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Southern Blot 操作流程1、哺乳动物基因组DNA 的提取（或用OMEGA 试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit ） 1、 取约30mg 样品，加入600 ul SNET ，再加入12 ul （20.2mg/ml ）的蛋白酶K ，使蛋白酶K 的终浓度为400ug/ml ； 2、 55℃振荡过夜；3、 加入0.6 ul RNaseA ，室温下孵育10 min ，后置于65℃ 10 min ；4、 加入300 ul Tris 饱和酚，288 ul 氯仿和12 ul 异戊醇，室温下振荡30 min ；5、 17,000 g 离心5min ，转移上层水相（600 ul ）至一新的离心管；6、 加入等体积（600 ul ）的异丙醇沉淀DNA ，于4℃下13,250 g 离心15 min ；7、 小心除去异丙醇，加入1 ml 70%的乙醇。
离心5 min 后除去乙醇，室温下干燥15~20 min ；8、 加入100 ul TE ，使核酸沉淀溶解。
一、 酶切1、 拷贝数的计算哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下：()gplasmidof mass bpbp DNA of Insertionμ10100.39=⨯2、 酶切体系基因组DNA 10 ug 10*Buffer 10 ul 酶(10U/ul) 10 ul Total100 ul3、 混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应；4、 对酶切产物进行纯化，用30 ul TE 洗脱；5、 制备1%浓度的琼脂糖凝胶（不加EB ）；6、 将纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15 min ，以除尽残留乙醇和消除酶切后产生的粘性末端；7、电泳：1v/cm。
二、转膜1、碱变性：把胶条转移到含碱变性液的器皿中，摇床处理15 min；重复一次；2、中和：倒出器皿中的碱变性液，加入中和液，摇床处理15 min；重复一次；3、倒出中和液，加入20×SSC，摇床处理15 min；4、转膜：1）在一干净的容器中放入一包吸水纸，倒入20×SSC，浸湿；2）放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸，倒上一层20×SSC，防止产生气泡；3）将预先剪裁好的尼龙膜放入ddH2O中充分浸润2分钟；4）小心把胶条铺在滤纸上面，用玻璃棒擀平，赶走气泡；5）往胶上倒上一层20×SSC，将尼龙膜铺在胶条上，再向上倒上一层20×SSC；6）再放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸；7）用保鲜膜把胶条四周封上，在上面压上一包吸水纸，再用一个约250mg的物体压在吸水纸上面；8）转膜过夜；5、固定将膜放在用10×SSC浸湿的滤纸上面，使含DNA面朝上，放入紫外交联仪中，以1.5J，254n，2.5min的程序将DNA固定在尼龙膜上。
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA 转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
实验七Southern印迹法[目的]１．熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。
２．了解Southern印迹的意义。
[原理]Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；•经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。
这种方法最初是由Southern于1975年建立的。
方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。
它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。
即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。
以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到一条标准曲线。
然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。
[器材与试剂]一、器材1．电热真空干燥箱2．硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3．大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4．滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等5．刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1．酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释2．碱变性液：0.5mol/L NaOH， 1.5mol/l NaCl（pH13.1）3．中和液：0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl4．20×SSC: 0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液[实验步骤]注意：操作戴手套！1．凝胶处理:1)凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。
southern blot原理
Southern Blotting 原理
Southern blotting 技术是由 Edwin M. Southern 在 1976 以
一种简单而有效的方法提出的，用于支持DNA含量的分析。
它最常被用于鉴定由多种DNA碱基构成的特定序列，以及鉴定和检测特定DNA 序列的存在、比较、分析及其分布。
它通过将DNA模板分离出来，再将DNA模板用聚合酶链反应(PCR)扩增以获得足够多的DNA模板，最后将经过扩增的DNA模板遇到一种特殊的处理，以使它与一张特殊的膜片或者膜片上的特定序列结合。
Southern blotting 包括以下几个步骤：1). 将DNA样本用双链酶将双链DNA分割成小的片段；2). 将分离出来的小DNA片段用一种特殊的方法分子印迹(molecular blotting)到一张特殊的膜片上；3). 将特定的标记物(比如特定的核酸或抗体)与经过分子印迹的DNA片
段结合；4). 将结合物暴露在感光材料上，从而将其结果显示出来。
Southern blotting 技术可以用于检测DNA片段的量、品种、分布、多样性及数量。
这种技术具有准确性高、特异性好、操作简单、检测效率高的优势。
Southern blotting 技术可以用于：1). 鉴定特定的DNA序列；
2). 鉴定DNA片段的长度；3). 检测突变；4). 检测某种重组；5). 筛选特定基因序列；6). 检测融合基因；7). 研究基因组学；8). 检测特定的核酸，如RNA、miRNA、siRNA等。
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如何确定转基因拷贝数（Southern Blot法和荧光定量PCR方法）发布: 2010-01-22来自: 易生物实验阅读数：5391次鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。
第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。
一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得T 0 代转基因植物。
在转化过程中，外源DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。
插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象。
因此，检测T0代植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。
1、Southern Blot法Southern Blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。
其原理是将待测的DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。
Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。
另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增（PCR），一般每个电泳通道需要10-30 μg的DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。
如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern 法也无法检测到。
这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。
2、荧光定量PCR方法利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。
实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。
其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBR GREEN I）或特异性的荧光探针（如：Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：CT值（Cycle Threshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。
一. 地高锌-DNA 标记1. 用51-4全长质粒做模板,用BspQ I 和Sca I双酶切,NEBBuffer：10 μLBspQ I： 3 μLSca I ： 2 μL质粒：60ul水：25μL100μL体系先放于37℃的培养箱10小时,然后于50℃水浴, BspQ I作用的温度为50℃, Sca I作用温度为37℃.2.胶回收全长片段(3.2kb)1．100μL酶切产物加loading buffer全上样，电泳后回收3000bp左右的片段。
2．称重加入3倍体积的QG（1g/3mL），50℃水浴10min融胶,其间颠倒2-3次。
3．将液体转移至柱子，13000rpm/min 1min，弃滤液。
4．加入500μLQG，13000rpm/min 1min，弃滤液。
(去除痕量的融胶)5．加入750μL PE，静置5min，13000rpm/min 1-2min.6．13000rpm/min空离2min7．置一新EP管上，加入40μL ddH2O，静置10min，13000rpm/min 1min，收集滤液备用。
用2ul测OD值.(51-4含量:0.28ug /ul)3. 探针反应用H2O 或Tris buffer溶解模板(胶回收的51-4),不能用TE,因为EDTA会抑制探针反应.步骤:1.取4ul 51-4胶回收产物,加双蒸水至16 ul.2. 100℃沸水中放置10min变性,冰上骤冷.3. 混匀DIG-High prime,取4ul DIG-High prime加到上述变性DNA溶液中,混匀,短暂离心,37℃孵化20小时4. 65℃水浴10min二.标记效率的检测1.倍比稀释探针探针反应后的探针量为23000ng .1000ng 模板→20h →probe 2300ng/20ul≈100ng/ul①第一次稀释：10ul probe①加入90ul DNA dilution buffer(10ng/ul)②第二次稀释：5ul ②加入45ul dilution buffer (1ng/ul)③第三次稀释：(2) Control DNA (5ng/ul)的倍比稀释吸取5 ul Control DNA (5ng/ul)加入20 ul的DNA dilution buffer(1 ng/ul)2.点膜(1)取1 ul Control DNA D2-D8点于尼龙膜上,与其相平行的一排点上地高辛标记的DNA D2-D8,最后各点一个dilution buffer.如下图所示.O O O O O O O O ControlO O O O O O O O DigD2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 dilution buffer将尼龙膜放于滤纸上,在其上再放一张等大的滤纸,于80℃烤箱烘烤2 hour.拿出于室温放置.(2)将膜转移到含有20ml washing buffer的封口袋中,室温振摇2min,弃尽washingbuffer(3)加10 ml 1XBlocking solution振摇孵育30 min, 弃尽Blocking solution(4)加10 ml 稀释了104倍的antibody solution振摇孵育30 min,弃antibody solution(5)加10 ml 1Xwashing buffer 洗膜两次,2X15 min,弃washing buffer(6)加10 ml 1Xdetection buffer振摇平衡2-5 min(7)将膜取出放入有双层薄膜的一层薄膜上,加约4滴的CSPD ready-to-use 横跨尼龙膜表面,将袋子的第二层膜盖在含探针DNA的一层薄膜上,尽量不能有气泡.(8)室温孵育5 min(吸尽过量的液体,将薄膜四边封口)(9)37℃孵育10 min(10)进入暗室,压膜一定时间,把压好的片子先放于以1:9稀释好的100 ml的显影液中显影5 min左右,拿出来放入定影液中定影5 min左右,用水冲洗干净,白光下照相.3.探针结果分析A.D6的荧光强度为理想的标记DNA,如:DNA样品按上述方法稀释的,实际上含有20ng/ul标记探针.B.D5 出现荧光,是足量的标记DNA,如: DNA样品按上述方法稀释的,实际上约含有7 ng/ul标记探针C.D4出现荧光,标记DNA不够(确定DNA探针量后再进行下一步)D.计算出探针浓度后看需要多少的探针溶液来杂交,如:D6做探针时,每ml杂交buffer用1.25ul的20ng/ul DNA探针溶液在Southern blot检测DNA,D5做探针时,每ml杂交buffer用3.75ul的7 ng/ul DNA探针溶液(25 ngDNA 探针) 在Southernblot检测DNA,D4不能当探针,重做一个.三. 探针杂交southern blot DNA探针的杂交流程在琼脂糖上分离DNA样品条带(30min-2h)↓转移DNA到尼龙膜上(southern blot)A.脱嘌呤和变性DNA(1h)B.用毛细管转移DNA到尼龙膜上(过夜)C.烘烤固定DNA(30 min-2h)↓用DIG-Easy Hyh进行预杂交(30 min)↓DIG-labeled DNA与DNA进行杂交A.孵育标记了DNA探针的尼龙膜(4-16h)B.洗膜,将未杂交的探针洗掉(45 min)1.DNA的电泳分离(1)用TBE配置一块琼脂糖凝胶,胶越薄越好.(注:为了得到理想结果,在胶里不能放EB染色或跑过的buffer,(Ethidium)乙啡啶,假如电泳条带跑的不够长可能会引起背景不均匀的问题. (2)点上少量目的DNA,一般地,目的DNA的浓度要低,如:每个泳道点2.5-5ug人类基因组DNA 或假如基因组比人类DNA还复杂的,每个泳道就跑10ug以上或每个泳道跑<1ng的质粒DNA (3)点上分子量的Marker,相应的每泳道点上5ul的DIG-labeled DNA Marker.(注:需要量依赖于杂交产量,确保点的Marker量足够显示出样品同样位置的条带.(4)跑胶直到DNA分离的很好,用30-50V电压跑胶大约5h左右.(5)为了评价目的DNA 的质量,以0.25-0.5ug/ml EB染色,在紫外灯下成像.(15-30 min)2.把DNA转移到尼龙膜上1).凝胶里变性DNA:用变性溶液(0.5M NaOH,1.5M NaCI)浸没凝胶2X15 min,室温温和振摇,之间用无菌双蒸水冲洗凝胶.2).中和:用中和液(0.5M Tris-HCI,PH 7.5;1.5M NaCI )室温浸没凝胶振摇2X15 min ，之间用无菌双蒸水冲洗凝胶3).用20XSSC平衡凝胶,振摇至少10 min4).按照下述进行blot,避免产生气泡:●放一张已经沾有20XSSC溶液的Whatman 3 MM纸于桥上,然后往槽里放20XSSC●把凝胶放在浸湿了的Whatman 3 MM纸上,用无菌吸管在凝胶与纸之间吸走所有气泡●剪一块与凝胶大小的尼龙膜●放这张膜于含有DNA的凝胶上,按上述方法用移液器消除气泡●然后再加上一层Whatman 3 MM纸,一叠纸巾,一快玻璃板和一个重200-500g的重物,完成印记转移的三明治模式.5).印记过夜在20XSSC溶液里转移，如图示(5cm)封口膜或X片20×SSC6).当印记还湿润时,用下面方法固定DNA到印记上●用2XSSC(不含SDS)简单冲洗膜●在80℃烘考此膜1h.7).膜可继续下面实验或者保存干燥印记(用两张Whatman 3 MM纸包裹密封)4℃保存.3.用DIG easy Hyb进行印记杂交1．杂交●注意：在任何时候都不要让膜干燥。
一. 地高锌-DNA 标记1. 用51-4全长质粒做模板,用BspQ I 和Sca I双酶切,NEBBuffer：10 μLBspQ I： 3 μLSca I ： 2 μL质粒：60ul水：25μL100μL体系先放于37℃的培养箱10小时,然后于50℃水浴, BspQ I作用的温度为50℃, Sca I作用温度为37℃.2.胶回收全长片段(3.2kb)1．100μL酶切产物加loading buffer全上样，电泳后回收3000bp左右的片段。
2．称重加入3倍体积的QG（1g/3mL），50℃水浴10min融胶,其间颠倒2-3次。
3．将液体转移至柱子，13000rpm/min 1min，弃滤液。
4．加入500μLQG，13000rpm/min 1min，弃滤液。
(去除痕量的融胶)5．加入750μL PE，静置5min，13000rpm/min 1-2min.6．13000rpm/min空离2min7．置一新EP管上，加入40μL ddH2O，静置10min，13000rpm/min 1min，收集滤液备用。
用2ul测OD值.(51-4含量:0.28ug /ul)3. 探针反应用H2O 或Tris buffer溶解模板(胶回收的51-4),不能用TE,因为EDTA会抑制探针反应.步骤:1.取4ul 51-4胶回收产物,加双蒸水至16 ul.2. 100℃沸水中放置10min变性,冰上骤冷.3. 混匀DIG-High prime,取4ul DIG-High prime加到上述变性DNA溶液中,混匀,短暂离心,37℃孵化20小时4. 65℃水浴10min二.标记效率的检测1.倍比稀释探针探针反应后的探针量为23000ng .1000ng 模板→20h →probe 2300ng/20ul≈100ng/ul①第一次稀释：10ul probe①加入90ul DNA dilution buffer(10ng/ul)②第二次稀释：5ul ②加入45ul dilution buffer (1ng/ul)③第三次稀释：(2) Control DNA (5ng/ul)的倍比稀释吸取5 ul Control DNA (5ng/ul)加入20 ul的DNA dilution buffer(1 ng/ul)2.点膜(1)取1 ul Control DNA D2-D8点于尼龙膜上,与其相平行的一排点上地高辛标记的DNA D2-D8,最后各点一个dilution buffer.如下图所示.O O O O O O O O ControlO O O O O O O O DigD2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 dilution buffer将尼龙膜放于滤纸上,在其上再放一张等大的滤纸,于80℃烤箱烘烤2 hour.拿出于室温放置.(2)将膜转移到含有20ml washing buffer的封口袋中,室温振摇2min,弃尽washingbuffer(3)加10 ml 1XBlocking solution振摇孵育30 min, 弃尽Blocking solution(4)加10 ml 稀释了104倍的antibody solution振摇孵育30 min,弃antibody solution(5)加10 ml 1Xwashing buffer 洗膜两次,2X15 min,弃washing buffer(6)加10 ml 1Xdetection buffer振摇平衡2-5 min(7)将膜取出放入有双层薄膜的一层薄膜上,加约4滴的CSPD ready-to-use 横跨尼龙膜表面,将袋子的第二层膜盖在含探针DNA的一层薄膜上,尽量不能有气泡.(8)室温孵育5 min(吸尽过量的液体,将薄膜四边封口)(9)37℃孵育10 min(10)进入暗室,压膜一定时间,把压好的片子先放于以1:9稀释好的100 ml的显影液中显影5 min左右,拿出来放入定影液中定影5 min左右,用水冲洗干净,白光下照相.3.探针结果分析A.D6的荧光强度为理想的标记DNA,如:DNA样品按上述方法稀释的,实际上含有20ng/ul标记探针.B.D5 出现荧光,是足量的标记DNA,如: DNA样品按上述方法稀释的,实际上约含有7 ng/ul标记探针C.D4出现荧光,标记DNA不够(确定DNA探针量后再进行下一步)D.计算出探针浓度后看需要多少的探针溶液来杂交,如:D6做探针时,每ml杂交buffer用1.25ul的20ng/ul DNA探针溶液在Southern blot检测DNA,D5做探针时,每ml杂交buffer用3.75ul的7 ng/ul DNA探针溶液(25 ngDNA 探针) 在Southernblot检测DNA,D4不能当探针,重做一个.三. 探针杂交southern blot DNA探针的杂交流程在琼脂糖上分离DNA样品条带(30min-2h)↓转移DNA到尼龙膜上(southern blot)A.脱嘌呤和变性DNA(1h)B.用毛细管转移DNA到尼龙膜上(过夜)C.烘烤固定DNA(30 min-2h)↓用DIG-Easy Hyh进行预杂交(30 min)↓DIG-labeled DNA与DNA进行杂交A.孵育标记了DNA探针的尼龙膜(4-16h)B.洗膜,将未杂交的探针洗掉(45 min)1.DNA的电泳分离(1)用TBE配置一块琼脂糖凝胶,胶越薄越好.(注:为了得到理想结果,在胶里不能放EB染色或跑过的buffer,(Ethidium)乙啡啶,假如电泳条带跑的不够长可能会引起背景不均匀的问题. (2)点上少量目的DNA,一般地,目的DNA的浓度要低,如:每个泳道点2.5-5ug人类基因组DNA 或假如基因组比人类DNA还复杂的,每个泳道就跑10ug以上或每个泳道跑<1ng的质粒DNA (3)点上分子量的Marker,相应的每泳道点上5ul的DIG-labeled DNA Marker.(注:需要量依赖于杂交产量,确保点的Marker量足够显示出样品同样位置的条带.(4)跑胶直到DNA分离的很好,用30-50V电压跑胶大约5h左右.(5)为了评价目的DNA 的质量,以0.25-0.5ug/ml EB染色,在紫外灯下成像.(15-30 min)2.把DNA转移到尼龙膜上1).凝胶里变性DNA:用变性溶液(0.5M NaOH,1.5M NaCI)浸没凝胶2X15 min,室温温和振摇,之间用无菌双蒸水冲洗凝胶.2).中和:用中和液(0.5M Tris-HCI,PH 7.5;1.5M NaCI )室温浸没凝胶振摇2X15 min ，之间用无菌双蒸水冲洗凝胶3).用20XSSC平衡凝胶,振摇至少10 min4).按照下述进行blot,避免产生气泡:●放一张已经沾有20XSSC溶液的Whatman 3 MM纸于桥上,然后往槽里放20XSSC●把凝胶放在浸湿了的Whatman 3 MM纸上,用无菌吸管在凝胶与纸之间吸走所有气泡●剪一块与凝胶大小的尼龙膜●放这张膜于含有DNA的凝胶上,按上述方法用移液器消除气泡●然后再加上一层Whatman 3 MM纸,一叠纸巾,一快玻璃板和一个重200-500g的重物,完成印记转移的三明治模式.5).印记过夜在20XSSC溶液里转移，如图示(5cm)封口膜或X片20×SSC6).当印记还湿润时,用下面方法固定DNA到印记上●用2XSSC(不含SDS)简单冲洗膜●在80℃烘考此膜1h.7).膜可继续下面实验或者保存干燥印记(用两张Whatman 3 MM纸包裹密封)4℃保存.3.用DIG easy Hyb进行印记杂交1．杂交●注意：在任何时候都不要让膜干燥。
