基因工程第五章克隆重组体的构建转化PPT课件

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基因的克隆与表达课件

----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统

基因克隆载体构建和转化学习PPT教案

质粒PCR
• 选2-3个菌落PCR鉴定出的菌落 • 5-6ml LB 液体培养基(加Amp,1000倍母液)过夜, 37度培养. • 在超净台各取1ml菌于1.5ml 无菌离心管内于4度保存 • 同时取0.5ml菌液,加入0.1ml无菌甘油,混匀,-40或－80度保存. • 剩余菌液用于提质粒, 用质粒做模板,进行PCR鉴定
涂平,放在超净台上 5) 最后涂平板时一定要涂匀,并等到表面干燥后再用封口膜封好,
倒色菌斑,重新在新的LBA平板上划线培养12h左右. • 在超净台上用白色枪头挑去微量菌落加入PCR混合物中,进行PCR鉴定 • 程序同上, 30循环,退火温度降低
• 侵染： • 收种子：2－3次 • 筛选：收完及时筛选
电泳检测:
6－10ul 上样即可加Maker（3ul）：分子量是否正确是否有非特异条带(若有,提高退火温度)
电泳及凝胶成像系统操作:
1) 电泳缓冲液倒入专门的广口瓶内 2) 制胶板, 梳子要及时清理 3) 凝胶成像系统操作区为非污染区,勿污染 4) 扫胶后立即关掉紫外灯 5) 图片保存后关掉凝胶成像仪开关 6) 最后关掉电脑
若能扩增出分子量正确的单一条带: 1) PCR循环调为26-28个 2) 模板量增加 3)更换保真性高的的Taqase,
如:LATaq (扩增长度1kB以上) Pfu Taq (保真性最高,但需要加尾)
取6ul电泳检测,剩余-20保存, 连接用
若用Pfu 酶,则需要加尾
2.连接到测序载体并转化大肠杆菌
PCR程序: 根据要扩增的长度调整:
退火温度(52-68度) 延伸时间:rTaqase: 1kb/分钟
其它酶略长
PCR仪:要登记, 正确操作, 用完关掉电源,拔下电源插头或关掉插排电源, 盖子半盖, 盖上罩子

《基因工程说课》课件

《基因工程说课》ppt课件
CATALOGUE
目录
• 基因工程简介 • 基因工程的基本技术 • 基因工程实验操作流程 • 基因工程的安全与伦理问题 • 未来展望
01
CATALOGUE
基因工程简介
基因工程的定义
基因工程是指通过人工操作将外源基因导入细胞或生物体内，以改变其遗传物质，从而达到改良生物性状、生产生物制品或治疗遗传性疾病目的的技术。
基因工程是生物工程的一个重要分支，它利用分子生物学和分子遗传学的原理和技术，对生物体的遗传物质进行操作和改造。
基因工程的基本操作包括基因克隆、基因转移、基因表达和基因沉默等，这些技术为人类提供了强大的工具来探索和利用生命系统的奥秘。
基因工程的历史与发展
基因工程的起源可以追溯到20世纪70 年代初期，当时科学家们开始探索限制性内切酶和DNA连接酶等基本工具，
健康风险
基因工程可能对人类健康产生负面影响，如基因治疗中的副作用。
安全风险
基因工程可能被用于制造生物武器或生物恐怖主义。
基因工程的伦理问题
人类基因编辑
基因资源与知识产权
基因工程应用于人类胚胎编辑可能引发一系列伦理问题，如设计婴儿等。
基因资源属于全人类共享的遗产，涉及知识产权和利益分配问题。
为基因操作奠定了基础。
1973年，美国科学家斯坦利·柯恩和赫伯特·博耶利用限制性内切酶和DNA连接酶，成功地将SV40病毒的DNA切割并重新连接，从而实现了第一个重组
DNA分子。
自此以后，基因工程技术不断发展，逐渐形成了完整的理论体系和技术体系，并在医学、农业、工业和基础研究中得
到了广泛应用。
基因歧视
基因信息可能被用于歧视某些人群，如保险、就业等方面。

(生物学)基因重组和基因工程PPT课件

（一） DNA克隆
克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
Clone: A population of identical cells or DNA molecules descended from a single progenitor. Also viruses or organisms that are genetically identical and descended from a single progenitor.
recombination that occurs only at specific
sequences depending on an enzyme-mediated
recognition. 3) Transposition recombination is
the movement of a gene or a set of genes from
一、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个 DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 Homologous recombination （同源重组） : Recombination between two DNA molecules of similar
第十四章
基因重组和基因工程
Genetic Recombination and Genetic Engineering
目录
第一节
DNA的重组
DNA Recombination
DNA重组
同源重组 (homologous recombination) 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 位点特异的重组(site-specific recombination) 转座 (transposition)

基因工程原理-第5章重组基因导入受体细胞

转化率＝
转化子 DNA分子数
＝
Ca2+诱导大肠杆菌转化法
① 低温下使磷质层形成液晶结构， Ca2+：使膜间核酸酶分离 ② 与DNA结合，抗DNase
（1）感受态的制备
对数生长后期的菌体 5x107个/毫升
冰浴10分钟
含CaCl2缓冲液 15分钟含CaCl2缓冲液
（3）筛选转化子。
（2）DNA分子转化感受态细胞
菌间接合转移的有关基因
tra。
（Vir 区）
（Con区）
出毒性。占Ti质粒 1/3。
Ori区 ——复制起始区。
外源基因
Ti质粒载体
限制性酶切开
（1）叶盘法转化植物细胞
（2）整体植株接种转化法
人为地在整体植株上造
成创伤部位，然后把农杆菌
接种在创伤表面，使农杆菌按照天然的感染过程在植株
体内进行侵染。获得转化的
CHO，猴肾细胞等
• 受体动物：鼠、牛、羊、鱼等
第二节重组基因导入受体细胞
一、重组基因导入原核受体细胞
接受DNA片段
（一）转化
1928年英国学者F·Griffth在肺炎双球菌中发现的，证
明了遗传的物质基础是DNA。
转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受体菌，称转化子。转化子细胞数
（二）植物病毒介导基因转移 DNA病毒20%
植物病毒
RNA病毒80%
花椰菜花叶病毒：双链DNA病毒
（三）化学诱导DNA直接转化（1）多聚物介导法聚乙二醇多聚赖氨酸多聚鸟苷酸
（2）脂质体介导基因转化
脂质体
（四）物理方法介导DNA直接转化（1）基因枪转化

DNA重组技术PPT课件

为倒置重复序列，如HindIII, AAGCTT。
17
酶的切割可以有两种方式：即粘性末端和平末端
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TT_C ……3’ 3’…… C_TT|AA’G …… 5’
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
15
限制性核酸内切酶的类型及特性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：
Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型
第二类(II型)限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶.
Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。
14
限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用d，即Hind。
6
① 质粒/载体
质粒(Plasmid)基本概念独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1K200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组 DNA的同一组酶系。
特别是在完成人类基因组测序计划后，DNA重组技术与其它技术相结合，将为功能基因组的研究提供强大的技术支持；通过此方法可以对单个或多个基因的功能进行研究；
结合PCR技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产品，如胰岛素、干扰素等药物以及疫苗等。

基因工程技术PPT课件

•
具有若干限制性内切酶单一识别
制的双链环状 DNA 分子。
位点，便于外源基因插入。
第15页/共51页
克隆载体: PBR322
特点： • 分子量小，，便于操作。 • 有两个抗性基因，便于转化子筛选。 • 有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位
于四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停止时，它仍能继续复制。
第12页/共51页
• 克隆载体(cloning vector)
用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建（PBR322）。
• 表达载体(expression vector)
使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体 DNA导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译（pCDNA3）。
The Nobel Prize in Chemistry 1980
Jackson, Symons,and Berg (1972) – generated first recombinant DNA molecules
Cohen and Boyer (1973) – produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA
第26页/共51页

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遗传操作繁琐适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良
2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第五章克隆重组体的构建、转化
第二节重组DNA分子导入宿主细胞
以质粒为载体：转化作用、接合作用以噬菌体为载体：转染作用、转导作用
一、重组质粒DNA分子转化E.coli
2020/12/4
第五章克隆重组体的构建、转化
第一节受体细胞
受体细胞的选择
限制缺陷型
大肠杆菌的限制系统主要由hsd R基因编码，因此具有hsd R—遗传表型的大肠杆菌各株均丧失了降解外源DNA的能力，同时大大增加了外源DNA的可转化性。
重组缺陷型
大肠杆菌中存在着两条体内同源重组的途径，即RecBCD途径和RecEF途径，前者远比后者重要，但两种途径均需
第五章克隆重组体的构建、转化
第一节受体细胞受体细胞（receptor cell）或称宿主细胞（host cell）：能摄取外源
DNA并使其稳定维持的细胞。选择受体细胞的基本原则
便于重组DNA分子的导入能使重组DNA分子稳定存在于细胞便于重组子的筛选遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长安全性高，无致病性内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量最低在遗传密码的应用上无明显偏倚性有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效分泌表达
要 RecA重组蛋白的参与。因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型，其相应的基因型为
recA-、recB-、recC-.
遗传互补型
感染寄生缺陷型
2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第五章克隆重组体的构建、转化
第一节受体细胞常用的受体细胞
原核生物细胞大肠杆菌（G-）、枯草杆菌（G+）、蓝细菌真菌细胞酵母菌植物细胞水稻、棉花、玉米、拟南芥等动物细胞小鼠L细胞、Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等
2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新

各种基因工程受体的特性
酵母菌
• 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，遗传稳定
• 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统 • 不含有特异性的病毒、不产生毒素 • 内源性蛋白产物种类繁多且含量高
适用于外源DNA的扩增NA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌
2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
各种基因工程受体的特性
昆虫细胞（家蚕）
具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定
DNA重组操作系统欠完善适用于真核生物基因的高效表达
2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
各种基因工程受体的特性
哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）
2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA 的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子
酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化
2020/12/4
苏州科技学院生物系
转化（transformation）：重组子通过与膜蛋白结合进入受体细胞并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
细菌感受态的形成（感受态细胞：处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞）
转化因子的吸收
整合复合物前体的形成
单链DNA转化因子的整合
转化子的形成
2020/12/4
苏州科技学院生物系
与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统
细胞培养条件苛刻，生长缓慢适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是 DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体
2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
各种基因工程受体的特性
植物细胞（拟南芥菜、烟叶）
农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用
叶亚新
第五章克隆重组体的构建、转化
第二节重组DNA分子导入宿主细胞一、重组质粒DNA分子转化E.coli 1. Ca2+诱导转化
利用CaCl2处理E.coli，能够促进其对λ噬菌体DNA、质粒DNA的吸收，重复性好，操作简便，适合成批制备感受态细胞
2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第五章克隆重组体的构建、转化
第二节重组DNA分子导入宿主细胞一、重组质粒DNA分子转化E.coli
3. 接合转化法（三亲本杂交接合转化法）基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式
非接合型质粒由于缺少编码接合转移基因的功能区，因此不能直接通过细胞接合转化受体细胞，但当同一细胞中共存一个含有接合功能的辅助质粒，则这些非接合型质粒通常也会被转移。
第五章克隆重组体的构建、转化
第二节重组DNA分子导入宿主细胞一、重组质粒DNA分子转化E.coli 2. 电穿孔转化法
利用高压脉冲作用，在E.coli细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
需在低温下（0℃-4℃）进行，转化效率高。
2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
•遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定 •产结构复杂、种类繁多的内毒素
•适用于外源DNA的要受体菌
2020/12/4
叶亚新
苏州科技学院生物系
叶亚新
各种基因工程受体的特性
枯草杆菌
遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素
遗传欠稳定，载体受体系统欠完备适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌
2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
各种基因工程受体的特性
链霉菌
抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素遗传不稳定，生长相对缓慢主要用于抗生素生产菌株的改良