胎鼠海马神经元培养及其鉴定

［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical UniversityCN 53-1049/R胎鼠海马神经元培养及其鉴定李玉1），王波1），但齐琴2）（1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆明650031）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起，11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论本方法获取生长良好，纯度较高的海马神经元．［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat sLI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2）（1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ，Kunming Yunnan 650031，China ）［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore theneuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method.［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高，生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞生长状态较成年动物来源者好[4，5]．本实验建立大图1培养海马神经元（×200）Fig.1Cult ur ed hippocampus neur ons（×200）A:24h；B:5d；C:11d.第32卷昆明医学院学报18鼠胚胎源性海马神经元的体外培养纯化方法，观察其生长特性．1材料与方法1.1海马细胞获细胞悬液制备与细胞培养SD孕鼠腹腔注射麻醉后，开腹取子宫获取胎鼠．无菌条件下，取断头置75%乙醇进一步消毒，生理盐水冲洗后打开颅骨去除大脑皮质，暴露海马．取出海马，去除被膜，用组织剪剪碎组织，0.125%胰蛋白酶37℃消化15min，1000 r/min离心10min去上清，加血清终止反应．PBS洗3次收集组织，用吸管反复吹打30～50次制成细胞悬液，计数细胞，调整细胞密度为6×105个/mL按种于24孔培养板．继续培养2h让成纤维细胞差速先贴壁后，将培养液移入另一培养板继续培养纯化神经元．1.2形态学观察显微镜下于24h，5d、11d，15d分别观察细胞生长状态．描记神经突起生长情况．1.3免疫组织化学染色为证明培养细胞是神经元，采用神经元特异标记物神经元特异烯醇化酶进行染色．免疫组化染色步聚如下：（1）将培养细胞用100%乙醇固定10min，PBS洗5min×3次．3%H2O2室温孵育30min去除内源性过氧化物酶．PBS洗5min×3次；5%羊血清（0.3%Triton PBS配制）室温封闭30min以减少排特异背景染色．加第一抗体神经元特异烯醇化酶（chemicon，1:1000）4℃冰箱孵育18～24h．PBS洗5min×3次，加入二步法PV9000试剂I，37℃孵育30min；PBS洗5mi-n×3次．加入PV9000试剂II37℃孵育30min．PBS洗5min×3次，DAB综色反应显色．70%，80%，90%，100%I，100%II梯度酒精透水；二甲苯I，II透明2次，每次30min，中性树胶封片．镜下观察染色部位．2结果2.1胎鼠海马神经元形态学变化从胚胎内取出的胎鼠海马神经元用胰蛋白酶消化后接种于培养板，在显微镜下观察可见：细胞呈球型，胞体透明，折光性好．接种24h后，细胞开始贴壁，但生长不快，至第5天才可见神经元长出明显突起，有的有胞体1倍长，有的则较短．继续培养至第11天观察，神经细胞胞体形态未发生明显变化，但神经突起明显增长，相互联成网状．突起可达胞体4～5倍长，与5d组比神经突起长度明显增加．15d时细胞生长状态较好，与11d比类似，但神经突起长度和进度进一步增加（见图1）．CA B2.2免疫组织化学染色结果神经元特异烯醇化酶染色显示，培养海马神经元胞体和突起均呈阳性染色，说明培养细胞是神经元（见图2）.3讨论本实验中，笔者观察了大鼠胚胎源性海马神经元的体外生长过程，发现胎鼠海马神经元体外图2海马神经元特异烯醇化酶染色（×400）Fig.2Enolase specific st aining for neur ons in hippocampus （×400）李玉，等．胎鼠海马神经元培养及其鉴定19第5期生长良好．尽管头3d 生长缓慢，但是第5天已可见清晰的神经突起，有的长达胞体2倍以上．通过与本室另一组培养成年海马神经元的实验比较，发现胎鼠海马神经较成年海马神经元生长块，且纯度较高．特别是通过差速2h 贴壁纯化后，5d 就凡乎看不到成纤维细胞生长．由于本实验中培养的海马神经元较为干净，且5d 时细胞之间尚未联成网状，故计数和测量神经突起均较容易，是研究其外源因素干预促进突起生长的良好时期．而随着培养时间延长，至第11天时，细胞生长呈现网状边接，神经细胞生长状态良好，胞体和突起清晰可持续．由于此时神经元突起刚好生长联成网状，因此将其用于研究抑制神经突起生长干扰因素较为可行．本实验建立的海马神经元体外细胞模型为研究海马细胞体外生物学特性和加入细胞因子研究其对神经元生长的影响[6，7]奠定了基础．本实验中，为了鉴定培养神经元的特异性，我们用神经元特异烯醇化酶染色进行鉴定神经元，结果发现培养细胞均是阳性，说明培养细胞是神经元．神经元特异烯醇化酶是神经元的特异标记物[8]，已广泛用于神经细胞鉴定．从本实验结果看，所培养细胞是神经元，而且纯度较高．本实验不仅获得了纯度较高的海马神经元，而且其生长良好，可用于神经元存活和神经生长的相关研究．［参考文献］［1］王英，车宇，苗建亭，等．新生大鼠海马神经元原代培养方法的实验研究.细胞与分子免疫学杂志［J ］．细胞与分子免疫学杂志，2003，19（2）：197－198．［2］周明，聂箐，吕诚，等．一种大鼠海马神经元的原代培养方法［J ］．南昌大学学报（医学版），2010，50（3）：1－3．［3］TANAKA H ．Culturing hippocampal neurons ［J ］．Nippon Yakurigaku Zasshi ，2002，119（3）：163－166.［4］李劲涛，黄桂琴，王廷华，等．GFP 转基因胚胎小鼠海马神经元培养方法的建立［J ］．昆明医学院学报，2006，27（6）：23－26．［5］刘佳，罗湘颖，杨志敏，等．新生大鼠中枢神经系统不同区域细胞生长的形态学比较研究［J ］．昆明医学院学报，2006，27（6）：27－29．［6］M ARCONI P ，SIM ONATO M ，SZUCCHINI G ，et al ．Re-plication-defective herpes simplex virus vectors for neurotrophic factor gene transfer in vitro and in vivo ［J ］．Gene therapy ，1999，6（5）：904－910.［7］张惊宇，赵节绪．表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒（rAAV-BDNF ）对体外培养海马神经元保护作用的研究［J ］．中国免疫学杂志，2008，24（12）：1100－1102．［8］陈瑞庆．冰冻切片检测大鼠脊髓组织NSE 和NF 的表达［J ］．福建医药杂志，2009，31（5）：77－78．（2011－03－14收稿）。