蛋白质含量测量
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蛋白质含量的测定方法及原理
蛋白质含量的测定方法及原理蛋白质是生物体内一种重要的有机化合物，具有构建细胞结构、调节生理功能等重要作用。
因此，准确测定蛋白质的含量对于生物科学研究和临床诊断具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法及其原理。
一、比色法比色法是一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质与某些特定试剂形成显色物，根据显色物的光吸收特性来测定蛋白质的含量。
1. 低里氏法低里氏法是一种经典的蛋白质含量测定方法，其原理是利用试剂双硫苏三唑酮（DTNB）与蛋白质中的半胱氨酸残基反应产生黄色的二硫苏三唑，然后通过分光光度计测定其在412nm处的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
2. 伯杰法伯杰法是一种基于酪蛋白与浊度试剂金霉素的显色反应来测定蛋白质含量的方法。
酪蛋白与金霉素结合形成沉淀，通过比色法测定沉淀的光吸收度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
3. 白蛋白-酷伊斯基（BCA）法BCA法是一种常用的高灵敏度蛋白质测定方法，其原理是在碱性条件下，蛋白质与BCA试剂中的铜离子络合生成紫色的离子螯合物，通过比色法测定在562nm处的光吸收度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
二、光谱法光谱法是一种基于蛋白质在特定波长下的吸收特性来测定蛋白质含量的方法。
1. 紫外吸收法紫外吸收法根据蛋白质中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、酪氨酸和色氨酸）在紫外光区域（200-400nm）的吸收特性来测定蛋白质含量。
通过分光光度计测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
2. 近红外光谱法近红外光谱法是一种无损、非破坏性的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质溶液在近红外光区域（700-2500nm）的吸收特性与其含量之间的关系。
通过近红外光谱仪获取蛋白质溶液的光谱图像，然后利用化学计量学方法建立标准模型，通过光谱图像预测蛋白质的含量。
三、生化分析法生化分析法是一种利用生化技术和仪器设备来测定蛋白质含量的方法。
组织中蛋白质含量测定
组织中蛋白质含量测定引言：蛋白质是生物体中一类重要的有机分子，具有多种功能。
在细胞中，蛋白质可以作为酶催化反应、作为信号分子传递信息、作为结构蛋白维持细胞形态等。
了解组织中蛋白质含量对于研究生物体的功能和生理状态非常重要。
本文将介绍几种常用的组织中蛋白质含量测定的方法，包括BCA法、Lowry法和Bradford法。
一、BCA法BCA法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，其原理是利用蛋白质与铜离子形成紫色螯合物，进而测定其吸光度。
该方法操作简单，灵敏度高，适用于几乎所有类型的蛋白质样品。
实验步骤：1. 准备标准曲线：选取不同浓度的蛋白质标准品，如0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mg/mL，将标准品分别取0.2mL放入试管中，然后加入1mL的BCA试剂，于37°C水浴中孵育30分钟后，测定吸光度。
2. 测定样品：将待测样品取0.2mL放入试管中，然后加入1mL的BCA试剂，于37°C水浴中孵育30分钟后，测定吸光度。
3. 计算蛋白质含量：利用标准曲线中的浓度和吸光度值，计算出待测样品中的蛋白质含量。
二、Lowry法Lowry法是一种传统的测定蛋白质含量的方法，其原理是利用蛋白质与Folin-Ciocalteu试剂和铜离子发生反应，生成蓝色产物，通过比色测定吸光度，进而测定蛋白质含量。
实验步骤：1. 准备标准曲线：选取不同浓度的蛋白质标准品，如0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mg/mL，将标准品分别取0.1mL放入试管中，然后加入0.9mL的含有Folin-Ciocalteu试剂和Na2CO3的试剂混合液，在室温下孵育30分钟后，测定吸光度。
2. 测定样品：将待测样品取0.1mL放入试管中，然后加入0.9mL的试剂混合液，在室温下孵育30分钟后，测定吸光度。
3. 计算蛋白质含量：利用标准曲线中的浓度和吸光度值，计算出待测样品中的蛋白质含量。
三、Bradford法Bradford法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，其原理是利用染色剂Coomassie Brilliant Blue与蛋白质形成复合物后，吸光度值的变化来测定蛋白质含量。
蛋白质含量的测定方法
蛋白质含量的测定方法蛋白质是生物体内重要的营养成分，对于人体的生长发育和健康维护起着重要的作用。
因此，准确测定食品、药物、生物样品中的蛋白质含量，对于保障食品安全和科学研究具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法，供大家参考。
首先，常用的蛋白质含量测定方法之一是比色法。
比色法是通过蛋白质与某种试剂发生化学反应，产生有色产物，再利用光度计测定产物的吸光度来间接测定蛋白质含量。
其中，最常用的试剂是布拉德福试剂和伯尼斯试剂。
这种方法操作简便，测定结果准确，因此被广泛应用于食品、生物样品的蛋白质含量测定。
其次，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是比浊法。
比浊法是通过蛋白质与某种试剂发生沉淀反应，根据沉淀的浑浊度来测定蛋白质含量。
常用的试剂有硫酸铵和三氯乙醛。
比浊法操作简便，成本低廉，适用于大批量样品的测定。
另外，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是氨基酸分析法。
氨基酸分析法是通过水解蛋白质，然后利用色谱仪或氨基酸分析仪测定水解产物中各种氨基酸的含量，从而计算出蛋白质的含量。
这种方法对于蛋白质的成分分析非常准确，但操作复杂，需要专业设备和技术支持。
最后，还有一种常用的蛋白质含量测定方法是生物素标记法。
生物素标记法是将生物素标记在蛋白质分子上，然后利用生物素与酶的特异性结合来测定蛋白质含量。
这种方法对于高灵敏度的蛋白质测定非常有效，但需要专门的标记试剂和设备支持。
总之，蛋白质含量的测定方法有很多种，每种方法都有其适用的场合和特点。
在实际应用中，需要根据样品的特点和实验条件选择合适的测定方法，以确保测定结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的几种常用方法能够为大家在蛋白质含量测定方面提供一些帮助。
蛋白质测量方法
蛋白质测量方法蛋白质是生物体内一种重要的有机化合物，它在维持生命活动和调节机体功能中起着至关重要的作用。
因此，准确地测量蛋白质含量对于研究和应用领域都具有重要意义。
本文将介绍常用的蛋白质测量方法。
一、低里德伯法低里德伯法是一种常用的测定蛋白质浓度的方法。
该方法利用蛋白质与试剂结合产生的差异吸光度来测量蛋白质的含量。
常用的试剂有布拉德福试剂、比色法试剂等。
首先，将待测样品与试剂混合，使其发生反应；然后，通过比色计或分光光度计测量混合液的吸光度，并将吸光度值与已知浓度的标准曲线进行对比，从而确定样品中蛋白质的含量。
二、生物素标记法生物素标记法是一种基于生物素与蛋白质结合的原理进行测量的方法。
该方法通过将生物素与蛋白质结合，在测定过程中利用生物素与酶标记物的结合来测定蛋白质的含量。
首先，将待测样品与生物素结合，形成生物素-蛋白质复合物；然后，加入酶标记物与复合物结合，并通过化学反应使酶标记物产生发光或发色反应；最后，通过检测发光或发色反应的强度来测定蛋白质的含量。
三、Western blotting法Western blotting法是一种常用的蛋白质分离和检测方法。
该方法通过将蛋白质样品进行电泳分离，并利用蛋白质间的电荷差异进行分离，然后将分离后的蛋白质转移到膜上，并利用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过酶标记物或荧光染料等进行检测。
通过Western blotting法可以精确地测定蛋白质的分子量和相对含量。
四、质谱法质谱法是一种高灵敏度和高分辨率的蛋白质测量方法。
该方法通过将蛋白质样品进行分离，并利用质谱仪进行分析，得到蛋白质的质谱图谱。
根据蛋白质的质量-电荷比和丰度信息，可以推断出蛋白质的分子量和含量。
质谱法具有高通量、高灵敏度和高特异性的优点，适用于复杂样品的蛋白质测量。
总结起来，蛋白质测量方法有低里德伯法、生物素标记法、Western blotting法和质谱法等。
每种方法都有其特点和适用范围，选择合适的方法可以准确地测量蛋白质的含量。
蛋白质测量方法
蛋白质测量方法蛋白质是生物体内重要的有机化合物，广泛参与细胞结构、生物催化、免疫调节、信号传导等生物学过程。
因此，准确测量蛋白质的含量对于研究和应用具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质测量方法。
一、紫外吸收法紫外吸收法是常用的蛋白质测量方法之一。
蛋白质在紫外光区域（200-280nm）对紫外光有很强的吸收能力，而其他常见的生物分子如核酸、糖等对紫外光的吸收能力较弱。
因此，通过测量蛋白质溶液在紫外光区域的吸光度，可以间接测量蛋白质的含量。
常用的测量波长为280nm，这是因为蛋白质中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸，它们在280nm波长下的吸光度较高。
二、Lowry法Lowry法是一种经典的蛋白质测量方法。
该方法通过蛋白质与碱式铜离子和费林试剂（一种还原剂）反应，产生紫色产物。
紫色产物的吸光度与蛋白质的含量呈线性关系，可以通过测量吸光度来测量蛋白质的含量。
Lowry法对于含有多种干扰物质的样品有较好的选择性和灵敏性，但需要注意的是，该方法对于一些特殊的蛋白质可能不适用。
三、Bradford法Bradford法是一种简便快速的蛋白质测量方法。
该方法利用考马斯亮蓝G-250与蛋白质反应，在酸性条件下形成蓝紫色复合物。
蛋白质的浓度与复合物的吸光度呈线性关系，可以通过测量吸光度来测量蛋白质的含量。
与Lowry法相比，Bradford法对于含有多种干扰物质的样品更为灵敏和稳定，但对于碱性蛋白质和一些特殊蛋白质可能不适用。
四、比色法比色法是一种常用的蛋白质测量方法。
该方法利用蛋白质与某些染料反应生成有色复合物，通过测量复合物的吸光度来测量蛋白质的含量。
常用的染料有布拉德福德染料、皮尔斯染料等。
比色法适用于大部分蛋白质的测量，但需要注意染料的选择和测量波长的确定。
五、生物素-亲和法生物素-亲和法是一种特异性较高的蛋白质测量方法。
该方法利用生物素和亲和素结合，形成生物素-亲和素复合物。
通过测量复合物的信号强度来测量蛋白质的含量。
蛋白质定量的方法
蛋白质定量的方法蛋白质是构成生物体的重要组成部分，对于理解生物体的结构和功能具有重要意义。
因此，准确测定蛋白质的含量是许多生物科学领域研究的基础。
目前，人们已经发展出了多种方法来定量蛋白质的含量。
本文将介绍几种常用的蛋白质定量方法及其原理、优缺点和应用范围。
1. 高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography, HPLC）HPLC是一种常用的蛋白质分离和定量方法。
它利用样品中蛋白质与流动相在分离柱中的相互作用来实现分离和定量。
HPLC方法的优点是分离效果好、重复性好、能够同时检测多个样品。
但是，该方法需要相对较高的设备要求和操作技巧，对样品预处理也较为复杂，且比较耗时。
2. 比色法比色法是一种常用的定量蛋白质的方法。
其中，低里氏试剂法和双硫键试剂法是比较常用的比色法。
低里氏试剂法是通过蛋白质与龙氏试剂（碱性铜硫脲）之间的比色反应来定量蛋白质含量。
双硫键试剂法则是通过蛋白质与2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）之间的比色反应来定量蛋白质含量。
比色法具有操作简单、设备要求低等优点，但是对于不同类型的蛋白质，比色反应的敏感度和选择性可能不同。
3. 显微波特光度法（Bradford法）Bradford法是一种常用的蛋白质定量方法，基于酒红素（Coomassie BrilliantBlue G-250）与蛋白质之间的相互作用产生的颜色变化。
蛋白质与酒红素结合后，溶液的吸收光谱发生变化，可测量溶液的吸光度来定量蛋白质含量。
该方法操作简单快捷，而且灵敏度较高，适用于常规蛋白质定量。
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE）SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定量方法，可以通过电泳分离蛋白质并定量。
该方法通过将样品中的蛋白质在电场中进行分离，然后通过比色或者近红外成像等方法来定量。
测量蛋白质含量的几种方法以及优缺点
一、染料法
优点：因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。
缺点：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量
优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
缺点：灵敏度差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、酚试剂法测定血清蛋白质含量
（改良Lowry法）
优点：方法简便，灵敏度高，能够测定2～100μg的微量蛋白质。
其方法凯氏定氮法操作简便，其灵敏度比双缩脲法高100倍左右。
因此经常被用于科研与临床检验。
四、紫外吸收法
优点：灵敏度高，仪器设备简单，操作简便。
缺点：准确度不高，有的检测不可用，有限制。
五、凯氏定氮法（Kjeldahl determination）优点：可用于所有食品的蛋白质分析中，操作相对简单费用低。
结果
准确、改进后可以用于微量蛋白质的测定。
缺点：最终测定的是总有机氮而不是蛋白质氮。
精确度低于双缩脲法、试剂有腐蚀性。
六、F olin－酚试剂法（Folin-phenol
Reagent Method ）
优点：灵敏度高，方便简单。
缺点：费时较长，精确控制操作时间
七、考马斯亮蓝法（Coomassie
brilliant blue staining ）
优点：灵敏度高，测定快速，应用广泛，只需一种试剂，用时间短。
缺点：有较大的偏差，而且去污剂等很多试剂对其有干扰。
测量蛋白质含量的方法
测量蛋白质含量的方法
一、测量蛋白质含量的方法
1、溶解液稀释法
溶解液稀释法是指在特定的pH和特定浓度的溶解液中，将待测样品稀释至一定浓度，然后通过测定溶解液的比容量或浊度来估算样品中蛋白质的含量。
2、硫代乙酰胆碱法
硫代乙酰胆碱法是指用硫代乙酰胆碱作为蛋白质染料，通过蛋白质染色的深度来估算样品中蛋白质的含量。
此方法也可以用于检测双肽类和多肽类蛋白质。
3、 Lowry比容量法
Lowry比容量法是使用Lowry比容量试剂检测样品中蛋白质的含量，其原理是将蛋白质在碱性溶液中溶解，然后用Lowry比容量试剂滴定，通过滴定值来估算样品中蛋白质的含量。
4、Bradford表观比容量法
Bradford表观比容量法是使用Bradford表观比容量试剂检测样品中蛋白质的含量，其原理是将蛋白质在碱性溶液中溶解，然后用Bradford表观比容量试剂滴定，通过滴定值来估算样品中蛋白质的含量。
5、BCA酶法
BCA酶法是利用蛋白质被BCA酶分解的过程，将BCA酶与待测样品混合，通过分光光度计法测定BCA酶催化后溶液的分光度值，
从而估算样品中蛋白质的含量。
蛋白质含量测量方法
蛋白质含量测量方法从查阅的资料来看,目前测定蛋白质含量常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford)、Folin酚试剂法。
这五种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,每种方法都有其优缺点,在选择方法时应考虑:⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度;⑵蛋白质的性质;⑶溶液中存在的干扰物质;⑷测定所要花费的时间。
一、凯氏定氮法1、实验原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。
(1)有机物中的胺根在强热和CuSO4,浓H2SO4 作用下,硝化生成(NH4) 2SO4反应式为:CuSO4 +2NH2—+H2S04+2H+=(NH4)2S04(2)在凯氏定氮器中与碱作用,通过蒸馏释放出NH3 ,收集于H3BO3 溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(3)用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定,根据HCI消耗的量计算出氮的含量,然后乘以相应的换算因子,既得蛋白质的含量反应式为:(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO32、操作方法(1)样品处理:精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品(约相当氮30-40mg),移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中,加入0.2g硫酸铜,6g硫酸钾及20毫升硫酸,稍摇匀后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上,小火加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热0.5小时。
蛋白质含量的测定方法
蛋白质含量的测定方法
蛋白质的含量是指在样品中蛋白质的质量或浓度。
测定蛋白质含量是许多生物学和生化实验中常用的实验方法之一，以下是一些常见的测定方法：
1. 布拉德福德法（Bradford法）：该方法利用布拉德福德蛋白
质染料与蛋白质形成复合物，并产生特定的颜色，通过比色法测定颜色强度从而确定含量。
2. 低里氏法（Lowry法）：该方法基于在碱性条件下，蛋白质
与碱性铜离子复合生成紫色产物的原理，通过比色法定量测定。
3. BCA法（Bicinchoninic Acid法）：该方法利用BCA试剂与
蛋白质中的蛋白质产生螯合，形成紫色到蓝色的产物，并通过光度计测定吸光度从而测定含量。
4. 还原硝酸银法：该方法是通过硝酸银与蛋白质中的氨基酸中的硫原子反应产生黑色沉淀，通过沉淀的重量或者比色法测定吸光度来确定蛋白质含量。
5. 紫外吸收法：蛋白质具有特定的紫外吸收峰，在特定波长下进行测定，可以通过比较样品吸光度与标准曲线来计算蛋白质含量。
以上只是一些常见的测定方法，根据具体需要和实验条件的不同，可以选择适合的方法进行蛋白质含量的测定。
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此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。
按测定的波长划分，紫外吸收法分为多种，本实验中使用三种：
①280nm的光吸收法
因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
C2＝0.065÷0.1
＝0.65mg/mL
C3＝0.108÷0.2
＝0.54mg/mL
综上数据，排除第二组取前两组数据平均可得：
C=（0.64+0.65）÷2
=0.645mg/ml
（二）紫外吸收法
1． 280nm法数据记录
表2280nm法的实验数据（加样单位：ml）
管号
1
2
3
4
5
6
7
标准蛋白质(1.0mg/ml)
2. 微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100g/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O,考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。
（二）紫外吸收法
（1）取6～11支试管，1支作空白，其余试管按表2.3.4中剂量，分别加入样品和水。加完后，在旋涡混合器上混合。
(因为：1%浓度10mg/ml)
本实验中用的是牛血清清蛋白：A1％1cm=6.3 (280nm)
若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
0
未知蛋白质(mL)
2.0
蒸馏水(mL)
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
0
管中的蛋白浓度（mg/mL）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
光吸收值（A280）
0
0.130
0.251
0.363
0.446
0.555
0.308
0
0.138
0.248
0.324
0.448
0.569
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
2.紫外吸收法
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）试管16支
2.紫外吸收法：
1．试剂：标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
2.器材：
（1）紫外分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）试管11支
四、实验步骤
（一）．考马斯亮蓝法：
1. 标准方法
（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表1中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合。未知样品的加样量见表1中的第8、9、10管。
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
考马斯亮兰G-250染料（如图），在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
0.311
平均光吸收值（A280）
0
0.134
0.250
0.344
0.447
0.562
0.310
2. 数据处理与图像拟合
得到的标准曲线如下（ ）：
由图可知：紫外吸收法中吸收的光度值与蛋白浓度成二次曲线关系，其相关度 。
由待测蛋白的A280=0.310可知：
七、实验结论与分析
运用考马斯亮蓝法，将待测蛋白质与染料相结合，从而溶液的颜色由棕黑色变为蓝色，最大吸收峰也发生变化，颜色的深浅和吸收峰的强度与蛋白质的浓度存在一个正相关的关系，通过测定吸收峰的强度即可定量的对比和估计蛋白质的浓度，直接观察颜色的深浅也可粗略地估计蛋白质的浓度。在相同的实验条件下，以已知的标准蛋白作参考，通过对比其最强吸收峰的强度即可得出待测蛋白溶液的浓度所处在的范围，可以粗略估计待测蛋白的浓度；而将标准蛋白的浓度与吸收峰强度之间的关系进行线性拟合后即可定量的计算待测蛋白质的浓度，本实验中采用二项指数近似，在 要求不高于0.9933的情况下，可以计算得到待测蛋白的浓度为0.645mg/mL。
标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：
管号1 2 3 4 56
BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
H2O5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
A280
用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。
100
光吸收值（A595）
0.00
0.052
0.093
0.170
0.219
0.264
0.323
0.136
0.238
0.329
0.00
0.062
0.114
0.159
0.240
0.256
0.318
0.131
0.234
0.317
平均值( )
0.00
0.057
0.104
0.165
0.230
0.260
0.321
吸收差= A215－A225
以吸收差为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
本方法在蛋白质浓度20~100g/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1NNaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。
0.134
0.236
0.323
2.数据处理与图像拟合
根据表中的两组标准蛋白吸光度的平均值进行二次曲线拟和，得到标准曲线如下（ =0.9933）：
将未知蛋白的吸光度代入计算，分别得到8、9、10组的蛋白质浓度，依次为：
根据稀释的倍数，可得到待测蛋白的浓度依次如下：
C1＝0.032÷0.05
＝0.64mg/mL
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。
蛋白质浓度=(A28010)/A1％1cm,280nm(mg/ml)
按测定的波长划分，紫外吸收法分为多种，本实验中使用三种：
①280nm的光吸收法
因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
C2＝0.065÷0.1
＝0.65mg/mL
C3＝0.108÷0.2
＝0.54mg/mL
综上数据，排除第二组取前两组数据平均可得：
C=（0.64+0.65）÷2
=0.645mg/ml
（二）紫外吸收法
1． 280nm法数据记录
表2280nm法的实验数据（加样单位：ml）
管号
1
2
3
4
5
6
7
标准蛋白质(1.0mg/ml)
2. 微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100g/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O,考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。
（二）紫外吸收法
（1）取6～11支试管，1支作空白，其余试管按表2.3.4中剂量，分别加入样品和水。加完后，在旋涡混合器上混合。
(因为：1%浓度10mg/ml)
本实验中用的是牛血清清蛋白：A1％1cm=6.3 (280nm)
若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
0
未知蛋白质(mL)
2.0
蒸馏水(mL)
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
0
管中的蛋白浓度（mg/mL）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
光吸收值（A280）
0
0.130
0.251
0.363
0.446
0.555
0.308
0
0.138
0.248
0.324
0.448
0.569
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
2.紫外吸收法
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）试管16支
2.紫外吸收法：
1．试剂：标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
2.器材：
（1）紫外分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）试管11支
四、实验步骤
（一）．考马斯亮蓝法：
1. 标准方法
（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表1中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合。未知样品的加样量见表1中的第8、9、10管。
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
考马斯亮兰G-250染料（如图），在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
0.311
平均光吸收值（A280）
0
0.134
0.250
0.344
0.447
0.562
0.310
2. 数据处理与图像拟合
得到的标准曲线如下（ ）：
由图可知：紫外吸收法中吸收的光度值与蛋白浓度成二次曲线关系，其相关度 。
由待测蛋白的A280=0.310可知：
七、实验结论与分析
运用考马斯亮蓝法，将待测蛋白质与染料相结合，从而溶液的颜色由棕黑色变为蓝色，最大吸收峰也发生变化，颜色的深浅和吸收峰的强度与蛋白质的浓度存在一个正相关的关系，通过测定吸收峰的强度即可定量的对比和估计蛋白质的浓度，直接观察颜色的深浅也可粗略地估计蛋白质的浓度。在相同的实验条件下，以已知的标准蛋白作参考，通过对比其最强吸收峰的强度即可得出待测蛋白溶液的浓度所处在的范围，可以粗略估计待测蛋白的浓度；而将标准蛋白的浓度与吸收峰强度之间的关系进行线性拟合后即可定量的计算待测蛋白质的浓度，本实验中采用二项指数近似，在 要求不高于0.9933的情况下，可以计算得到待测蛋白的浓度为0.645mg/mL。
标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：
管号1 2 3 4 56
BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
H2O5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
A280
用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。
100
光吸收值（A595）
0.00
0.052
0.093
0.170
0.219
0.264
0.323
0.136
0.238
0.329
0.00
0.062
0.114
0.159
0.240
0.256
0.318
0.131
0.234
0.317
平均值( )
0.00
0.057
0.104
0.165
0.230
0.260
0.321
吸收差= A215－A225
以吸收差为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
本方法在蛋白质浓度20~100g/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1NNaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。
0.134
0.236
0.323
2.数据处理与图像拟合
根据表中的两组标准蛋白吸光度的平均值进行二次曲线拟和，得到标准曲线如下（ =0.9933）：
将未知蛋白的吸光度代入计算，分别得到8、9、10组的蛋白质浓度，依次为：
根据稀释的倍数，可得到待测蛋白的浓度依次如下：
C1＝0.032÷0.05
＝0.64mg/mL
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。
蛋白质浓度=(A28010)/A1％1cm,280nm(mg/ml)