下载文档原格式
基因打靶技术在基因治疗中的应用研究随着科技的不断进步和人类对基因的认知不断加深，基因治疗已经成为目前生物医学领域的一个热点研究方向。
而基因打靶技术作为基因治疗中的关键技术之一，具有极大的潜力和前景。
一、基因治疗的定义和技术路线基因治疗是利用基因工程等技术手段，修复或替换人体细胞或组织中缺乏或异常的基因，治疗基因疾病的一种新型治疗方法。
基因治疗技术的基本路线为：构建治疗基因载体，将治疗基因载体导入患者体内，使其达到治疗目的。
二、基因打靶技术的定义和研究进展基因打靶技术是指通过分子遗传学技术寻找特定基因，选定治疗目标基因，研发相应的基因治疗药物，增强治疗效果，减少不良反应和副作用的技术手段。
随着生命科学的发展，基因打靶技术也逐渐成熟。
例如，目前已经有基于基因打靶技术开发的CAR-T细胞疗法、CRISPR/Cas9基因编辑技术等。
这些技术的成功应用使得基于基因打靶技术的基因治疗开始进入实际应用阶段。
三、基因打靶技术的优势和不足相比于传统的治疗方法，基于基因打靶技术的基因治疗在很多方面具有明显的优势。
例如，它能够精确定位治疗目标，防止将治疗药物引入错误的细胞或组织中。
同时，基因打靶技术能够减少不良反应和副作用，提高治疗效果。
但是，基因打靶技术也存在一些不足之处。
其中一个主要问题是基因打靶技术难以获得指定的治疗效果，因为基因在人体内的调控非常复杂。
此外，基因治疗在实际应用中的安全性和有效性也需要得到进一步的验证。
四、基因打靶技术在基因治疗中的应用基因打靶技术在基因治疗中有多种应用方式。
例如，可以利用基因打靶技术研发出针对特定疾病的基因药物，帮助患者达到治疗目的。
同时，基于基因打靶技术的CRISPR/Cas9基因编辑技术也可以在基因治疗中发挥重要作用，例如在癌症治疗中使用。
此外，基因打靶技术还可以用于：研究基因表达调控网络，发现新的治疗靶点；研究基因遗传变异，寻找遗传性疾病的发生机制以及治疗方法等。
五、结语基因治疗作为一种新型的治疗方式，正得到越来越多的关注和研究。
基因打靶技术研究进展及其应用王建刚西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌 712100摘要：基因打靶技术是2O世纪8O年代发展起来的新技术，是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞（ES细胞）技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的实验手段，具有定位性强、打靶后新的基因有随染色体DNA稳定遗传的特点，其方法包括基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等，相关的基因工程技术包括转基因、基因沉默和基因捕获技术等。
为生命科学、基因组学和疾病治疗等领域的研究提供了强大的工具。
文章将主要介绍基因打靶技术的发展简史、近期进展以及在模式动物中的应用。
关键词：基因打靶同源重组 ES细胞转基因动物基因治疗瑞典皇家卡罗琳外科医学研究院诺贝尔生理学或医学奖评审委员会2007年l0月8日宣布，美国科学家卡佩基（Mario R Capecchi）、史密斯（Oliver Smithies）和英国科学家埃文斯（Martin J Evans）因在“涉及使用胚胎干细胞进行小鼠特定基因修饰方面的一系列突破性发现”而获得2007年度诺贝尔生理学或医学奖。
这三位科学家的研究工作为“基因打靶”（gene targeting）技术奠定了基础。
1 基因打靶技术1.1 基因打靶的概念基因打靶就是利用细胞染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质，通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定位点，以达到定点修饰和改造染色体上某一基因为目的的一项技术。
通过基因打靶技术可以对生物体（尤其是哺乳动物）基因组进行基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体大片段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系遗传，使遗传修饰生物个体表达突变性状成为可能。
1.2 基因打靶技术建立的意义“基因打靶”技术是分子生物学技术上继转基因技术之后的又一革命。
它“开创了全新的研究领域”，克服了基因随机整合的盲目性和危险性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法，尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确，它的发展为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供一个全新的研究手段；它的应用涉及基因功能的研究、生产具有商业价值的转基因动物和植物、异体动物器官移植和人类疾病的基因治疗对攻克人类疾病等诸多方面起到了重大作用，该技术一经公布，就广泛应用于基因功能研究、生物制药等方面。
基因打靶基因打靶研究背景显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的。
可能导致下面几种情况出现：1导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺失；2导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；3外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；4导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。
解决办法：将外源基因导入预先确定的位点。
即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶。
什么是基因打靶基因打靶(gene targeting)技术也称为基因定点同源重组，是利用基因转移方法, 将外源DNA序列导入靶细胞后, 通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上的同源DNA序列间的重组, 将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点, 或对某一预先确定的靶位点进行定点突变, 从而改变细胞遗传特性的方法。
它是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。
基因打靶原理生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。
同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。
ES细胞是一类具有在体外培养件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。
首先获得ES 细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES 细胞。
通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES 细胞引入受体胚胎内。
经过遗传修饰的ES 细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。
基因敲除技术的优势与劣势分析与对比评价与前景展望与预测与前瞻展望基因敲除技术是一种目前广泛应用于生物学研究和药物开发领域的重要工具。
它通过干扰特定基因的表达，从而揭示基因功能并帮助研究人员理解疾病的发生机制。
本文将对基因敲除技术的优势、劣势进行分析与对比评价，并展望其未来的发展前景。
首先，基因敲除技术的优势之一是能够直接改变目标基因的DNA序列，从而达到完全失活的效果。
相比其他基因编辑技术，如基因编辑酶等，基因敲除技术能够高效地突变目标基因，避免了需改变具体位点的限制。
这使得基因敲除技术更加灵活、易于操作。
其次，基因敲除技术可以帮助研究人员确定基因的功能和生理作用。
通过敲除目标基因，研究人员可以观察到该基因在生物体内的影响，例如疾病模型中敲除特定基因后是否出现相应的疾病表型。
这有助于揭示基因对生物体的影响机制，是功能基因研究的重要手段。
此外，基因敲除技术还可以用于药物研发和治疗策略的发展。
通过敲除某些疾病相关基因，研究人员可以模拟和研究疾病发生机制，寻找可能的治疗靶点。
这为药物研发提供了新的思路和选择，并可以用于筛选潜在的治疗靶点和药物效果评估。
然而，基因敲除技术也存在一些劣势和挑战。
首先，基因敲除是一种非常粗糙的方法，它不能精确地敲除目标基因的所有亚型或突变，可能会导致一些并发症或不可预测的效果。
这限制了基因敲除技术在一些特定研究领域的应用。
其次，基因敲除技术在体内和体外试验中难以实现目标基因的全面敲除。
由于机体组织和胚胎发育的复杂性，以及细胞分裂和自我修复机制的存在，对于一些目标基因，完全敲除是一项挑战。
这可能会导致实验结果的不确定性，并限制了基因敲除技术在某些实际应用中的可行性。
虽然基因敲除技术具有一些劣势，但其在生物学研究和药物开发中的重要性不可忽视。
随着技术的不断发展和突破，相信基因敲除技术将会逐渐克服这些劣势并取得更好的表现。
未来，基因敲除技术有望在许多领域展现出更大的前景。
首先，基因敲除技术将在治疗疾病和发展个性化医疗方面扮演重要角色。
基因工程的应用与前景人类对基因的研究始于二十世纪初，但真正的突破性进展出现在二十一世纪初期。
随着科技的飞速发展，基因工程成为改造生命的重要途径之一，其应用涉及医学、农业、工业等多个领域。
本文将从多个角度阐述基因工程的应用与前景。
一、基因工程在医学领域的应用基因工程已经成为了现代医学的重要手段。
在疾病的诊断、治疗、预防等方面都有重要应用。
例如，使用 CRISPR-Cas9 技术可以定向修改基因组，从而治疗一些传染性疾病，如艾滋病、肝炎等。
在艾滋病治疗方面，CRISPR-Cas9 技术可以靶直接清除感染细胞中携带艾滋病病毒的 DNA，从而清除该病毒。
另外，基因工程还可以用来诊断一些难以确定的生殖疾病，如染色体畸变，这可以通过基因重组技术来实现。
同时，基因工程还可以开发新型疗法，如蛋白质疗法和基因疗法等，用来治疗某些疾病。
二、基因工程在农业领域的应用基因工程也被广泛应用于农业中。
通过基因工程可以克服作物生长中存在的一些障碍，提高生长速度，增加产量，也可以提高农产品的营养价值和抗病能力。
例如，将耐旱、耐盐等耐逆性基因插入农作物，可以大大提高其逆境抗性能力，提高作物的产量。
另外，通过插入特定的基因，作物可以产生更高的营养价值，例如，可以使大米、面包等食物更富含有益营养素，如维生素和蛋白质等。
插入抗病毒基因等后改造的作物可以更快的适应气候环境，从而更好的生长。
三、基因工程在工业中的应用基因工程在工业中也有一定的应用。
例如，用 E.coli 或酵母细胞通过 DNA 重组合成蛋白质生产线可以发展生产人工蛋白、胰岛素等制品。
同样的测序技术和分离基因组的工具也被应用于开发生物材料，例如一次性自溶性医用缝线，生物材料提取等。
四、基因工程面临的困境及未来的发展虽然基因工程带来了很多科学技术的突破，但对其发展的质疑也不容忽视。
一些质疑围绕着基因工程的影响事物，例如基因工程在遗传材料中引入的不安全基因的使用等，存在诸多的质量和安全问题。
基因工程在农业领域的应用和前景展望近年来，基因工程技术在农业领域的应用已经取得了可喜的进展，为农业生产提供了新的解决方案。
基因工程技术可以通过改变作物的基因组来增加其产量、提高其抗病虫害能力、提升其抗逆性，从而为解决全球粮食安全问题提供了新的途径。
本文将探讨基因工程在农业领域的应用现状，并展望其未来的前景。
基因工程技术的应用使得农作物育种变得更加精确和高效。
利用基因工程技术，科研人员可以在作物中引入新的基因，使作物具有抗病虫害、抗草害、耐旱、耐盐等优良性状。
例如，转基因玉米、转基因大豆等转基因作物已经广泛应用于农业生产中。
这些转基因作物在耐虫、耐草、耐不良环境等方面表现出色，不仅提高了作物的产量和质量，还减少了对农药的依赖，降低了农业生产的环境污染。
此外，基因工程技术还可以帮助改良作物的品质。
通过基因编辑技术，可以删除或修改作物中不良基因，增加或改良有益基因，从而提高作物的口感、食用价值和药用价值。
例如，利用基因编辑技术改造番茄中的味觉基因，使其产生更好的口感，改良香蕉的维生素含量等。
这些技术的应用有望进一步提高作物品质，满足人们对食品品质的需求。
基因工程技术还可以用于改良农作物的耐逆性。
随着全球气候变化的加剧，干旱、高温、病虫害等逆境对农作物的生长和产量产生了不可忽视的影响。
基因工程技术可以通过引入耐旱基因、耐高温基因等方式来提高作物的抗逆性能力，增强其适应环境的能力。
例如，研究人员利用基因工程技术成功培育出耐旱的水稻品种，使其在干旱条件下保持更高的产量。
这种技术的应用将有助于提高农作物的适应性，减少逆境对农业生产的影响。
尽管基因工程技术在农业领域的应用前景广阔，但也面临着一些挑战和争议。
其中之一是公众对转基因食品的担忧。
尽管科学界普遍认为转基因食品没有明显的安全问题，但公众普遍对其持谨慎态度。
因此，为了推广基因工程技术在农业领域的应用，必须加强对公众的科学宣传，增加公众对基因工程技术的了解和接受度。
基因打靶技术及其应用前景摘要: 基因打靶技术是一项新兴的分子生学技术,综述了基因打靶技术的原理、操作以及应用与研究进展。
关键词:基因打靶;同源重组;打靶载体;打靶效率;筛选系统基因打靶是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,是利用基因转移的方法,将外源DNA序列导入靶细胞后,通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的重组,将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定位点,或对某一预先确定的靶位点进行定点突变,从而改变细胞遗传特性的方法[1]。
作为一项新兴的技术,基因打靶有着其无可比拟的优点:基因打靶所适应的细胞既可以是原核细胞,也可以是真核细胞;基因打靶能把外源基因引入染色体DNA的特定片段上;在设计合理的情况下,基因打靶可对宿主细胞染色体基因进行精细的改造;基因打靶后被击中的基因或新引入的基因随染色体DNA的复制而稳定复制[2]。
目前,基因打靶技术已应用在改造生物,培育新的生物品种,研究基因结构与功能、表达与调控,研究细胞生活周期调控机制,遗传病的基因治疗等方面。
尽管还存在着一些技术问题,但随着研究的深入,基因打靶技术正在不断发展与完善。
1基因打靶技术的原理进行基因打靶,首先要设计和合成一个靶载体。
该载体不仅含有需要插入的DNA序列,其两端还含有与靶基因座上的序列相同的核苷酸片段,即同源重组指导序列[3]。
将此载体用基因转移的方法导入靶细胞。
通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶细胞特定的基因座上。
同源重组的分子机制目前尚未阐明,但已相继提出了多种解释同源重组的模型,其中Meselson—Radding 模型不仅可以解释交互重组的现象,而且还可以圆满地解释基因转变现象,因此被广泛接受[4-6]。
但Szostak 等提出的双链断裂修复模型(DSBR)能更好的解释双链断裂可以大大提高同源重组的效率这一现象[7]。
2基因打靶的操作2.1基因打靶载体的构建基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列,其中同源序列是同源重组效率的关键因素,基因打靶载体的同源重组序列一般可通过特异性探针从基因组DNA文库中分离得到,也可以利用PCR 对基因组目标的DNA序列进行扩增得到[8]。
基因同源重组的发生依赖于同源序列的长度,目前认为30～40 bp的同源序列长度将是同源重组发生的保险线。
实验表明,在哺乳动物细胞内,当同源序列长度在295～1 800bp之间时,重组率与同源序列长度呈正比,当同源序列长度在200bp以下时,重组效率明显降低。
这对选择合适的同源重组指导序列长度具有重要的指导意义[9]。
一般情况下,同源重组指导序列为基因组DNA而不用cDNA,以免造成基因组缺失或形态改变。
基因打靶载体有基因插入型载体和基因置换型载体2种类型。
插入型载体与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点,线性化后,同源重组导致基因组序列的重复,从而干扰目标基因的功能。
置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因的外侧,线性化后,同源重组使染色体DNA序列被靶载体序列替换。
大多数基因敲除突变都采取置换型载体进行基因打靶。
外源DNA导入的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等[10]。
目前应用最广泛的是显微注射法。
逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力,可用于时空特异性的基因打靶,在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。
2.2受体细胞转化由于在同源序列附近的DNA有双链断裂能促进同源重组,因此在完成打靶载体的构建后,以限制性酶线性化载体并已去除质粒部分,用电穿孔、显微注射、DNA—磷酸钙共沉淀、脂质体包装和PEG介导等方法把上述重组DNA片段转入受体细胞核内[11]。
2.3筛选基因打靶的筛选系统多种多样,现今采用的一般有:①选择标记基因定点突变的筛选;②正向选择法;③无启动子筛选法;④正负筛选法。
这里主要介绍正负筛选法[12]。
用选择培养基筛选已击中的细胞,筛选通常使用正、负选择法。
构建载体时,在靶基因的同源序列中插入正选择标记,在同源序列之外的γ末端,甚至γ和ζ 2个末端接上负选择标记。
转化受体细胞的过程中如果所导入的重组DNA与受体细胞基因组DNA发生非同源重组,则外源基因通常是从头至尾均整合进入受体细胞基因组中,此时正、负筛选标记基因同时表达,若为同源重组,外源目的基因及正选择标记会整合到受体细胞基因组同源序列的基因座上,而位于同源序列外端的负选择标记基因则在重组后丢失[13,14]。
因此时仅有正筛选标记基因表达。
例如,实验室常以新霉素抗性记忆(neo’)为正标记基因,以单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)作为负筛选基因,以药物G418和GANC(丙氧鸟苷)作双重选择,其中neor基因的产物使细胞具有G418抗性,而HSV-tk基因的产物则使丙氧鸟苷变成毒性核苷酸,从而致死[15]。
用G418筛选所有能表达neor基因的细胞,然后用GANC淘汰所有HSV-tk正常表达的细胞,剩下的细胞即为命中的细胞。
2.4鉴定观察被击中细胞的生物学特性,并进行分子生物学检测。
可以用特异PCR的方法鉴定,即:PCR引物一端以基因组DNA的特定基因座为模板,另一端以导入的外源基因为模板,这样保证扩增后的片段为同源重组产生的特殊片段。
对经PCR 鉴定的克隆用Southern杂交产生特殊带谱的方法来进一步确定同源重组克隆[16]。
3基因打靶技术的应用与研究前景3.1基因功能和基础理论研究方面首先,基因打靶通过定点改造基因组中的特定基因,有可能在细胞水平上研究特定基因的功能和调控机制。
从定点突变的干细胞获得突变基因型个体,为在生物体整体水平了解基因的胚胎发育和生理功能提供了可能。
3.2分子免疫方面可用基因打靶观察某一基因对免疫细胞发生发展的影响。
例如,Manjunath等(1993)用基因打靶技术破坏了CD43基因,结果提高了T淋巴细胞的粘附性,为进一步观察和探讨一些免疫机制奠定了基础。
3.3病理模型方面自Garrd发现Alkaptonuria遗传病以来,研究者们发现,许多遗传病都是由单个基因突变引起的。
用基因打靶技术对小鼠或其他哺乳类动物中此类单基因进行定点突变,就可为人类该基因缺陷或突变所致的遗传病建立精确的动物模型,为了解这些遗传病的病理生理生化特性及寻找适当的药物和治疗手段奠定基础。
到目前为止,已得到Lesch-Nyh-ansyndrome、Cysticfibrosis和Gaucheris等多种病理模型。
例如,构建定点突变的小鼠凝血因子IX胚胎干细胞(ES)基因打靶载体,在小鼠IX因子基因第8外显子中分别引入3个突变,构建置换型打靶载体转染ES细胞,经药物筛选后,挑取抗性细胞,这种体外定点突变系统可对大基因进行精细地修饰,为建立更精确的模拟人类疾病的动物模型奠定基础。
3.4基因治疗方面据统计,到1998年为止,正在进行的临床基因治疗方案有278项。
但是,近年来的研究表明,外源基因的导入有可能导致一些与预想目的相悖的结果,如使正常基因失活或激活原癌基因等。
因此,要利用基因打靶技术用于疾病治疗,造福人类,还需要不懈的理论研究和实践检验[17]。
3.5转基因动植物和生物反应器方面转基因技术就是将体外重组的结构基因导入动植物体内,使外源基因与动植物本身的基因整合在一起,实现体内表达,从而培养出转基因动植物的技术。
其特点是可以使动植物增加某一功能或某一产物,但是,由于转基因在动植物细胞基因组中的整合是随机性的,因此,它的发展和应用受到了一定的限制。
如果应用基因打靶技术把外源基因准确地插入受体细胞的基因组中,定点改造原有基因的功能,可使转基因动植物和生物反应器的研制更为精确。
基因打靶技术是近10余年发展起来的分子生物学技术,它克服了随机整合的盲目性和偶然性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
随着现代分子生物学技术的发展和人类基因组图谱的完成、功能基因组学研究正大规模启动,基因打靶已经成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。
因此,通过基因打靶将外源基因在ES细胞或体细胞中进行定点整合并高效表达、利用显微注射和核移植技术生产转基因动物等具有广阔的发展前景。
4参考文献[1] 高正琴,邢华,李厚达.基因打靶技术及其研究进展[J].上海实验动物科学,2002(2):126-130.[2] 刘红全,戴继勋,于文功,等.基因打靶技术的研究进展[J].遗传,2002(6):707-711.[3] 李瑞国,安晓荣,苟克勉,等.基因打靶技术及其应用前景[J].生物技术通报,2002(5):6-9.[4] 李坚,戴旭明,杨桦,等.定点突变小鼠凝血因子IX胚胎干细胞基因打靶载体的构建[J].中华医学遗传学杂志,1999(6):11-14.[5] 周倩,刘文忠.基因打靶技术及其应用[J].动物科学与动物医学,2003(10):25-27.[6] CAPECCHI M R.Gene Targeting[J].Scinetific American,1994,270(3):34.[7] TYBULEVICE V L J,TREMBLAY M L,LAMARCA M E,et al.Animal model of Gaucher’s disease from targeted disruption of the mouse glucocerbrosidlase gene[J].Nature,1992(357):407-410.[8] 施家琦,夏家辉.真核生物中基因打靶的策略[J].生命科学研究.1999,3(2):96-100.[9] THY KJAER T,FINNEMANN J,LEIF S,et al.Plant molecular[J].Bio-logy,1997(35):523-530.[10] 白雪源,陈香美.基因打靶技术及其在生物医学中的应用[J].中华肾病杂志,2000,16(6):403-405.[11] YU J,HU S N,WANG J,et al.A draft sequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.indica)[J].Science,2002,296(5565):79-92.[12] GOFF S A,RICKE D,LAN T H,et al.A draft sequence of the rice genome(Oryzasativa L.ssp. japonica).Science,2002,296(5565):92-100.[13] SASAKI T,MATSUMOTO T,YAMAMOTO K,et al.The genome sequ-ence and structure of rice chromosome 1[J].Nature,2002,420(6913):312-316.[14] FENG Q,ZHANG Y J,HAO P,et al.Sequence and analysis of rice chrom-osome 4[J].Nature,2002,420(6913):316-320.[15] BREYNE P,ZABEAU M.Genome-wide expression analysis of plant cell cycle modulated genes[J].CurrOpinPlantBiol,2001,4(2):136-142.[16] RAY A,LANGER M.Homologous recombination:ends as the means[J].Trends in Plant Sci,2002,7(10):435-440.[17] PUCHTA H.Gene replacement by homologous recombination in plants[J].Plant Mol Biol,2002,48(1-2):173-182.。
