍;刘俊平;黄利刚;宋瑾;曹贵方2.人羊膜间充质干细胞分离培养：胰蛋白酶及胶原酶消化时间及浓度的选择 [J], 张惠娟;丛姗;梁美萍;刘俊平;黄利刚;宋瑾;曹贵方;3.胶原酶消化时间及质量浓度对大鼠胰岛细胞分离的影响 [J], 范宇;石炳毅;钱叶勇;杜源4.胶原酶浓度及消化时间对屠宰猪胰岛分离纯化的影响 [J], 李雪成; 姜利建; 崔成都; 朴明淑5.胶原酶浓度及消化时间对屠宰猪胰岛分离纯化的影响 [J], 李雪成; 姜利建; 崔成都; 朴明淑因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人羊膜间充质干细胞分离培养：胰蛋白酶及胶原酶消化时间及浓度的选择张惠娟;丛姗;梁美萍;刘俊平;黄利刚;宋瑾;曹贵方【摘要】背景：文献报道人羊膜间充质干细胞提取方法各不一致，得到的细胞数量各不相同。
目的：探索人羊膜间充质干细胞在体外分离培养的最适方法。
<br> 方法：无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片，分别通过4个实验7种方法体外培养人羊膜间充质干细胞。
①实验一：分别采用3种方法：0.05 g/L胰蛋白酶消化10 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min；0.75 g/L胶原酶Ⅰ直接消化120 min；0.05 g/L胰蛋白酶与0.75 g/L胶原酶Ⅰ同时消化60 min。
②实验二：采用0.05 g/L的胰蛋白酶消化30 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化30 min。
③实验三：分别采用2种方法：0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化30 min后，再加入0.75 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min；0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化40 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min。
④实验四：采用0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化30 min后，再加1 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min。
显微镜下观察其形态，研究人羊膜间充质干细胞在体外分离培养的最适方法。
<br> 结果与结论：用0.05 g/L的胰蛋白酶连续消化2次每次消化30 min，然后用1 g/L的胶原酶消化60 min是最合适的体外分离培养条件。
细胞成细长梭形或星形，胞质丰富，细胞核呈圆形，1-3个核仁。
说明实验四采用的胰酶和胶原酶消化的时间合适，而且胶原酶的浓度合适，得到的细胞数量最多。
%BACKGROUND:Extraction methods of human amniotic mesenchymal stem cells are inconsistent in the number of cells. <br> OBJECTIVE:To explore the optimal method to in vitro isolate and culture human amniotic mesenchymal stem cells. <br> METHODS:Under sterile conditions, ful-term cesarean fetal amniotic membrane was cut into pieces, then to isolate human amniotic mesenchymal stem cells by seven methods in four experiments. In experiment 1, human amniotic mesenchymal stem cells were isolated by the fol owing three methods:(1) 0.05 g/L trypsin digestion for 10 minutes fol owed by 0.75 g/L col agenase digestion for 60 minutes;(2) 0.75 g/L col agenase I for 120 minutes;(3) co-digestion with 0.05 g/L trypsin and 0.75 g/L col agenase for 60 minutes. In experiment 2, the samples were digested with 0.05 g/L trypsin digestion for 30 minutes fol owed by 0.75 g/L col agenase digestion for 30 minutes. In experiment 3, the samples were digested by two methods:(1) 0.05 g/L trypsin digestion for 30 minutes×2, fol owed by 0.75 g/L col agenase digestion for 60 minutes;(2) 0.05 g/L trypsin digestion for 40 minutes×2, fol owed by 0.75g/L col agenase digestion for 60 minutes. In experiment 4, the samples were digested with 0.05 g/L trypsin digestion for 30 minutes×2, fol owed by 1 g/L col agenase digestion for 60 minutes. Folowing morphology observation under a microscope, we studied the most suitable method for isolating human amniotic mesenchymal stem cells. <br> RESULTS AND CONCLUSION:Digestion with 0.05 g/L trypsin for 30 minutes twice fol owed by 1 g/L of col agenase digestion of 60 minutes was the most suitable isolation and culture condition in vitro. cells became elongated fusiform or star-shaped with rich cytoplasm, and nuclei were round with 1-3 nuts. We can harvest the most number of human amniotic mesenchymal stem cells using the method described in experiment 4.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】6页(P944-949)【关键词】干细胞;培养;间充质干细胞;羊膜间充质干细胞;细胞培养;胰蛋白酶;胶原酶;863项目【作者】张惠娟;丛姗;梁美萍;刘俊平;黄利刚;宋瑾;曹贵方【作者单位】内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction干细胞是一种能够自我更新且未分化的细胞，在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞两类[1]。
胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力[2-3]，但其伦理学争议严重影响并制约了临床应用研究进展。
成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织，传统的观念认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。
然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力，为临床应用这种多潜能细胞，治疗多种疾病带来了新的希望[4]。
间充质干细胞又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。
这种细胞具备干细胞定义的两个基本特性：①能够自我更新。
②可分化成两个或两个以上其他品系的细胞。
间充质干细胞是由早期中胚层发育而来的非造血成体干细胞，该细胞在体外可以贴壁生长，并呈现梭状[5]。
胞质丰富，细胞核呈圆形，1-3个核仁[6]。
在适当的条件下可以大量扩增，并转化为间充质祖细胞，进而分化成各种组织细胞，如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。
间充质干细胞除了具有多系分化的功能之外，还具有低免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节等功能，使其除了在治疗组织缺损、器官退行性疾病取得了重要进展以外，在肿瘤及免疫疾病治疗中也具有相当广泛的应用前景。
此外，一些研究学者还发现，基质干细胞具有类似免疫抑制剂作用，可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中的免疫反应，并同时抑制T细胞的异基因增殖反应。
据国外的一些临床试验和动物实验都己基本证实，成体干细胞有两个引人注意的生物学特性：一是成体干细胞注入体内后，有明显的趋向性，较明显集中到受损伤的部位；二是成体干细胞到达受损的部位后，在局部的微环境诱导，发生了明显的诱导分化，使成体干细胞向着已损伤组织修复所需要的细胞，进行了导向性的分化。
所以，近年来间充质干细胞已逐步成为干细胞研究的热点。
目前虽然骨髓仍作为是间充质干细胞的主要来源，但骨髓提取间充质干细胞为一个侵入性的过程，并且干细胞的质量和数量都随着供者年龄的增长而逐渐降低[7]。
其他组织中，如动员的外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干细胞，然而，从这些组织中获得的细胞数量较为有限。
所以，寻找更易获得、含量丰富并且易于培养的间充质干细胞新来源，对间充质干细胞的实验研究及临床应用，都具有重大意义。
以上因素，都限制了间充质干细胞在组织工程和临床中的运用。
羊膜是胎膜最内层，是由人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞组成，由胚胎羊膜囊壁发育而成，薄而透明，人羊膜间充质细胞来源于胚胎中胚层，而人羊膜上皮细胞来源于胚胎外胚层。
越来越多的研究已证实，人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞都具有干细胞的特征，羊膜在胎盘面与绒毛膜相贴，胎盘不只在胚胎的发育、营养、耐受力方面发挥作用，而且还具备一种潜在的干细胞能力。
当在母体内时，胚外中胚层来源的间充质干细胞不断的分化，成为由结缔组织形成的血管，而胚胎借此完成与母体的物质交换。
胎盘在胎儿分娩出生后就完成使命成为“废弃物”，在胎儿出生后常被丢弃。
