16 Southern杂交技术

Southern 杂交技术-1Southern技术是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术。

它可用于基因组特定D NA序列的定位，可以测定相关片段的同源性、可以从c库、基因组文库中筛选完整基因等。

用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。

该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。

下面分别介绍利用光敏生物素试剂盒及DIG试剂盒进行杂交的方法。

十五－1:光敏生物素试剂盒杂交实验一仪器：分子杂交仪、摇床、烤箱、取液器、电泳仪、电泳槽二试剂：硫酸葡聚糖钠盐(可不用)、聚乙烯吡赂啉酮（PVP）、聚蔗糖、牛血清白蛋白（BSA）、100mM EDTA、3MnaAC、无水乙醇、电泳缓冲液、切变性鲱鱼精DNA （100ug/ml）20×SSC溶液氯化钠３Ｍ预杂交液６×SSC柠檬酸三钠 0.3M （含100ug/ul变性鲱鱼精DNA）pH 7.0 ５×Denhardt's 溶液0.5%SDS变性液 0.5M NaOH 中和液 1M Tris-HCL pH 7.41.5M NaCL 1.5M NaCL封闭液 3gBSA溶于70ml水中，浓盐酸调pH至3.0,煮沸20分钟后，冷至室温，NaOH调pH至7.5,加入10ml以下缓冲液（1M Tris-HCL pH7.5, MgCL2 0.19%, NaCL 5.8%, T riton X-100 0.05ml）定容至100ml５０×Denhardt's 溶液 1％PVP 1M PBS NaCL 0.8% pH 7.41%BSA KCL 0.02%1%聚蔗糖 Na2HPO4 0.144%KH2PO4 0.024%洗涤液Ａ:２×SSC,250ml中含0.1%SDSＢ：0.1×SSC,250ml中含0.1%SDS Ｃ：Tris-HCL 100mM pH 7.5 Ｄ：Tris-HCL 100mMNaCL 1M NaCL 0.5MMgCL2 2mM Tween 20 0.5% pH 7.5Triton X-100 0.05%亲和素－碱性磷酸酶溶液 Tris-HCL 100mMNaCL 1MMgCL2 2mMTriton X-100 0.05%pH 7.5碱性磷酸酶2-3单位/ml底物溶液 Tris-HCL 100mM pH 9.5 终止液NaCL 100mM Tris-HCL 10mMMgCL2 5mM EDTA 1mM。

分子植物病理学实验--Southern杂交（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。

其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。

膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。

其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。

再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。

最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。

由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。

Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。

（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等）一、基因组DNA的提取（选择方法；提取要完全，CTAB\SDS:去多糖的，冷却后再加好；去上清液要适度）二、基因组DNA的酶切（注意：酶种类、浓度、酶切时间（少于16h）等因素）三、电泳（胶要倒平（平衡！！），厚度一致；胶越浓，孔越小）琼脂糖浓度0.8 %，4℃下低电压缓慢电泳，1V/cm。

四、转膜（为毛细管法，也可电转移）↓首先要在电泳盒中取出凝胶，修胶，切除无用的凝胶部分，将凝胶的左下角切去，以便于定位。

然后将凝胶置于一搪瓷盆中。

（注意：进样孔要切除，因其薄，易透液。

留14cm；切左下角以示标记；用胶片托转）↓将凝胶浸泡于0.25N HCl中10min使其脱嘌呤.↓将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的0.4N NaOH中变性20min。

Southern杂交概述Southern杂交是一种常用于分析DNA序列和判定基因组结构的实验技术。

该技术由英国分子生物学家爱德华·南方于1975年首次提出，并以他的名字命名。

Southern杂交操作简单，适用于各种生物材料，被广泛应用于基因组学和分子生物学研究领域。

原理Southern杂交的原理基于亲和性结合和DNA互补碱基配对的特性。

该技术通过将待检测的DNA样品与一段标记的DNA探针进行杂交，通过探针与待检测样品DNA的配对形成稳定的双链DNA形式。

随后，通过探针上的标记进行检测，从而确定目标DNA序列的存在与否。

步骤Southern杂交主要包括以下几个步骤：1.DNA提取：从样本中提取待检测的DNA。

2.DNA消解：将DNA样本通过限制性内切酶消解为较小的DNA片段。

3.凝胶电泳：将消解后的DNA片段在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，根据DNA片段的大小形成DNA条带。

4.DNA定位：将凝胶中的DNA片段转移到薄膜或膜纸上。

5.杂交处理：将转移到膜上的DNA片段与一段标记的DNA探针进行杂交，探针可以是放射性同位素标记的DNA或荧光标记的DNA等。

6.杂交条件优化：调整温度、盐浓度和杂交时间等条件，以提高杂交效率和特异性。

7.杂交探测：通过探针上的标记进行检测，如放射性同位素检测或荧光检测。

8.数据分析：根据杂交的结果，确定目标DNA序列的存在与否。

应用Southern杂交技术在许多生物学研究中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：1.基因型分析：可以通过Southern杂交技术确定目标基因的存在、拷贝数和序列变异等信息。

2.基因组结构研究：可以通过Southern杂交技术确定目标基因组的结构和大小。

3.DNA重组检测：可以通过Southern杂交技术检测DNA重组事件的发生和定位。

4.DNA甲基化分析：可以通过Southern杂交技术研究DNA甲基化修饰的分布和变化。

5.遗传疾病诊断：可以通过Southern杂交技术检测遗传疾病相关基因的缺失、重复或突变等。

Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介姜永均 (江苏省如东高级中学 226400)摘 要 Southern印迹杂交(Southern b l ot)是分子生物学领域中最常用的技术方法之一,该技术是1975年英国爱丁堡大学的E. M.Sou t h ern首创的,Sou t h ern印迹杂交故因此而得名。

后来相继出现了三个原理、过程相似,但是操作对象不同的印迹方法,缘于学界前辈的幽默分别将其称为N ort h ern b l ot、W estern blot和Eastern b l ot,这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。

本文简要介绍了Sou t hern印迹杂交及其相关生物技术。

关键词 Sou t hern印迹杂交 Northern印迹杂交 W estern印迹杂交 Eastern印迹杂交在近年的一些省、市中学生生物奥赛试卷中常涉及到Southern印迹、N outhern印迹、W este m印迹等分子生物学技术。

本文将Sout hern印迹杂交及其相关生物技术作一个简单介绍。

Souther n印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。

Souther n印迹杂交技术1975年由英国人埃德温 迈勒 萨瑟恩(Ed w i n M ellor Southern)创建。

1977年詹姆斯 艾尔文(Ja mes A l w ine)等把此方法应用到RNA的研究方面,称作Northern印迹法。

1979年乔治 斯塔克(G eor ge Stark)等则把该方法扩展应用到单向电泳后的蛋白质分子的分析方面,被称作W estern印迹法。

1982年Re i nhart报道双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,称之为Eastern印迹法。

目前,有人把Sou hern、Nort hern、W esther印迹法分别称作DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法。

地高辛标记探针的Southern 杂交技术根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。

将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。

它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。

还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。

核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。

其基本过程包括以下几步。

首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印〞上去的，这个过程称为核酸印迹〔nucleic acid blotting〕转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法〔dot and slot blotting〕、菌落和嗜菌斑印迹法〔colony and plaque blotting〕；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。

最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。

根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术〔Dot blot〕、Southern杂交技术〔Southern blot〕、Northern杂交技术〔Northern blot〕。

前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。

本实验主要介绍Southern杂交技术。

1主要内容1. Southern Blot方法的原理。

2. DNA琼脂糖凝胶电泳。

3. DNA转移至硝酸纤维素膜/尼龙膜与膜处理。

Southern杂交和Northern杂交是两种常用的分子生物学技术，它们主要通过探针与DNA序列互相配对来检测目标DNA片段是否存在，并确定其大小和数量。

Southern杂交：Southern杂交是一种检测DNA序列的技术，它利用DNA探针与杂交物中的目标DNA 特异性结合，来检测目标DNA序列的存在和数量。

这种方法一般应用于DNA分子量较大的靶标（如基因、整个染色体等）的检测，可以用于鉴定基因的剪接等多种分子生物学研究。

Southern杂交的原理是将DNA样本在电泳板上进行电泳分离，然后用互补的DNA探针杂交分离出目标DNA，在膜或凝胶上通过探针与目标DNA结合来检测。

Northern杂交：Northern杂交是一种检测RNA序列的技术，它利用RNA探针与杂交物中的目标RNA 特异性结合，来检测目标RNA序列的存在和数量。

这种方法一般应用于研究基因表达调控、细胞信号转导和病理生理等方面。

Northern杂交的原理与Southern杂交类似，也是先将RNA 样本在凝胶上进行电泳分离，然后用互补的RNA探针进行杂交分离出目标RNA，在膜或凝胶上通过探针与目标RNA结合来检测。

Southern杂交和Northern杂交的应用：Southern杂交和Northern杂交技术广泛应用于分子生物学、遗传学及生命科学领域。

它们可以用于：1. 检测基因的表达和剪接变异等2. 研究基因家族和功能3. 鉴定细胞中的某一DNA或RNA序列的存在4. 研究基因转录和翻译的调控机制5. 检测突变或重组基因的存在6. 进行基因诊断和疾病基因筛查等除了上述的应用外，Southern杂交和Northern杂交技术还可以广泛应用于以下领域：1. 植物和动物遗传图谱的构建：能够通过探针与DNA或RNA序列的配对来研究基因表达、调控和功能等信息，对于植物和动物的遗传图谱构建有重要的意义。

2. 生物安全监测：利用Southern杂交和Northern杂交技术可以检测到转基因食品或者是非法贩卖的野生动物制品等违法行为，具有重要的生物安全监测作用。

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Southern印迹杂交实验原理核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。

其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。

由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。

但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。

有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。

该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。

早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。

近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。

利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。

实验方法本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。

一、待测核酸样品的制备（一）制备待测DNA基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。

1. 采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3. 用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。

（二）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。

Sourthern杂交技术摘要: 使用sourthern杂交技术来检测转基因植物中插入外源基因拷贝数。

以含有外源基因水稻转基因植株叶片为材料, CTAB法少许抽提总DNA, 总DNA经限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳、转移尼龙膜上, 最终与地高辛标识探针进行杂交。

经过条带有没有来判定是否为含有外源基因转基因植物, 条带多少反应了转基因植株中外源基因拷贝数。

结果:关键词: 抽提酶切转膜探针杂交Southern 杂交是分子生物学经典试验方法。

该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判定等研究中。

但因为该技术操作比较烦琐、费时, 所以现在有部分其她方法能够替换Southern 杂交。

但该技术也有它独特之处, 是现在其她方法所不能替换, 如限制性酶切片段多态性(RFLP)检测等。

1材料与方法1.1材料及试剂水稻转基因植株叶片、限制性内切酶HindⅢ、尼龙膜、地高辛标识系统试剂盒等。

1.2水稻总DNA少许抽提CTAB法抽提DNA步骤:(1)采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻, 研磨成细粉;(2)取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管, 加入1ml预热至95ºC以上1.5⨯CTAB, 混匀;(3)65ºC水浴中放置30分钟以上, 每隔5分钟上下颠倒混合数次(DNase变性, 促进内溶物释放);(4)1g离心2分钟;(5)吸收600μl上清于新1.5ml离心管, 加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）, 上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色;(6)1g离心5-10分钟;(7)吸收450μl上清于新1.5ml离心管, 加入两倍体积95％乙醇和1/10体积3M NaAc, 轻轻上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现;(8)1g离心10分钟;(9)弃去上清, 用500μl 75％乙醇浸洗沉淀5分钟, 除去离子及CTAB残余, 1g离心5分钟,弃上清,自然干燥;(10)加入50μlTE（含20μg/ml RNaseA）, 放于4ºC溶解;(11)充足溶解后, 测定并调整浓度。

分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术摘要：上世纪70年代美籍华裔科学家简悦威采用Southern印迹杂交技术成功诊断了α地中海贫血症和镰状细胞贫血症，开创了临床分子生物学检验的先河，他是怎样做到的呢？知识点：分子杂交、核酸分子杂交、探针Southern印迹杂交、琼脂糖凝胶电泳技术、印迹技术临床分子生物学检验技术的发展第一阶段：分子杂交第二阶段：PCR第三阶段：生物芯片第四阶段：DNA测序美籍华裔科学家简悦威应用DNA分子杂交技术诊断α地中海贫血(1976)、镰状细胞贫血(1978)分子杂交(molecular hybridization) 两条单链核酸、抗原与抗体、受体与配体等经相互作用重新组成新的杂交分子图片源于网络非原创核酸分子杂交两条序列互补的单链核酸之间(DNA 与DNA ，DNA与RNA或RNA与RNA)借助氢键相连形成杂合双链碱基互补配对A=T,A=U,C≡G杂合双链图片源于网络非原创核酸分子杂交：待测核酸与探针图片源于网络非原创核酸探针 (nucleic acid probe)能与待测靶核酸特异互补杂交的已知被标记的核酸分子核酸探针的标记1.放射性核素标记：32P、3H、35S等2.非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素等分子杂交(molecular hybridization)反应介质液相杂交固相杂交原位杂交印迹杂交Southern印迹杂交(E.M.Southern,1975) ——镰状细胞贫血症的分子诊断(1978)琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创琼脂糖凝胶电泳技术——分离、纯化、鉴定核酸 碱性缓冲液 琼脂糖凝胶 负极 正极核酸加样孔 电极琼脂糖凝胶电泳技术可将分子量和构象不同的核酸分子进行分离小分子量核酸电泳结束后不同分子量的核酸的迁移位置琼脂糖凝胶电泳技术图谱DNA Marker 核酸样品琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术印迹技术 (Blotting）将核酸分子通过一定方式转移并固定到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上印迹技术膜核酸凝胶琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创应用Southern印迹检测红色特异DNA片段1. 从样品中提取DNA并通过限制性核酸内切酶消化样品DNA2.消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离3. 凝胶中DNA经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交6. 通过洗涤除去未杂交的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段Southern 印迹技术1. 通过限制性核酸内切酶消化样品DNA，2. 消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离，3. 凝胶上被分离好的DNA片段经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定，5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交，6. 杂交后洗脱未特异结合的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA 片段杂交检测杂交信号预杂交制备携带标记的核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针图片源于网络非原创应用Southern印迹杂交技术诊断镰状细胞贫血？分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术。

Sourthern杂交技术摘要：使用sourthern杂交技术来检测转基因植物中插入的外源基因的拷贝数。

以含有外源基因的水稻转基因植株叶片为材料，CTAB法少量抽提总DNA，总DNA经限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳、转移尼龙膜上，最后与地高辛标记的探针进行杂交。

通过条带的有无来判断是否为含有外源基因的转基因植物，条带的多少反映了转基因植株中外源基因的拷贝数。

结果：关键词：抽提酶切转膜探针杂交Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。

该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。

但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。

但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。

1材料与方法1.1材料及试剂水稻转基因植株叶片、限制性内切酶HindⅢ、尼龙膜、地高辛标记系统试剂盒等。

1.2水稻总DNA的少量抽提CTAB法抽提DNA步骤：(1)采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，研磨成细粉；(2)取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管，加入1ml预热至95ºC以上的1.5⨯CTAB，混匀；(3)65ºC水浴中放置30分钟以上，每隔5分钟上下颠倒混合数次(DNase变性，促进内溶物释放)；(4)12000g离心2分钟；(5)吸取600μl上清于新的1.5ml离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色；(6)12000g离心5-10分钟；(7)吸取450μl上清于新的1.5ml离心管，加入两倍体积95％乙醇和1/10体积3M NaAc，轻轻的上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现；(8)12000g离心10分钟；(9)弃去上清，用500μl 75％乙醇浸洗沉淀5分钟，除去离子及CTAB残余，12000g离心5分钟，弃上清,自然干燥；(10)加入50μlTE（含20μg/ml RNaseA），放于4ºC溶解；(11)充分溶解后，测定并调整浓度。

一基因组酶切和电泳在200 μl 微量离心管中加入：25 μl DNA样品(约10μg)，3μl 限制性内切酶（MBI，10 U/ μl）5 μl 相应的10×buffer，补水到50μl。

然后加一滴矿物油覆盖, 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。

酶切完后，取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。

如果酶切充分，灌制0.8%的agrose胶，加入上样buffer后，在25—30V 稳压电泳12—16hrs。

注意：在southern杂交中对，DNA的质量要求较高，否则酶切不完全导致失败。

二转膜1 用0.2MHCl 脱嘌呤处理，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全变成黄色，大约需要15~30分钟。

然后用水漂洗凝胶2~3次，将水倒尽，加入碱变性液，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色（大约需要20~30分钟）。

注意：此方法对酶切后目标片段大于15kb时用，如果小于15kb最好不要进行脱嘌呤处理，否则容易将片段打断，导致转膜后结合不紧密。

2 取一磁盘架上一洗净玻璃板，在磁盘中倒入适量的转膜缓冲液，在玻璃板上架两层长滤纸（30cm左右）（注意不要产生气泡）搭成盐桥。

（滤纸比胶弱宽）依胶大小裁好尼龙膜，写好标记，正面向下，紧贴于胶上，防止有气泡产生，接这压两张同样大小的滤纸，不可过大以免短路，胶周围用X光片压条。

胶应反面朝上因为DNA多在胶的底层。

堆积吸水纸。

上面放一小玻板，板上加一500 g左右的重物。

注意：防止短路3 转膜16---20hrs后，将尼龙膜取下，胶染色，观察转膜效果。

将膜用2xSSC浸泡20分钟，滤纸吸干后放在烘箱中烘2hrs（80℃）。

待用。

三杂交¨杂交炉与杂交管预热至65℃¨尼龙膜用2×SSC浸泡配置杂交液ssDNA沸水变性10min，冰浴10min，置冰浴备用Components Volume (ml) NoteddH2O 20.750×Denhardts 0.6P/H stock 8.120% SDS (OR 10% SDS) 0.3 (OR 0.6)Total 30 ml for 2 blots. 65℃预热.Add prepared ssDNA （10mg/L）≥0.3 ml倒入杂交液，加入尼龙膜，65℃预杂交4~5小时（新膜）注意：赶尽膜与膜之间的气泡后把几张膜同时放入杂交管，并用玻棒赶尽膜与管壁之间的气泡，最后加入杂交液，盖好管盖。

基本概念及原理Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。

一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DN A片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量[1][2]。

基本方法及主要步骤Southern印迹杂交的基本方法包括四部分，以下以植物southern印迹杂交为例。

（1）植物基因组DNA提取；（2）DNA的限制性内切酶酶解、电泳和Southern转移；（3）探针的标记和纯化；（4）杂交、洗膜、检测以及去除膜上探针。

主要操作步骤：1．琼脂糖电泳（1）取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。

DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要10～20μg；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要30～50μg。

（2）酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。

（3）电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。

2．印迹转移（1）切胶并作标记（左下角切除），以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。

Southern印迹杂交转膜示意图（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h 使之变性，不间断地轻轻摇动。

变性缓冲液：1.5mol/L Nacl0.5 mol/L NaOH（3）将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30 min，不间断地轻轻摇动。

更换中和液，继续浸泡15 min。

（4）将滤纸，硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer中平衡30 min。

（5）按右图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。

（6）虹吸转移12-16h。

转膜液： 1.0mol/L Nacl0.4 mol/L NaOH3．固定DNA碱性转移不需要固定，在中性缓冲液中室温15分钟。

Southern杂交原理的应用1. Southern杂交的基本原理Southern杂交是一种常用的分子生物学技术，用于检测特定DNA序列在给定样本中的存在与表达情况。

它基于DNA的互补配对原理，通过将待测DNA与已知DNA序列进行杂交反应，然后通过检测反应产物来确定目标DNA是否存在。

Southern杂交实验通常包括以下步骤：1.DNA提取：从待测样品中提取DNA，并经过酶切等处理，将复杂的DNA样品变成易于分析的特定DNA片段。

2.DNA电泳：将DNA样品根据大小分子量在琼脂糖凝胶中进行电泳分离，以得到待测DNA片段。

3.DNA转移：将电泳分离后的DNA片段转移到膜上，通常是通过电泳转移（electroblotting）或吸附转移（capillary blotting）的方式。

4.杂交：将已知DNA序列与待测DNA膜进行杂交反应，其中已知DNA序列可能是标记过的探针（probe）或同源基因组DNA。

5.检测：通过封闭法（i.e., 冷光法或放射性法）或非封闭法（i.e., 荧光原位杂交法）来检测杂交反应产物，从而确定目标DNA是否存在。

2. Southern杂交的应用Southern杂交技术在分子生物学和基因组学的研究中有着广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：2.1 基因组DNA定量Southern杂交可用于检测和定量目标基因组DNA的存在。

通过使用特定探针，可以确定基因组中的某个DNA序列是否存在，并通过探针的信号强度来评估该序列在基因组中的数量。

2.2 基因突变分析Southern杂交可用于检测基因组DNA中的突变。

通过与野生型DNA进行杂交，可以检测突变DNA片段的变化，从而识别基因突变。

2.3 基因拷贝数分析Southern杂交可用于检测基因拷贝数的变异。

通过与标准DNA进行比较，可以确定目标DNA的拷贝数，并评估在不同个体或物种之间的差异。

2.4 基因组同源性分析Southern杂交可用于研究不同物种或个体之间的基因组同源性。

Southern 杂交Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。

其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。

(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒)通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。

该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。

但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern杂交。

但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。

一、基因组DNA的制备（前述）(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送)二、基因组DNA的限制酶切(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)根据实验目的决定酶切DNA的量。

(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。

购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该的产品目录上查到最佳消化温度。

为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。

消化的DNA 浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。

由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。

具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入DNA（1μg /μl）20 μg10×酶切buffer 4.0 μl限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl加ddH2O 至500 μl在最适温度下消化1-3hr。

消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。

如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。

Southern杂交的名词解释Southern杂交是一种经过精心培育的杂交品种，它在农业领域中广泛应用，并在近年来取得了显著的成果。

在本篇文章中，我们将探讨Southern杂交的概念、背景、应用和未来发展。

Southern杂交是指将两个或更多不同的品种进行杂交，以获得具有优良性状的新品种。

这种杂交通常涉及利用种子的亲代和选定的杂交组合，以创建新的种子，这些种子将具有双亲的优良特性。

Southern杂交的目标是改良农作物的产量、耐病性和适应性，以应对日益严峻的农业生产环境。

Southern杂交的历史可以追溯到上个世纪的农业改良运动。

科学家们开始研究，以改善作物品种的遗传特性。

为了实现这一目标，他们发展出一种繁育方法，通过将不同品种的特点结合在一起，创造出新的品种，从而提高作物的产量和抗病能力。

Southern杂交的成功离不开科学家们对于遗传学的深入研究。

通过对亲代的选择，科学家们能够确定具有优异特性的基因，并将其传递给后代。

这种选择性杂交和基因传递的方式极大地加速了作物改良的进程，为农业生产带来了巨大的突破。

在Southern杂交的应用中，最常见的例子是玉米。

玉米是一种主要作物，对全球粮食供应具有重要影响。

通过Southern杂交，科学家们成功地培育出了高产和抗病的玉米品种，以满足不断增长的全球需求。

除了玉米，Southern杂交也在其他作物如小麦、稻米和蔬菜中得到了广泛应用。

通过选育具有抗虫、抗草、抗病以及适应不同环境条件的高产品种，农民能够获得更高的收益和更好的生产效益。

这对于解决全球食品安全和粮食短缺问题至关重要。

然而，Southern杂交也面临着一些挑战和争议。

一些人担心杂交品种可能会影响天然遗传多样性，导致生态系统的不平衡。

此外，种植Southern杂交作物还需要额外的资源和投资，因此对于一些小规模农民来说可能不太实际。

未来，Southern杂交将继续发展和创新。

科学家们将进一步研究和利用基因编辑技术，以更精确地改良作物品种。

Southern 杂交（一）目的通过分子杂交，检测重组DNA分子中插入的外源基因是否确是原供体中的某一基因片段。

（二）原理Southern 印迹杂交是指将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维膜），再通过特异性的探针杂交来检测被转移的DNA的片段的一种技术。

Southern 杂交的实验流程如下：基因组DNA样品的限制性酶切-> 酶切样品的琼脂糖凝胶电泳-> DNA的变性、转膜与固定-> 杂交与杂交后清洗-> 杂交结果的检测（三）材料1.基因组DNA样品的限制性酶切：1）样品：GFP蛋白基因2）试剂：限制性内切酶；10x酶切缓冲液；0.5mol/L EDTA；Tris-饱和酚；氯仿/乙醇=24：1（体积比）；预冷无水乙醇和70%乙醇；TE缓冲液3）仪器及器材：恒温水浴锅；电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪2.酶切样品的琼脂糖凝胶电泳：1）样品：上一个实验的酶切产物2）试剂：琼脂糖；1xTAE缓冲液；6xDNA加样缓冲液；EB溶液；DNA分子量标准（DNA Marker）3）仪器及器材：电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪；凝胶成像分析系统；微量移液器3.DNA的变性、转膜与固定：1）样品：电泳后的琼脂糖凝胶2）试剂：水解液（0.25mol/L HCL）；变性液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L NaOH, 0.2mol/L HCL）；中和液（1mol/L Tris-HCL pH=7.4, 1.5mol/L NaCl）；硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜；碱性转移缓冲液（0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCl）；20xSSC（3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸三钠pH=7.0）；20xSSPE（3.6mol/L NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4, 0.02mol/L EDTA pH=7.7）；50xDenhardt 试剂（5g聚蔗糖Ficoll 400, 5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白，加入无菌蒸馏水至500ml）3）仪器及器材：印迹转膜装置（托盘、支持物、Whatman 3MM滤纸、纸巾、玻璃板、重物等），紫外交联仪4.杂交与杂交后清洗：1）样品：固定了DNA酶切样品的硝酸纤维膜2）试剂：预杂交液（6xSSC, 5xDenhardt试剂, 0.5% m/V SDS, 1μg/ml polyA, 100μg/ml 鲑鱼精DNA, 50% V/V 甲酰胺）3）仪器及器材：杂交管（瓶），杂交炉5.杂交结果的检测：1）样品：杂交后已清洗的NC膜2）试剂：显影液，定影液3）仪器及器材：X线胶片，X线胶片盒（带增感屏），保鲜膜（四）步骤基因组DNA样品的限制性酶切：1）酶切：在1.5ml离心管中依次加入ddH2O Xμl；1μg/μl DNA 20μg；10x酶切缓冲液4.0μl；10U/μl限制性内切酶5.0μl，总体积500μl。

southern杂交原理Southern杂交原理是一种分子生物学技术，常用于研究DNA序列。

它是由爱德华·南方（Edwin Southern）于1975年提出的，被广泛应用于DNA杂交等领域。

Southern杂交原理主要是通过将DNA样品与DNA探针杂交，然后用放射性同位素或化学荧光等方法检测杂交的情况，从而确定目标DNA序列的存在与否。

这一原理的核心是通过互补配对的碱基间形成稳定的双链结构，从而实现DNA的特异性识别与检测。

在Southern杂交实验中，首先需要提取待检测的DNA样品。

这可以通过细胞裂解、DNA纯化等方法来完成。

然后，将目标DNA序列与DNA探针进行杂交反应。

DNA探针是一段已知序列的DNA 片段，通常是标记有放射性同位素或荧光染料的单链DNA。

在杂交反应中，目标DNA序列与DNA探针通过互补配对的碱基结合在一起形成双链结构。

通过探针的标记物可以追踪杂交的情况。

放射性同位素通常用于探测杂交产物，而化学荧光则常用于非放射性检测。

完成杂交反应后，需要进行杂交产物的检测与分析。

对于放射性同位素标记的探针，可以通过放射性测量仪来检测杂交产物的放射性信号强度。

而对于化学荧光标记的探针，可以通过荧光显微镜或荧光成像仪来观察和记录荧光信号。

Southern杂交原理的应用非常广泛。

例如，它可以用于检测特定基因的存在与表达情况，研究基因组结构与功能，鉴定DNA的来源，进行亲缘关系分析等。

此外，Southern杂交还可以与其他分子生物学技术相结合，如聚合酶链反应（PCR），构建DNA文库等，进一步拓展其应用范围。

Southern杂交原理是一种重要的分子生物学技术，通过DNA的互补配对和标记物的检测，实现了对目标DNA序列的高度特异性识别与检测。

它在基础研究、临床诊断、法医学等领域具有广泛的应用前景，为科学研究和医学诊断提供了有力的工具和方法。