基因工程 第五章 基因转化

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第三节 重组子的筛选
一、遗传表型直接筛选 载体有标记基因，转化细胞出现特殊的表型 特性。 1、抗药性筛选 载体有抗药性标记。转化受体在含有药物的 培养基上正常生长，未转化的菌不能生长。

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2、显色互补筛选法 载体上有Lac Z基因， 含有外源DNA的菌落为白色，没有的菌 落为蓝色.
具有细胞全能性，单细胞可培养成植株。 • 将细胞去壁后成为原生质体，可直接转 入基因，也可利用基因枪或农杆菌介导 转入外源基因。

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四、动物细胞
多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞 常用受体细胞有小鼠L细胞、Hela细胞、 中国仓鼠卵巢细胞等。

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第二节 重组DNA分子转入原核细胞
重组DNA分子转化大肠杆菌 转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白 结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳 定维持和表达的过程。
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电转移：转移电泳槽 电场的作用使凝胶中的DNA转移到尼龙 膜上。 不能用硝酸纤维素膜

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电转移的一般过程：
首先进行DNA电泳 对电泳后DNA进行碱变和中和处理。 尼龙膜、滤纸及海绵也在缓冲溶液中充分浸泡。 将凝胶与尼龙膜贴紧，外侧各贴一张滤纸。 再其外是起保护作用的海绵。 该体系夹在多孔的支持夹中 固定在电泳槽内，浸泡在电泳缓冲溶液中。 通电进行转移。 取下膜，80度烘烤1-2h或紫外交联使DNA稳定结合在膜上， 将膜放在已变性的探针溶液中进行核酸杂交。 洗去没有杂交的探针 显色，
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一、 Ca2+诱导大肠杆菌转化法 1、感受态细胞的制备 感受态细胞：是指处于能吸收周围环境 中DNA分子的生理状态的细胞。 CaCl2冷处理是制备E.coli.感受态细胞的 最常用方法。
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2、过程： 培养生命活动旺盛的菌体：进行菌种的 活化，扩大培养，最适条件下培养至细 胞密度达5× 106 ~2 × 107 个/mL（A600 为0.4），处于对数生长期 沉淀菌体：取3-4mL菌液在冰水浴中预冷 10min，然后在4℃ 下以适当速度离心沉 淀菌体，5000g离心5min。

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取下膜，80度烘烤1-2h或紫外交联使DNA稳定结 合在膜上， 将膜放在已变性的探针溶液中进行核酸杂交。 洗去没有杂交的探针 显色，

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酶切
电泳
电泳后 变性
玻璃板
干燥滤纸 缓冲液浸 湿的滤纸
硝酸纤维素膜 电泳缓冲液
杂交
显色
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Southern 印迹时间取决于NDA片段的大小 1kb以下1小时 15kb要18小时 如大于15kb，可进行水解成小片段来提高转移 效率 但不能太小，否则会影响片段与膜的结合，并 且产生较大的扩散作用。
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第四节 核酸探针与分子杂交
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一、探针标记
探针(probe):用于检测样品中是否含有待测核 酸的已知核酸片段。 选择的原则：高度特异、来源方便。
探针的来源：人工合成
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探针的种类： A、基因组DNA探针： B、cDNA探针：无高重复序列、无内含子， 不易获得。 C、人工合成寡核苷酸探针（适于点突变）

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凝胶支持夹
海绵 凝胶 海绵 凝胶支持夹
滤纸 尼龙膜 滤纸
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-
+
湿式电转移装置结构示意图
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凝胶支持夹
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硝酸纤维素滤膜（NC膜）的不足之处： NC膜依赖疏水性相互作用结合DNA，不牢 固。 质地较脆，易碎。 NC膜对小分子DNA片段结合力不强。 NC膜的结合依赖高盐浓度，不适宜于电转 移。
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2、DNA分子转化： 0.2ml感受态细胞中加入0.1ml DNA， 冰浴1h以上，期间轻摇几次。 转移至42 ℃水浴2min。 马上转到37 ℃水浴中温育5min，加入 1ml不含选择药物的LB液体培养基。 37 ℃振荡培养30-60min，然后铺板培养 筛选。
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二、转化率的计算及其影响因素
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2、缺点： 无折叠系统，真核基因表达后，蛋白可能 结构不正确 无修饰系统，真核基因表达后，蛋白不同 被修饰。 E.coli.有蛋白酶，外源蛋白不稳定。
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3、E.coli. 优点：繁殖快，培养简单，代谢易于控制。 缺点：有内毒素
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4、枯草杆菌 具有大肠杆菌的所有优点。 基因表达产物可分泌到培养基中，简化蛋 白的提取和加工。 真核生物的重组蛋白被分泌后便具有天然 构象和生物活性。 无内毒素，安全。
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一、原核生物细胞
1、优势： 大部分没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于DNA 进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合蛋白质，这 为外源DNA与染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，无线粒体和质体基因组，便于对引入 的外源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞，容易获得一致性的实验材 料，培养简单，繁殖迅速，周期短，重复快。

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缺点
一、核幅射对人体损伤； 二、污染环境； 三、探针使用时间短，常用的32P半衰期14.3天； 四、依赖进口和价格昂贵。
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标记方法
缺口平移法。
dTTP 32 DNA聚合酶I
5` 3`
dCTP 32 dGTP
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dATP32
3` 5`
dTTP 32 dATP32
dCTP 32 dGTP
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优点：快速、节时、经济 缺点：目的序列与非目的序列未分离，不能了 解目的序列的长度。 用途：基因分析、基因诊断、基因表达
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3、菌NC膜上， •溶菌、变性的DNA与滤膜原位结合； •烤干合DNA固定在滤膜上 •与探针杂交； •漂洗除去杂质探针， •检测杂交信号 •根据杂交位置，对照原来的平板，从中挑选 出对应的菌落或噬菌斑。
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Northern blot
Alwine等1979年应用于• RNA• 研究上。测定细胞的 总RNA或mRNA。 过程：将各种RNA进行琼脂糖凝胶电泳，然后将 RNA从凝胶上转移到NC膜上，并与探针杂交。 印迹过程类似于Southern blot。但有区别。
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区别1： 防止RNA形成高级结构，采用变性电泳。 不能采用碱变性，常用的变性剂：甲醛、 乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺等。
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非放射性标记物
优点：无污染、可保存2年以上。 缺点：灵敏度低。
基本思想
将可催化显色反应的酶与核酸的碱基连接， 以示踪。
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直接标记 方法：化学法将酶结合在核酸上。 缺点： 1. 酶是大分子，可能会因结构大而影响分子杂 交。 2. 标记后酶活性可能会受到影响。
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间接酶标法
常用方法：先将较小的分子标记在核酸上， 再通过一个既能该小分子结合又与酶结合 的蛋白质把酶间接地与核酸连接。 小分子：生物素和半抗原(如地高辛) 常用的酶：辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶 和碱性磷酸酶. 常用的小分子及酶的结合物：抗生物素抗 体、抗半抗原抗体等。
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二、真菌细胞
常用酵母菌 可进行无性繁殖的单细胞生物。

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优势： 结构简单，基因表达调控机理清楚，遗传 操作相对简单。 有蛋白翻译后修饰加工系统。 不产生毒素，安全。 培养简单，利用大规模生产，成本低廉。 能将表达产物分泌至培养基中，便于产物 的提取和加工。
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三、植物细胞
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化合物处理：将沉淀的菌体悬浮在相当
于原体积的含CaCl2无菌预冷缓冲溶液中 （50-100mmol/L CaCl2 、10mmol/L TrisHCl, pH8.0）。置冰水浴15min后，4 ℃ 下放置12-14h，不要剧烈振荡。 如此制备的感受态细胞在1-2d内能有效 吸收DNA分子。
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1. 膜上印迹杂交
印迹：经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，通 过毛细管作用或电导作用，被转移到滤膜上。
膜：硝酸纤维滤膜、尼龙膜等。
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Southern blot：
步骤： 首先进行DNA电泳 对电泳后DNA进行碱变性和中和处理。 平铺在用电泳缓冲溶液饱和的两张滤纸上， 在凝胶上覆盖一张硝酸纤维素滤膜， 滤膜上压一叠干燥滤纸， 滤纸上压一重物。 由于干燥滤纸吸水，凝胶下缓冲溶液向上移动，凝胶中 DNA便随之转移到纤维素膜上。 取下膜，80度烘烤1-2h或紫外交联使DNA稳定结合在膜上， 将膜放在已变性的探针溶液中进行核酸杂交。 洗去没有杂交的探针 显色
1、转化率：DNA分子转化受体菌获得转化 子的效率。 转化子数与用于转化的DNA质量的比。 转化子数与用于转化的细胞数的比。
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2、影响转化的因素： DNA越小越容易，亲和性越强越容易。 不同受体菌细胞不同。 不同转化方法不同，电穿孔法最高、 Ca2+ 转化法居中、三亲杂交法最低。

尿素和甲酰胺可引起琼脂糖固化 只能用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。 羟甲基汞毒性较大。 乙二醛操作不如甲醛变性凝胶电泳简单。
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区别2： 电泳时要求低电压，3-4V/cm。电泳时缓 冲溶液要不断循环，或30min换一次。 区别3 为防止RNA被降解要抑制Rnase的作用。
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Western blot
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二、依据重组子结构特征筛选 1、酶切鉴定 从受体细胞中提取质粒DNA， 酶切质粒DNA 电泳检测酶切产物的大小。
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Marker
空质粒
酶切产物
目的基因
质粒
目的基因
图 酶切鉴定
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2、利用PCR方法筛选 从受体细胞中提取质粒DNA 利用载体或插入片段两端的已知序列合 成引物进行PCR 电泳检测PCR结果，判断否转化成功。
第五章 目的基因导入受体 细胞
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