比较不同培养基培养脐带间充质干细胞

无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【摘要】目的用体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞.方法取1例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织块贴壁培养,使用无血清培养体系培养获得人脐带间充质干细胞.通过形态学观察,成脂、成骨、成软骨诱导分化能力检测及流式细胞术免疫表型检测进行鉴定.结果组织块贴壁培养6天后可见细胞从组织块边沿爬出;培养15天后,达到80％汇合,生长状况良好,细胞呈梭形,为典型的成纤维细胞形态,极性整齐排列,集落呈涡旋状,形态较均一.传代培养的第三代细胞CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,不表达CD34和CD45,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论无血清培养体系组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞法成功率高,其生物学特性稳定,并能消除由未确定的病原体引起的风险.【期刊名称】《皮肤病与性病》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】3页(P4-6)【关键词】脐带间充质干细胞;分离;贴壁培养【作者】张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【作者单位】昆明医科大学基础医学院,云南昆明650500;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101【正文语种】中文【中图分类】R392-33人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）是从人脐带组织中分离的间充质干细胞，具有增殖能力，如：神经元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞分化的能力，由于脐带体外细胞能迅速扩增，生物性能稳定，取材比较容易并且细胞来源相对广泛，在细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的前景，已经成为治疗的一种新的种子细胞来源[1、2]。

比较不同培养基培养脐带间充质干细胞作者：王蓓来源：《医学信息》2014年第20期摘要：目前的培养体系和培养方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培养基，但含血清培养基使临床细胞治疗受到限制，存在不安全因素。

通过对脐带间充质干细胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）及无血清培养基StemProRMSC SFM的培养扩增，比较三种培养体系的优略。

建立从减血清到无血清的培养体系，减少血清对临床细胞治疗的干扰，提高临床细胞治疗的稳定性与安全性。

关键词：有血清培养基;无血清培养基;脐带间充质干细胞随着对脐带间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，脐带间充质干细胞可在体外大量培养扩增，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛的功能。

同时脐带间充质干细胞还具有取材方便，无伦理学限制，免疫原性相对纯净的优势，可以为实验和临床提供足够的细胞来源。

1资料与方法1.1一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4℃保存，6h内无菌处理。

1.2脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank's液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton胶。

将其剪碎至1mm3组织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20~25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。

3~5h后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，正向放入体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。

72h后换液，一般5~7d可有间充质干细胞爬出。

1.3脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）、StemProR MSC SFM三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。

脐带间充质干细胞分离培养操作细则一、样本接收1.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。

2.查看客户信息是否与交接表一致。

3.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。

二、脐带间充质干细胞分离与接种1）准备耗材试剂：10cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、50ml注射器针头、封口膜、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、生理盐水、75%酒精（已过滤）。

2）仪器设备准备及预热：电动移液枪、生物安全柜、离心机3）将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。

4）将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，电动移液枪、移液管、离心管、离心管架喷酒精擦拭放入生物安全柜中，无菌棉球放入到广口瓶中加75%酒精放入生物安全柜中。

50ml、15ml离心管放到离心管架上，10cm皿5-7个。

将装有灭菌器械的灭菌盒喷酒精擦拭放入生物安全柜中。

5）取5个10cm皿依次摆开，1，2，4，5号皿依次加入适量的生理盐水，3号皿加入适量的已过滤的75%酒精。

拿出灭菌盒中已灭菌的止血钳，将脐带从保存瓶中取出放到第一个皿里，并取适量样本保存液留样送检支原体。

使用两个止血钳将脐带在第一个皿里清洗尽量去除脐带外表面的血污以及动静脉的血液和血凝块，将脐带转移至2号皿中，同样的方法再次清洗一次并测量其长度。

6）将清洗干净的脐带转移到装有已过滤75%酒精的3号皿中浸泡1min左右（不要超过两分钟），计时结束后，将脐带转移至4号皿中，同样的洗涤方法去除酒精。

清洗结束后将脐带剪成1-2cm短节，放入5号皿中，再次洗涤尽量去除血管内的血污。

再次拿两个10cm皿，加入适量的生理盐水，去一皿的盖子加少许盐水湿润底部及可。

7）将1-2cm的脐带小段转移到新的皿里，用带齿口的镊子取一段脐带，将脐带展开，再按血管走势剔除脐带的两条动脉，一条静脉。

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2018)13-02020-07 2020www.CRTER .org·研究原著·张学娟，女，1993年生，云南省大理州人，白族，昆明医科大学在读硕士，主要从事人脐带间充质干细胞与衰老相关研究。

并列第一作者：刘高米洋，女，1988年生，云南省宣威市人，汉族，2014年海军军医大学(原第二军医大学)毕业，硕士，医师，主要从事脐带间充质干细胞的临床转化研究。

通讯作者：潘兴华，博士后，主任医师，教授，解放军昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032中图分类号:R394.2 文献标识码:A稿件接受：2018-02-02Zhang Xue-juan, Master candidate, Kunming General Hospital Clinical College of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China; CellBiological Therapy Center of Kunming General Hospital of PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Region of Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of YunnanProvince, Kunming 650032, Yunnan Province, ChinaLiu Gao-mi-yang, Master, Physician, Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Region of Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of YunnanProvince, Kunming 650032, Yunnan Province, ChinaZhang Xue-juan andLiu Gao-mi-yang contributed equally to this work.无血清和有血清培养人脐带间充质干细胞的对比张学娟1，2，刘高米洋2，刘菊芬2，宋乙甲1，2，林庆铿1，2，白盈盈1，2，潘兴华2 (1昆明医科大学解放军昆明总医院临床学院，云南省昆明市 650032；2解放军昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0496 ORCID: 0000-0003-2572-725X(张学娟)文章快速阅读：文题释义：胎牛血清：含有细胞生长所需的基本营养成分和丰富的生物活性因子(如生长因子、激素、多肽类物质等)，在细胞的代谢、增殖与分化中发挥着重要的调节作用，用于临床规模生产间充质干细胞的大多数分离和扩增方案均使用补充有体积分数为10%胎牛血清的培养基。

脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养陈 镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王 玲3,陆 华3,吴智远2,芦 奕2(1.天津医科大学,天津,300070; 2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019;3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006)摘 要:目的 研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(M S Cs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。

方法 无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esen cult T M 作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测M SCs 表面抗原。

结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达M SCs 相关的抗原(CD 29、CD 44、CD 166),但不表达造血细胞抗原(CD 34、CD 45),这与源于骨髓的M SCs 一致。

结论 脐带血来源的M SCs 能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。

关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养中图分类号:R 329 2 文献标识码:A 文章编号:1672 2353(2004)01 0012 03THE ISOLATION PURIFICATION ANDCULTURE OF HUCA MSCsCHEN Lei,HUI Guo zen,RUAN Wen zong,MIAO Zong ning,WANG Ling,LU HUA,W U Zhi yuan,LU Li(1.T ianj in M edical Univer sity ,T ianj in,300070;2.Cell Dep ar tment,T hir d H osp ital of W ux i ,W ux i ,Jiangsu ,2140001;3.Dep ar tment of Neurosur gery ,First A f f iliated H osp ital of Suz houUniversity ,Suz hou,Jiangsu ,215006)ABSTRAC T Objective:To investig ate the isolation,purification and culture of hum an umbilical cord blood(HUCB)mesenchymal stem cells(M SCs)in vitro,and to observe the feasibility of using M SCs as seed cells in experiment and clinic.Methods:HUCB w ere collected from full term deliveries scheduled for cesarean section,all specimens w as obtained sterilely w ith preservative free heparin,the cord blood mononuclear cell w as isolated by lymphocyte separation medium,and puri fied and culture with M esencult T M medium and acidic environment to produce adherent layer,the surface antig en ex pression of MSCs was detected by flow cytometry.Results:The UCB derived mononuclear cells,when set in culture,gave rise to adherent cells,w hich ex hibited either an osteo clast or mesenchym al like phenoty pe,cells w ith the M SCs displayed a fibroblast like morpholog y and ex pressed several MSCs related antigens (CD 29,CD 44,CD 166),but did not ex press haematopoi etic cells antigens(CD 34,CD 45),which w as identical to human bone marrow derived M SCs.C on clusion:M SCs in H UCB can culture and expand in vitro,which could be regarded as an alternative source of MSCs for experimental and clinical needs.KEY WORDS umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;culture in v itro脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchy mal stem收稿日期:2003-12-16基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271325)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2001170)作者简介:陈镭(1965-),男,天津市人,在读博士研究生。

比较不同培养基培养脐带间充质干细胞目前的培养体系和培养方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培养基，但含血清培养基使临床细胞治疗受到限制，存在不安全因素。

通过对脐带间充质干细胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）及无血清培养基StemProRMSC SFM的培养扩增，比较三种培养体系的优略。

建立从减血清到无血清的培养体系，减少血清对临床细胞治疗的干扰，提高临床细胞治疗的稳定性与安全性。

标签：有血清培养基;无血清培养基;脐带间充质干细胞随着对脐带间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，脐带间充质干细胞可在体外大量培养扩增，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛的功能。

同时脐带间充质干细胞还具有取材方便，无伦理学限制，免疫原性相对纯净的优势，可以为实验和临床提供足够的细胞来源。

1资料与方法1.1一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4℃保存，6h内无菌處理。

1.2脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank’s液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton胶。

将其剪碎至1mm3组织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20~25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。

3~5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，正向放入体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。

72h后换液，一般5~7d可有间充质干细胞爬出。

1.3脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）、StemProR MSC SFM三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。

1.4 流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1×106个细胞，分别加入10μl单克隆抗体CD73、CD34、CD45、CD105、HLA-DR、HLA-ABC及阴性对照lgG1-PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min，PBS洗涤两次，室温300g，5min。

脐带MSCs培养操作规程
1 无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的PBS中，玻璃容器密封送回实验室；
2 超净台上剪取约2cm长的脐带，剖开动静脉，用PBS洗净血污；
3 将脐带剪碎成肉糜状，转移到离心管中，可按以下两种方法分离脐带间充质干细胞：①加入4ml的消化液（含0.25%胰酶，200~400U 胶原酶Ⅱ/ml的PBS液），混匀，37℃中消化1小时，每隔10分钟振摇一次；②加入4ml消化液（200~400U胶原酶Ⅱ/ml的PBS液），混匀，37℃中消化过夜；
4 吸取消化上清，转移到25cm2细胞培养瓶中，加入DMEM/F12培养基（含10~15%胎牛血清），37℃、5%CO2孵箱培养；
5 约三天左右能在显微镜下观察到贴壁细胞，半量换液后继续培养，三天后换液，细胞已经能稳定生长。

每三天换液一次，至细胞生长铺满瓶底（约10天左右），即可进行传代；
6传代时去除培养基，用PBS洗涤贴壁细胞一次，加入3 ml的消化液（含0.25%胰酶的PBS液），37℃条件下作用10min左右，加入等体积含血清的培养基中止消化，吸管轻吹贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液；将细胞悬液转移到15 ml离心管中，800rpm离心5min，弃上清，用适量DMEM/F12培养基重悬细胞，传代比例为1:2，接种量为5ml/瓶，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。

7 细胞冻存时，按传代的操作步骤获得细胞沉淀，用冻存液（90%FBS ＋10%二甲基亚砜）重悬细胞，调整细胞浓度为1×108/ ml，将细胞悬液转移到冻存管中，1ml/管，用程控降温仪降温后转移到液氮中冻存。

(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection.2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, /sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days.（二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged.(三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。

不同培养基培养脐血间充质干细胞的比较作者：王丽娟来源：《赤峰学院学报·自然科学版》 2011年第7期王丽娟（赤峰学院医学院，内蒙古赤峰 024000）摘要：比较不同密度下DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基培养脐血间充质干细胞的效果,发现应用IMDM培养基以2.0×106个细胞/ml的密度接种在培养瓶底可以完全铺层,而且加入碱性成纤维细胞因子可以显著加快脐血间充质干细胞的贴壁、伸展和铺层的速度.关键词：脐血间充质干细胞；培养基；生长过程中图分类号：R329 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2011）07-0037-02实验证明间充质干细胞（MSC）存在于身体的很多部位，骨髓和脐血是间充质干细胞的最主要来源.体外分离培养骨髓间充质干细胞已被广泛应用于各研究领域，而对人脐血中的MSC的研究尚处于起步阶段.在培养方面还没有统一的方法,培养的方案也各不相同.本试验分别应用DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基对脐血单个核细胞进行培养，比较不同细胞密度下各种培养基培养脐血MSC的效果，并对培养出的脐血MSC的生长过程进行了研究.1 材料和方法1.1 脐血新鲜脐血由赤峰学院附属医院提供.在征得产妇同意后，无菌条件下采集新生儿脐血，用肝素抗凝.1.2 脐血MSC的分离和培养取血后12h内,用Ficoll-Hypaque分离液分离单个核细(MNC),并用PBS培养液洗涤3次,然后分别用含20%的胎牛血清(杭州四季青)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的IMDM 完全培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的DMEM-LG培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的DMEM-HG培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的α-MEM培养基调整细胞密度，每种培养基各自调整的密度分别为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0×106/ml,种植于培养瓶中,然后于5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养.2 结果2.1 不同培养条件对脐血间充质干细胞的贴壁、生长的影响在使用同一批号血清的情况下，几种培养基培养脐血间充质干细胞的情况如下：DMEM-LG 培养基和DMEM－HG培养基有大量的细胞贴壁，但贴壁的细胞形状多样，有圆形、椭圆形、多角形等不规则形状，生长缓慢，随着培养天数的增加，贴壁的细胞都脱落下来.α-MEM培养基仅有少量的细胞贴壁，且贴壁的细胞是圆形或椭圆形，扁平的，几乎无生长，随着培养天数的增加，也都脱落下来.IMDM培养基培养出的细胞呈纤维状，形成克隆，并逐渐扩张.2.2 脐血间充质干细胞的最适接种密度细胞以不同密度接种于培养瓶中，并于倒置显微镜下进行观察.结果发现，在各个密度下，DMEM-LG培养基、DMEM－HG培养基和α-MEM培养基均没有完全铺层，20天后都脱落下来.而应用IMDE培养基，以0.6～0.9×106个细胞/ml的密度接种后，细胞贴壁稀疏甚至不贴,间距大,生长缓慢，随培养时间的延长,贴壁的细胞也都从瓶底脱落下来.以密度为2.0×106个细胞/ml接种时，细胞活性好，生长旺盛，形态为有规则的束状.密度在4×106/ml及其以上时，细胞生长拥挤，培养基消耗快，短时间内变黄，虽有大量细胞贴壁，但细胞贴壁不牢固.经过3次换液后，大部分贴壁细胞又都脱落下来.由此可见，最适合细胞贴壁的接种密度在2.0×106个细胞/ml左右.密度高于或低于2.0×106个细胞/ml，细胞不贴壁或贴壁状态不好.2.3 脐血间充质干细胞的生长过程脐血单个核细胞接种后，定期显微镜观察：24h可见细胞贴壁，最初细胞为圆形或不规则散在分布，有时与破骨细胞混杂存在.48h可见贴壁细胞增多，细胞周边开始伸出小突起，细胞呈条形或多角形（图A）.72h更多的细胞伸出突起，且细胞突起变长变大，折光性强，为类似成纤维细胞样的长梭形细胞，少数细胞可见微绒毛（图B）.1周可见成纤维细胞样的长梭形细胞更多，有的细胞开始接触（图C）.2周可见细胞集落融合成片，细胞排列有一定的方向性，呈漩涡状生长（图D）.3 讨论目前大量的研究已经证明脐血中存在间充质干细胞，本试验的结果也证明了这一结论.但是脐血中的MSC的量要小于骨髓中的MSC的量，而且也并不是每份脐带血中都能培养出间充质干细胞，培养条件各家实验室的报到也不尽相同.本实验在加入同一批次的胎牛血清和20μg/L的bFGF的条件下比较了DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基培养脐血MSC的效果，发现IMDM培养基培养的细胞能够伸展且在培养瓶底部形成一层同源的纤维细胞层，可见本试验条件下IMDM培养基效果较好.不同的培养密度对细胞的生长也有影响，密度过低，细胞相互作用较少，联系少，细胞很难生长；密度过高，细胞过于拥挤，接触抑制，也很难生长，且培养基中的营养很快被消耗掉，为补充营养需频繁换液，细胞未牢固贴壁就掉下来，更不利于细胞的生长.本试验在贴壁较好的IMDM培养基的条件下2.0×106个细胞/ml是最适合细胞贴壁的接种密度.本试验培养基中加入了20μg/L的bFGF，从培养结果发现加入bFGF后比未加任何外源性生长因子[1]培养的脐血MSC贴壁要早，伸展的也要早，且能提前2周在培养瓶底完全铺层,这结果也与俞猛等报到的bFGF能够促进间充质干细胞的增殖的结果一致[2].这一试验对脐血MSC的培养条件进行了初步的研究，至于脐血MSC细胞间相互作用的机制及其分化、分化机制和分化后移植效果都有待于进一步研究.——————————参考文献：〔1〕王丽娟,张叶萍,王金福，等.脐血间充质干细胞的生物学特性及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用.[J]中华血液学杂志,2005,26(2):65-68.〔2〕俞猛，夏仁云，高飙，等.bFGF和地塞米松对骨髓基质干细胞增殖与分化的影响[J].中国康复,2006,21(1):12-15.。

1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。

去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。

充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。

静置培养7天。

第8天根据生长情况，进行换液、传代。

2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。

用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。

3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。

1200rpm，离心6min，弃上清。

合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。

根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。

4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。

1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。

加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。

弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。

冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。

利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。

小鼠脐间带充质干细胞培养方法引言充质干细胞（me se nc h ym al st em ce ll s，M SC s）是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，具有广泛的应用前景。

在生物医学领域，小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的来源之一。

本文将介绍小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，帮助研究人员更好地利用这一珍贵的细胞资源。

原料与试剂准备1.小鼠脐带组织2.DM EM/F12培养基3.胎牛血清（F BS）4.细胞培养袋5.1×PB S缓冲液步骤1.小鼠脐带的处理（1）准备一个无菌操作台，并在工作区上喷洒酒精消毒剂，手套等工具也需要经过灭菌处理。

（2）取出小鼠脐带组织，置于无菌的1×P BS缓冲液中，用剪刀剪碎细胞片段。

（3）将小鼠脐带组织片段转移到细胞培养袋中。

（4）加入适量的DME M/F12培养基，保证组织片段被完全浸润。

（5）将细胞培养袋密封，并置于37°C恒温培养箱中，进行消化和悬浮培养，时间约为4-6小时。

2.细胞的收获和培养（1）将消化后的细胞悬液通过100μm的细胞滤网过滤，去除大颗粒残渣。

（2）将滤液离心，去除上清液，沉淀的细胞用DM EM/F12培养基洗涤。

（3）将洗涤后的细胞沉淀用适量的D MEM/F12培养基重新悬浮。

（4）将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，每瓶加入适量的培养基和10%的F BS。

（5）将细胞培养瓶放置于37°C恒温培养箱中，进行培养。

（6）每2-3天更换一次培养基，保持细胞的健康生长。

3.细胞的传代与冻存（1）当细胞达到80-90%的密度时，将培养瓶内的细胞用1×P BS缓冲液洗涤。

（2）用胰酶对细胞进行消化，停止细胞的生长。

（3）加入适量的DME M/F12培养基，将细胞悬液转移到新的细胞培养瓶中。

（4）将细胞培养瓶放置于恒温培养箱中继续培养。

4.脐带间充质干细胞的鉴定（1）使用流式细胞仪对培养的小鼠脐带间充质干细胞进行免疫鉴定。

产品描述人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基操作手册产品规格：400mL产品货号：PD-019人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基专门为人脐带间充质干细胞成脂诱导分化而开 发，针对人脐带间充质干细胞的特性优化分化试剂的配方，可增加人脐带间充质干细胞的成脂 分化效果。

本产品含血清成分，仅用于科研用途，不可用于诊断、治疗、临床及其他用途。

培养基组成成分●人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基 ADP1：成分名称添加体积175 mL 20 mL 2 mL 2 mL 400μL 200μL 200μL 人脐带间充质干细胞成脂诱导分化诱导基础培养基 ADP1FBS谷氨酰胺 Glutamine青链霉素 Pennicillin-Streptomycin胰岛素 InsulinIBMX罗格列酮 Rosiglitazone地塞米松A Dexamethasone 200μL●人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基 ADP2（维持培养基）成分名称添加体积人脐带间充质干细胞成脂诱导分化基础培养基 ADP2175 mL FBS20 mL 谷氨酰胺 Glutamine2 mL 青链霉素 Pennicillin-Streptomycin2 mL 胰岛素 Insulin 400μL油红-O 染色液 10 m L操作流程一、人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基的准备注：各成分请根据试剂管上标签标示温度保存。

地塞米松A和地塞米松B浓度不同，不能混用。

染色液1.本产品为试剂盒型，使用前需将试剂盒内各成分试剂混匀。

（请勿将 ADP1 与 ADP2混淆）2.使用前，请将血清置于4℃解冻，直至血清完全溶解；待血清完全溶解后，将所有添加物置于室温溶解。

待试剂完全溶解后，轻轻摇晃使试剂混合均匀（低于 500μL 体积的试剂无需此操作）。

注：为了保证微量试剂的使用效果，请将低于 200μL 的试剂管进行短暂离心，使试剂能全部收集至管底。

3.按上述两个成分表，将表一 ADP1 中的 FBS、青链霉素、谷氨酰胺、胰岛素、IBMX、罗格列酮、地塞米松A等试剂按体积大小先后加入到诱导基础培养基中；混合均匀后做好标识，培养基即可使用。