双水相萃取法
- 格式:docx
- 大小:14.96 KB
- 文档页数:3
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术,是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的,目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。
双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时,具有操作简单、体系含水量高,在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化,包含在一些蛋白分离公司提供的服务。
早期,如在20世纪60年代,有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究,得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。
双水相系统具有温和的操作条件,对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是:聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。
当待分离物质进入体系后,由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响,使其在上、下相中的分配系数不同,通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配,从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点:(1)易于放大,各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1];(2)双水相系统传质和平衡过程速度快,回收效率高、能耗较小;(3)易于进行连续化操作、设备简单,且可以直接与后续提纯工序相连接,无需进行特殊处理;(4)相分离条件温和,双水相体系的张力很小,有利于保持生物分子的活性,可以直接用在发酵液中;(5)影响双水相体系的因素比较复杂,可调参数多,便于改变操作条件提高纯化效果。
美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务,可以根据客户要求,提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务,并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶,在粮食、食品加工,以及医药行业等都经常使用,由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶,周内外很多课题组对它进行了研究。
双水相萃取一实训目的掌握双水相萃取的原理及方法。
学习双水相萃取相图的制作。
二实训原理双水相萃取法(aqueous two-phase extraction)是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。
高聚物PEG和盐(硫酸铵)形成的互不相溶的两相,倒入牛奶中,蛋白质富集在一相中。
三实训仪器和药品试管,离心机,天平,离心管,三角瓶,滴定管,聚乙二醇2000(PEG2000),硫酸铵,牛奶。
四实训步骤1 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定(1)取10%PEG2000溶液10mL于三角瓶中;(2)用40%硫酸铵溶液装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液出现浑浊,记录硫酸铵消耗的体积。
加入1mL水使溶液澄清,继续用硫酸铵滴定至浑浊,重复7~8次,记录每次硫酸铵消耗的体积,计算每次出现浑浊时体(3)以硫酸铵的浓度(W/V)为横坐标,PEG浓度(W/V)为纵坐标,绘制出PEG2000-硫酸铵双水相体系相图。
2PEG2000-硫酸铵双水相体系的配制自行在相图中双水相区选择一个点,根据该点的PEG2000浓度和硫酸铵浓度,分别量取适量的10%PEG2000溶液和硫酸溶液,混合均匀后以2500rpm/min离心5min后分相,得到双水相体系(总量约3mL)。
3利用PEG2000-硫酸铵双水相体系萃取分离牛奶中的蛋白质取1mL 牛奶装入上述双水相体系中,搅拌均匀,于2500rpm/min 离心5min,静置分层,分别量取上下相的体积。
萃取完成后,如果牛奶中的蛋白质不能被萃取到上相,则证明所选的1PEG2000 与硫酸铵浓度不对,应重新选择。
五结果与讨论1如果正确地绘制相图。
2如何根据相图配制双水相体系,并对混合物进行分离。
2。
三、双水相萃取3.1双水相萃取的原理及特点3.1.1双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
3.1.2双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点:(1)含水量高(70%〜90%),是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取,不会引起生物活性物质失活或变性;(2)分相时间短,自然分相时间一般为5~15min ;⑶界面张力小(10-7〜10-4mN/m),有助于强化相际间的质量传递;⑷不存在有机溶剂残留问题;(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去,使分离过程更经济;(6)易于工程放大和连续操作。
由于双水相萃取具有上述优点,因此,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
3.2双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。
在黄豆匀浆中加入PEG4000,可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。
在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%),PGK在上相、GAPGH 在下相的收率均在80%以上。
萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液,用离心萃取器完成双水相体系的两相分离,整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。
用PEG/(NH4)2SO4 双水相体系,经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取a淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2S04(20%),pH=8,a淀粉酶收率为90%,分配系数为19.6,蛋白酶的分离系数高达15.1。
双水相萃取法的应用及研究进展
摘要:双水相萃取技术作为一项新的分离技术日益受到重视,它与传统的萃取及其它分离技
术相比具有操作条件温和、处理、量大、易于连续操作等优点,从而使其能广泛应用于生物分离工程中。
本文介绍了双水相的形成、双水相萃取技术的基本原理以及影响物质分配系数的因素。
同时对双水相萃取技术的研究进展及其应用进行了综述。
关键词:双水相萃取分离纯化进展
一:方法
随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新技术研究工作的广泛开展,各种高附加值的生化新产品不断涌现,对生化分离技术也提出了越来越高的要求。
包括精馏、吸收、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术有三大特点:分离过程伴随有相的变化;筛分过程不能实现分子级别的分离;精制过程成本极高,这些特征对于节约能源、生物分离、环境
保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术发展不相适应。
围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流,即新型分离技术产生的背景。
双水相萃取技术始于20世纪60年代,从1956年瑞典伦德大学Albertsson发现双水相体系[2]到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离,虽然只有20多年的历史,但由于其条件温和,容易放大,可连续操作,目前,已成功的应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化,双水相体系也已被成功的应用到生物转化及生物分析中。
双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时,由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性,使得聚合物或无机盐浓度达到一定值时,就会分成不相溶的两相,因使用的溶剂是水,因此称为双水相原则上,无论是天然的还是合成的亲水聚合物,绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时都可分成两相,构成双水相体系。
双水相萃取与水一有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。
对于某一
物质,只要选择合适的双水相体系,控制一定的条件,就可以得到合适的分配系数,从而达到分离纯化之目的。
二:讨论
双水相萃取是一项可以利用不复杂的设备,并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和有效成分的新型分离技术。
因此,广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域。
然而有关双水相分配的基础研究还不够,工业化的一些关键问题还没有解决。
为此,有必要加强这方面的基础研究,解决大规模萃取生物活性物质的工艺条件和设备方面的问题,促进双水相萃取技术的不断发展。
影响双水相萃取的因素比较复杂,主要包括静电作用、疏水作用和界面张力等。
通过对各个因素的调节,可以极大地提高蛋白质的选择性,达到向一相富集的目的。
A 1}'帅的组分性质千差万别,从晶体到无定形聚合物、从非极性到极性、从电解质到非电解质、从无扫L 小分子到有扫L高分子甚至生物大分子,这些都不可避免地造成理论计算的复杂性,以至
于现在还没有一套比较完善的理论来衡量各个影响因素之问的关系和解释生物大分子在体
系中的分配扫L理.有关A丁PS分配模型的研究中,较为成功的有的渗透维里模型,以及晶格模型。
前者在预测聚合物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度;后者在粒子的能
量概念上很好地拟合了实验数据,得出蛋白质分配的基本驱动力。
蛋白质分配焙驱动力由两部分组成:一是蛋白质和其它组分格子的直接相互作用,另外,就是构成相的组分(溶质除外,比如蛋白质)由纯组分到混为一相所需的总的焙值,即相的“自身能量”。
直接相互作用项为负值,则蛋白值更易分配到该相中,具有较高“自身能量”的相也使蛋白质更容易进入。
混合嫡也会促使蛋白质进行不平衡分配,在没有焙的影响卜,蛋白质更易分配到具有更高分子密度的相中等从寸展理论出发,用把相问电势表达为上卜相浓度差的二次函数来关联分配系数的方法,提出了能对肤和蛋白质在非离子型聚合物/非离子型聚合物冰体系的分配系数很好关联的模型通过引入对聚合物水溶性和预分离物质(氨基酸、肤、蛋白质)的水化壳进行掐述的因子得到了改进的膜型,此模型很好地模拟了73种由组成的相平衡和分配系数.完善液液平衡理论,用掐述分配行为的因子来修正液液平衡理论的热力学模型,建立和完善双水相萃取机理的理论仍是研究的重点和难点。
新型功能双水相体系是指高聚物易于回收或操作简便的双水相体系随着双水相技术研究的不断深入,新的双水相体系表而活性剂表而活性剂水体系、普通有机物无机盐水体系、双水相胶束体系等体系相继被发现。
三:结果
双水相萃取技术是近年来新发展起来的分离技术,所需设备简单、条件温和、易于操作,且可以获得较高的收率和较纯的有效成分,与常规的有机溶剂萃取技术相比较,最大的优势在于可保持生物物质的活性及构象,因此在生物工程、药物分析、环境科学等方面有着广阔的应用前景。
然而,相关研究和应用还不够深入,一些技术难题还有待解决。
双水相萃取技术的发展趋势为:(1)解决易乳化、相分离时间长、成相聚合物的成本较高、水溶性高聚物粘度较大且不易定量控制等问题;(2)开发新型优质的双水相体系;(3)进一步拓宽应用领域;(4)与其它技术结合的多元化利用。
参考文献:
1]马春宏,朱红,王良,姜大雨,闫永胜,王庆伟.双水相萃取技术的应用研究进展[J].光谱实验室,2010,05:1906-1914.
[2]江咏,李晓玺,李琳,胡松青.双水相萃取技术的研究进展及应用[J].食品工业科技,2007,10:235-238.
[3]辜鹏,谢放华,黄海艳,王丹.双水相萃取技术的研究现状与应用[J].化工技术与开发,2007,11:29-33.
[4]徐长波,王巍杰.双水相萃取技术研究进展[J].化工技术与开发,2009,05:40-44.
[5]谭平华,林金清,肖春妹,郝三存.双水相萃取技术研究进展及应用[J].化工生产与技术,2003,01:19-23+51.
[6]杨善升,陆文聪,包伯荣.双水相萃取技术及其应用[J].化学工程师,2004,04:37-40.。