southern blot 杂交

一、Southern杂交问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。

问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。

向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。

利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时，对于大于15kb的 DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率, 但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的 DNA 被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。

如果实验转膜过程中同时含有大于 15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断 DNA 的转移效率，又不会打碎小片段DNA。

另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF 基因为构件，建立转基因小鼠。

转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。

2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。

蛋白、核酸杂交转印膜（PVDF、尼龙膜）技术介绍转印膜：用于蛋白质和核酸的转移和检验过程的微孔膜。

Southern blot：又称Southern 印迹杂交，是研究DNA 图谱的基本技术。

Northern blot：又称Northern 印迹杂交，与Southern blot 方法类似，是检测RNA的基本技术。

Western blot：又称Western 印迹杂交，与Southern blot 方法类似，是蛋白质检测分析的基本技术。

转印膜在蛋白质和核酸的转移和检测过程中应用广泛，不同的转印膜规格和参数不同，选择正确、均一稳定的转印膜对达到最佳的实验结果起到关键性的作用。

常用的转印膜对比：常用的三种转印膜：硝酸纤维素膜（NC 膜）、带正电的尼龙膜（N66膜）、聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）。

C ob e t t er三种转印膜结合DNA或RNA的能力：带正电尼龙膜>PVDF膜>硝酸纤维素膜。

三种转印膜机械强度比较：硝酸纤维素膜较脆，易破碎，不能重复使用；尼龙膜和PVDF 膜机械强度较高，可重复使用。

带正电的尼龙膜可结合短至10bp核酸片段，因此是最理想的核酸杂交转印膜。

PVDF膜机械强度高、耐高温，是蛋白印迹最理想的转印膜。

Cobetter专为蛋白核酸杂交研发了性能优良的转印膜，Cobetter杂交转印膜的种类如下：retteboC⏹N66尼龙转印膜⏹N66尼龙带正电荷转印膜⏹PVDF疏水转印膜⏹PVDF亲水转印膜Cobetter转印膜孔径有0.45um、0.22um 两种。

CobetterN66尼龙转印膜：相比起硝酸纤维素膜而言，其机械强度高，在经历多次杂交、洗脱和标记后不易产生破损和变形，可重复使用，非常适用于核酸检测。

制模过程中通过特殊的表面改性方法嫁接了亲水性的基团，使用过程中不需要再做预润湿处理。

通过在膜表面嫁接羟基基团，改变其表面电荷性能（正电），使得其能紧密结合DNA 而降低背景，快速结合DNA。

Southern Blot印记杂交常见问题解析1、针对不同的实验材料，southern杂交实验难度有差异么？答：不同的实验材料，在进行试验过程中难度差异很大，例如玉米、小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。

(1)、物种本身的基因组较大（例如小麦），检测操作难度大(2)、材料本身含有高糖多酚（例如葡萄）严重影响酶切操作(3)、物种品系复杂（例如玉米），在基因组信息研究层面还不透彻。

2、核酸质量对southern杂交实验的影响答：核酸质量对实验的影响是直接的，既要求客户提供的总量足够——实验消耗（上样量），又要求保证质量——按要求准备材料。

上样量指的是基因组DNA酶切消化后，回收后的DNA片段的量。

根据不同物种的基因组大小不同，上样量也有所区别。

基因组越大，上样量越多。

例如，拟南芥大概需要3ug ，酵母3ug，人8ug，小麦15ug。

酶切消化之后不能直接上样，需要回收纯化。

回收会有损失，最多能损失一半，所以需要客户提供足够量的样品，一般要求至少20 ug的基因组DNA。

（以上上样量均为一个泳道）DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0，OD260/230＞2.0，浓度≥100 ng/ul 。

同时，需要对 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染，无降解弥散，条带清晰。

（如图所示）3、探针设计是怎么回事，有哪些原则？答：探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列，可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。

探针设计有如下几个原则: (1)、长度适中。

探针的片段长度一般控制在300-1000bp，探针太长时会导致非特异性结合的概率增加，探针太短时，探针结合的地高辛标记物太少，会导致发光信号减弱。

(2)、特异性强。

最佳的探针序列是仅与目的基因同源，与整个基因组序列的同源片段低于30%。

southern印迹杂交名词解释Southern印迹杂交是生物学中一个重要的术语，它来源于美国生物学家Edwin Southern所发明的南方杂交技术。

这种技术通常用于DNA分子的检测与分析，在生命科学研究领域具有重要的应用价值。

1.什么是Southern印迹？Southern印迹，又称Southern blot，是一种通过琼脂糖凝胶电泳和酶解技术，将筛选出的DNA样本在膜上进行定向转移，并与特定探针杂交的技术，可以用于检测和分析目标DNA序列。

2.什么是杂交？杂交是指在DNA的两条链之间发生的配对作用。

它是生物学中基本的遗传现象，决定了每个个体的基因型和表型。

3.什么是南方杂交技术？南方杂交技术是一种高效的分子生物学技术，广泛用于分析DNA序列、检测特定基因等方面。

它利用核酸探针与目标DNA的互补配对关系，识别目标DNA序列。

在使用Southern blot技术时，DNA样品首先通过电泳将不同长度的DNA分离出来，然后将其转移到琼脂膜上。

接着，利用探针特异性杂交，标记目标DNA的特定区段。

最后，利用探针上的标记（如酶或荧光）将目标DNA区段从杂交物质中分离出来并检测，以获取样品的DNA序列和长度信息。

4. Southern印迹与Northern印迹、Western印迹有什么不同？Southern印迹用于检测已知DNA序列，与之对应的Northern印迹用于检测RNA序列，而Western印迹则是用来检测蛋白质。

三种印迹技术都是利用探针与目标分子的互补配对关系，识别目标分子，并将其从杂交物质中分离出来以便检测。

5. Southern印迹技术的应用Southern印迹技术具有广泛的应用价值。

它可以用于检测和鉴定病菌、遗传疾病、肿瘤等疾病相关基因，进行生物工程和基因工程的基因克隆和筛选，进行DNA序列测定和鉴定等。

不仅如此，该技术也可以应用于无机化学、有机化学、分析化学等领域。

总之，Southern印迹技术的出现和发展，促进了生命科学、医学和生物工程等领域的发展，也推动了DNA以及其他分子的检测和分析研究。

生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。

在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。

下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。

步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。

DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。

RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。

步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。

可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。

2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。

细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。

3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。

4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。

步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。

根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。

2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。

3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。

启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。

4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。

步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。

Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介姜永均 (江苏省如东高级中学 226400)摘 要 Southern印迹杂交(Southern b l ot)是分子生物学领域中最常用的技术方法之一,该技术是1975年英国爱丁堡大学的E. M.Sou t h ern首创的,Sou t h ern印迹杂交故因此而得名。

后来相继出现了三个原理、过程相似,但是操作对象不同的印迹方法,缘于学界前辈的幽默分别将其称为N ort h ern b l ot、W estern blot和Eastern b l ot,这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。

本文简要介绍了Sou t hern印迹杂交及其相关生物技术。

关键词 Sou t hern印迹杂交 Northern印迹杂交 W estern印迹杂交 Eastern印迹杂交在近年的一些省、市中学生生物奥赛试卷中常涉及到Southern印迹、N outhern印迹、W este m印迹等分子生物学技术。

本文将Sout hern印迹杂交及其相关生物技术作一个简单介绍。

Souther n印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。

Souther n印迹杂交技术1975年由英国人埃德温 迈勒 萨瑟恩(Ed w i n M ellor Southern)创建。

1977年詹姆斯 艾尔文(Ja mes A l w ine)等把此方法应用到RNA的研究方面,称作Northern印迹法。

1979年乔治 斯塔克(G eor ge Stark)等则把该方法扩展应用到单向电泳后的蛋白质分子的分析方面,被称作W estern印迹法。

1982年Re i nhart报道双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,称之为Eastern印迹法。

目前,有人把Sou hern、Nort hern、W esther印迹法分别称作DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法。

Southern blot杂交鉴定（cross identification）1）取10ul待测DNA，于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。

(20mL,1.0%凝胶,) 2) 凝胶用溴化乙锭染色，切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号, 拍照记录电泳结果(拍照时, 凝胶旁放一尺子)。

3) 杂交用胶的制备 (做以下步骤两组合一)A.将凝胶浸没入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脱嘌呤。

B.用蒸馏水短暂洗凝胶2次。

C.将凝胶浸没入30mL变性液中30min, 使凝胶变性。

D.将凝胶浸没入30mL中和液中15min使它被中和。

重复D一次。

在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等(4、5)。

4) 准备DNA从凝胶向膜转移的平台5) 将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。

另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。

准备10 X SSC 转移液。

将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入10 X SSC 转移液中。

6）安装毛细管转移装置A.将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。

B.将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。

C.将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。

D.用保鲜纸封住凝胶四边。

E.将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。

F.将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一玻璃板，其上压一重物。

G.转移几小时或过夜(至少4小时)注意：勿使转移液干枯。

7)已转移的DNA与膜交联A.将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。

B.将膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自动交联。

C.用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，空气中干燥。

此膜可在4℃长期保存。

8)DNA探针的制备(略过)参照生产商提供的实验方法合成地高辛标记的探针。

SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。

2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。

S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％ SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。

4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。

为有效除去蛋白，此步可以重复）。

5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。

6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。

7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。

8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。

9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。

10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。

11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。

12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积 3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。

13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。

14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。

15)DNA样品可以放在4℃保存备用。

B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。

识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。