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综述与讲座肿瘤的多药耐药及耐药逆转剂研究李秀荣1 吕翠霞2 宋茂美1综述 焦中华1审校【关键词】 恶性肿瘤;化学药物治疗;多药耐药;机制;耐药逆转剂中图分类号:R73-36;R730.53 文献标识码:A 文章编号:1009-4571(2000)01-0073-04 目前,尽管不断有新的化疗药物和化疗方案推出,但肿瘤细胞对多种化疗药物产生的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)仍是化疗失败的主要原因。
所谓MDR系指肿瘤对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时,对其他许多结构各异、作用机制不同的抗肿瘤药物亦产生交叉耐药现象。
MDR现象可以原发性和继发性两种形式出现。
原发性(primary resis-tance)是肿瘤细胞固有的对化疗药物不敏感,故首次使用化疗药物就产生耐药;继发性(secondary re-sistance)则是初始对化疗药物敏感,但经过几个疗程化疗后,对化疗药物产生耐药。
肿瘤细胞的MDR 现象是肿瘤治疗中最常见和最棘手的问题,要提高恶性肿瘤化疗的有效性,就必须深入研究MDR的机制及寻求有效的逆转MDR的对策。
1 MDR的机理研究肿瘤的MDR现象产生的途径较多,有其复杂的分子学基础,目前,MDR的机理研究主要包括以下几个方面。
1.1 多药耐药基因及其编码的P-糖蛋白过度表达化疗药物问世不久,临床上就发现了多药耐药现象,如对阿霉素耐药的肿瘤细胞能对多种从未使用过的化疗药物如长春碱类和表鬼臼毒素类产生耐药。
1976年Juliano等[1]在耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现了一种分子量为170kD的糖蛋白,被命名为P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)。
P-gp在敏感细胞中通常检测不出,而在MDR细胞株中却有高水平表达。
P-gp是一种分子量为170kD的跨膜糖蛋作者单位:1济南市(250011) 山东中医药大学附属医院内科肿瘤血液病组2济南市(250014) 山东中医药大学基础学院白,由人类MDR基因家族中与耐药有关的MDR1基因编码[2]。
中医药逆转肿瘤多药耐药机制研究进展标签：肿瘤；多药耐药；逆转机制；中医药；综述据美国癌症协会统计，90%以上的肿瘤患者死于不同程度的耐药[1]。
肿瘤细胞耐药可分为原药耐药（PDR）和多药耐药（MDR）两大类。
其中，PDR指仅对诱导药物产生耐药性而对其他药物不产生交叉耐药性；而MDR是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药的同时，对其他结构不同、作用机制不同的药物也产生耐药现象，是肿瘤化疗最大的障碍之一。
研究MDR的产生机制、寻找有效低毒的逆转剂及其逆转措施一直是国内外学者感兴趣的研究课题。
笔者现将近年来中医药有关MDR的研究综述如下。
1 肿瘤多药耐药的产生机制1.1 转运蛋白介导药物外排药物在细胞内的减少是通过药物的细胞内流减少或外排增多所产生，细胞外排可以通过细胞膜上转运蛋白功能而发挥作用，如P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药性相关蛋白（MRP）及肺抗药性相关蛋白（LRP）等，其中P-gp外排泵的研究最为深入和广泛。
P-gp高表达导致细胞内的药物浓度维持在较低水平被认为是产生MDR最主要的原因。
研究表明，MDR-l基因与P-gp的表达水平越高，MDR 细胞内药物浓度越低，则耐药性越强[2]。
该研究结果被称作经典肿瘤MDR机制。
1.2 细胞内多药耐药相关酶表达异常在MDR细胞的胞质、胞核中存在一些与MDR产生有关的酶，主要是蛋白激酶C（PKC）、拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）以及谷胱甘肽S转移酶（GST）等的改变。
韩氏等[3]研究发现，PKC-2α在胃癌细胞SGC7901呈阳性表达，在其长春新碱（VCR）耐药株SGC7901/VCR呈强阳性，其表达强度随耐药剂量的增加而呈增加趋势。
在MDR细胞中因TopoⅡ数量及其活性下降所导致的耐药机制被称为非典型MDR，其特点是药物在细胞内积聚与保留没有变化，无P-gp的过度表达，膜活性药物不能逆转其耐药性。
研究发现，TopoⅡ在胃癌组织中的表达显著高于其相邻正常组织（P＜0.05），表明TopoⅡ是胃癌产生内在性耐药的影响因素之一[4]。
综述肿瘤的多药耐药及其逆转剂研究进展安徽省肿瘤医院桂留中化疗仍是恶性肿瘤的重要治疗手段之一, 然而肿瘤细胞的耐药常使化疗最终失败。
根据肿瘤细胞的耐药特点, 耐药可分为原药耐药( Primary drug resistance,PDR) 和多药耐药( Multidrug resistance ,MDR) 。
PDR只对诱导药物产生耐药而对其它药物不产生交叉耐药性, 如抗代谢药类; MDR则是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药产生抗药性的同时, 对其它结构和作用机制不同的抗肿瘤药产生交叉耐药性。
MDR的表现十分复杂, 既可有原发性( 天然性) 耐药, 也可有诱导性( 获得性) 耐药; 还有典型性和非典型性耐药之分。
由于MDR给化疗带来了困难, 近年人们对其产生的机制以及试图寻找逆转剂做了大量的工作。
本文简介MDR产生的机制并着重介绍近年逆转剂的研究进展。
1.MDR产生的机制1.1膜糖蛋白介导的机制1.1.1 P-gp与MDR 1976年Ling等首先在抗秋水仙碱的中国仓鼠卵巢细胞株上发现了一种能调节细胞膜通透性的糖蛋白( P-glycoprotein,P-gp) ,因其相对分子量为170kd, 又称P-170。
[1]。
P-gp主要分布在有分泌功能的上皮细胞的细胞膜中, 在人类正常组织中有不同程度的表示, 其中肾上腺、肺脏、胃肠、胰腺等组织中表示较高, 而在骨髓中表示较低。
P-gp属于ATP结合盒家族的转运因子, 其生理功能为在ATP供能下将细胞内的毒性产物泵出细胞, 对组织细胞起保护作用。
P-gp由mdr1基因编码产生。
人类mdr1基因位于7号染色体长臂2区一带一亚带( 7q21.1) 。
1986年, Gros将编码P-gp的mdr1cDNA直接转染敏感细胞后, 转染细胞表现出完全的MDR 表型, 从而提供了P-gp能够导致多药耐药的有力证据。
现已证明, 许多肿瘤原发性或获得性耐药均与P-gp过量表示有关。
P-gp随mdr1基因扩增而增加。
P-gp有多个药物结合位点, 因而具有多种药物泵出功能, 不过其底物多为天然性抗癌药如长春碱类、蒽环类、紫杉醇类和鬼臼毒素类等。
由于P-gp 能逆浓度差将药物泵出胞外, 使细胞内药物浓度降低, 从而减弱了药物的细胞毒作用。
1.1.2 MRP与MDR 1992年Cole等在两种非P-gpMDR细胞中发现了一种膜转运蛋白基因过度表示, 并由其命名为mrp基因。
该基因位于人类染色体16q13.1, 由其编码组成的跨膜糖蛋白称为多药耐药相关蛋白( Multidrug resistance-associated protein ,MRP) , 相对分子量为190kd, 也属于ATP依赖性跨膜转运蛋白类。
MRP的MDR相对机制与P-gp相似又有不同, 相似的是都可依赖ATP供能将药物泵出细胞外, 不同的是: ① MRP转运时或与GSH结合, 或与GSH共转运, 改变药物在胞内的分布以降低核内药物浓度, 从而使药物在DNA靶点的绝对浓度降低; ②经过形成CL通道或改变通道活性而改变细胞质或细胞器内的pH值, 而肿瘤细胞内pH值降低将导致质子化的药物大量外排。
MRP与P-gp之间存在交叉耐药种类, 包括长春碱类、阿霉素、足叶乙苷等, 均为能与GSH共结合的药物[1, 2,3]。
1.1.3 LRP与MDR 1993年Scheffer发现小细胞肺癌中有lrp基因表示, 该基因定位于16q13.1-16q11.2, 编码相对分子量为110kd蛋白, 称肺耐药相关蛋白( Lung resistance-associated,LRP) 。
该蛋白是穹隆蛋白的主要成分, 阻止以细胞核为靶点的药物经过核孔进入胞核, 并将进入胞浆的药物转运到运输囊泡中, 以胞吐的方式排出胞外, 从而影响胞内的药物转运与分布, 致靶点药物浓度下降, 但亦依赖ATP 供能。
LRP分布在人体体腔上皮、分泌器官等正常组织中, 也不同程度地分布于各种肿瘤组织中。
LRP不但对蒽环类、生物碱类、鬼臼毒素类产生耐药, 也对以DNA 为靶点的非P-gp和MRP介导耐药的顺铂、卡铂等烷化剂产生耐药。
1.1.4 BCRP与MDR 1998年美国3个不同的研究小组相继报道无P-gp和MRP表示的乳腺癌耐药细胞系以及结肠癌耐药细胞系发现新的肿瘤耐药蛋白。
后经RNA指纹分析技术发现, 这些肿瘤细胞有一2.4kb的mRNA过度表示, 该mRNA编码一种655个氨基酸的蛋白质, 被命名为乳腺癌耐药相关蛋白( BCRP) 。
该蛋白也是依赖ATP供能将化疗药物泵出细胞外导致MDR。
免疫荧光显像证实BCRP主要位于细胞膜上, 参与膜内外药物的转运, 而不是像MRP那样主要改变药物在胞内的分布。
过度表示BCRP的肿瘤细胞株对米托蒽醌、阿霉素、柔红霉素、鬼臼乙叉苷、喜树碱类产生交叉耐药, 而对长春新碱、紫杉醇等较少交叉耐药。
1.2 酶介导的MDR1.2.1谷胱甘肽转移酶( GST) 与MDR GST是机体中催化GSH与亲电物质发生结合的一类酶系, 是由同源或异源二聚体组成的超基因家族, 到当前为止, 共发现5类, 即α、ζ、μ、θ、π。
其中GST-π与恶性肿瘤关系最为密切.GST-π可催化亲电子物质与GSH结合,形成GSH-药物结合物,增加其水溶性促进代谢,最终将毒物从尿中排出或降解为无毒性的醇类物质,从而降低抗肿瘤药物的细胞毒作用.其主要介导顺铂、烷化剂、蒽环类的耐药.研究表明,肿瘤耐药程度与GST-π表示高低成正比.1.2.2拓扑异构酶( Topoisomeras, TOPO) TOPO是一种能催化DNA超螺旋结构局部构型改变的基本核酶, 分为Ⅰ、Ⅱ两类。
其中TOPOⅡ与细胞耐药关系密切。
TOPOⅡ是依托泊苷、替尼泊苷及蒽环类等的作用靶点。
肿瘤细胞由于快速增长的特性, 其TOPOⅡ含量及活性远高于正常细胞。
含量越高, 抗肿瘤药物作用靶点越多, 化疗效果越好, 反之效果差。
已证明一些耐药肿瘤细胞内TOPOⅡ含量下降或活性减弱。
因此TOPOⅡ含量可作为化疗的一个敏感性指标参数。
此种耐药并不伴随P-gp或MRP的表示, 因此又称为非典型性耐药。
1.2.3蛋白激酶C(PKC)与MDR PKC是一组Ca/磷脂依赖的同工酶, 几乎参与所有MDR 的调节。
P-gp是PKC催化磷酸化的底物, P-gp磷酸化后可被激活。
PKC也可使MRP、LRP、 GST和TOPOⅡ磷酸化而被激活。
1.2.4 环氧化酶( Cyclodxygenase,COX) 是前列腺素合成过程中的关健酶, 是一种膜结合蛋白, 存在于核膜和线粒体上。
其中COX-2是诱导型酶。
近来一些研究表明, COX-2不但经过多种机制参与肿瘤的发生发展和预后, 还可能参与MDR的调节: 人和鼠COX-2基因侧翼区含2个NF-kB结合位点, COX-2可能经过NF-kB途径调节P-gp 的表示; COX-2的催化产物PGE2可使PKC上调而活化P-gp和MRP。
一项研究表明[4], 54例非小细胞肺癌中, COX-2阳性表示率为59.3%, P-gp表示率为46.3%, 相应癌旁正常组织未见COX-2表示; 在COX-2阳性组中, P-gp阳性表示率65.6%, 明显高于COX-2阴性组的18.2%。
刘军等[5]检测48例胃癌组织中COX-2阳性为29例( 60.4%) , P-gp阳性31例( 64.6%) ; 29例COX-2阳性者中有24例P-gp表示阳性。
1.3 凋亡调控基因介导的MDR1.3.1 P53基因 P53基因位于17号染色体短臂, 因编码相对分子量为53kd的核磷酸蛋白而命名。
P53基因有两种: 野生型和突变型。
野生型是抑癌基因, 可诱导肿瘤细胞凋亡, 控制处于生长停止状态的静止期细胞从G0期到G1期的转变。
野生型P53产物P53蛋白半衰期较短, 一般无法用免疫组化法检测到。
突变型不但失去抑癌基因的作用, 而且导致癌细胞凋亡信号丧失, 从而增加癌细胞对抗癌药物诱导凋亡的耐受力。
野生型P53能从基因转录水平抑制P-gp表示, 而突变型P53将失去此作用, 甚至能激活mdr1基因下游启动子转录活性, 从而导致耐药。
突变型P53基因所表示的蛋白结构改变, 半衰期延长, 而且易检测, 广泛存在于多种肿瘤组织中。
当用免疫组化法在癌组织中检测到P53蛋白时, 便可认定P53基因发生了突变。
1.3.2 bcl-2家族 bcl-2家族是一类与细胞凋亡有关的基因家族, 也是一个同源蛋白家族。
Bcl-2是抑制细胞凋亡的重要基因, 是决定肿瘤预后的重要指标。
该基因表示增强能显著抑制细胞凋亡。
Bcl-2不但促进化疗和放疗的耐受, 而且提高肿瘤复发率和恶变的潜力。
1.4 其它DNA的去甲基化: 当前, DNA甲基化作为一种基因外遗传信号逐渐为人们所熟知。
DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下, 以S-腺苷甲硫氨酰为甲基供体, 将甲基转移到胞嘧啶的第5位上。
启动子区域的甲基化对基因的表示有明显的抑制作用。
1997年Kusaba等[6]首先提出, 甲基化可能是调控mdr1基因表示的开关。
该研究小组将携带人mdr1基因的酵母人工染色体转染至小鼠细胞中,用长春新碱诱导成耐药株,然后将其与敏感株比较.结果显示,耐药株mdr1基因的选择性表示增高,同时该基因5,端呈低甲基化状态,推测用化疗药物后,mdr1基因编码的P-gp表示增高可能与该基因的5,位启动子区域的去甲基化状态有关.朱燕等[7], 也发现AL和MM患者骨髓mdr1基因表示水平与基因转录起始点上游110和150处的2个CCGG位点的甲基化程度呈负相关.另外,葡萄糖神经酰胺合成酶的过表示[8]、肿瘤细胞的乏氧以及细胞内pH值降低均可导致肿瘤细胞的MDR.2.MDR的逆转从上看出肿瘤的多药耐药机制十分复杂,多数肿瘤细胞中几种耐药基因同时存在。
张燕等[9]检测120例成人常见肿瘤标本P-gp、MRP、LRP、GST、TOPO-Ⅱ的表示,结果2种或2种以上耐药基因的表示率达95.83%,5种耐药基因共表示率达21.67%。
虽然有些细节还有待进一步证明,但P-gp介导的耐药最为常见,其机理也较为清晰,当前的逆转剂大多针对P-gp发挥作用.2.1化学药物逆转剂包括钙通道拮抗剂、环孢素类、蛋白激酶抑制剂等.前二者本身就是P-gp的底物,可与化疗药物竞争性地与P-gp结合,从而增加细胞内药物浓度.最常见的就是维拉帕米、尼卡地平等。
体外测定维拉帕米浓度为 2.5ug.ml-1时,KBV200对长春新碱的IC50从1152nmol.L-1降至253nmol.L-1,当维拉帕米浓度为10ug.ml-1时,其IC50降至13.5nmol.L-1,也即长春新碱对KBV200的细胞毒性增加84倍[10].另一项研究表明[11],裸鼠口服维拉帕米20mg.kg-1与丝列霉素联用,抑瘤率由35.79%提高到73.24%.陈贤鸿等[12]用尼卡地平抑制肝耐药细胞BEL-7402/ADM增殖时发现,5.0ug.ml-1的尼卡地平与ADM合用时,ADM的IC50显著降低,细胞内ADM浓度升高,且呈剂量依赖性.江清林[13]用环孢素A逆转多药耐药取得良好的临床效果。
