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一个拟南芥叶表皮细胞发育突变体的筛选及基因定位的开
题报告
题目：一个拟南芥叶表皮细胞发育突变体的筛选及基因定位
摘要：
拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，凭借其基因组完整和遗传转化容易等特点被广泛应用于植物遗传和分子生物学研究中。
本项目旨在筛选出一个拟南芥叶表皮细胞发育突变体，并利用基因定位技术确定其突变位点。
首先，将拟南芥野生型进行EMS（甲基磺酸乙酯）诱变，得到突变种群。
接着，从突变种群中筛选叶表皮细胞发育异常的个体采集其种子，并通过自交得到homozygote种子。
随后，将突变体进行苗期观察、表皮形态与构成分析，筛选出一个具有明显瑕疵的突变体。
通过对该突变体进行染色体手段的遗传分析，最终确定其为单一隐性突变。
最后，借助拟南芥基因组信息，以突变体的DNA为探针进行定位，利用PCR扩增和测序技术找出突变点所在的染色体和位置。
此外，还将对突变体的基因表达谱进行研究，从而确定其突变点的遗传机制和信号通路等等。
通过本项目的实验研究，将为拟南芥相关领域的研究提供一个新的突变体，同时还可以为植物基因定位和遗传分析提供新的方法。
拟南芥ABI3基因缺失突变体的鉴定及对盐胁迫的响应赵彦敏;高海琴;瓮巧云【摘要】采用PCR和RT-PCR技术分别在DNA和RNA水平上对由于T-DNA 插入所导致的拟南芥ABI3基因突变体进行鉴定,鉴定后将野生型Col-0与纯合abi3突变体种子分别置于含不同浓度NaCl的MS培养基上培养,测定萌发率、生物量和根长.结果表明:在NaCl胁迫下,野生型Col-0和纯合abi3突变体种子的萌发率、生物量和根长均随着NaCl浓度的增加呈现下降趋势.在相同NaCl浓度下,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均低于野生型Col-0.当NaCl浓度达到150 mmol/L时,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均降到最低,与野生型Col-0存在极显著差异.可见,拟南芥ABI3基因具有提高拟南芥抗NaCl 胁迫能力的作用.【期刊名称】《上海农业学报》【年(卷),期】2018(034)004【总页数】4页(P7-10)【关键词】ABI3基因;T-DNA插入;突变体;NaCl胁迫【作者】赵彦敏;高海琴;瓮巧云【作者单位】张家口广播电视大学,张家口075000;张家口广播电视大学,张家口075000;河北北方学院农林科技学院,张家口075000【正文语种】中文【中图分类】Q943.2植物在生长发育过程中,不可避免地会受到各种非生物因素如干旱、低温、高盐及高温等的胁迫,导致农作物的生长品质及产量下降。
作为植物体内重要的逆境响应激素之一,脱落酸(Abscisic acid,ABA)既是胁迫的诱导产物,又是胁迫信号的传导者,通过级联放大反应,能迅速参与到植物抗胁迫的反应中。
此外,脱落酸还参与植物生长的其他环节,如能促使马铃薯形成块茎、抑制种子的萌发等。
早期通过正向遗传学方法筛选到一些在萌发率上对 ABA不敏感的拟南芥基因,如 ABI1-1、ABI2-1、ABI3、ABI4和ABI5[1-4];作为ABA信号的正调控转录因子ABI3基因,在植物的抗旱性和耐盐性功能中起重要的作用[5],主要在种子里表达[2]。
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
模式植物拟南芥的去雄和授粉实验
授粉是高等植物有性生殖的关键环节，这一过程包括花粉在柱头细胞上黏附、花粉的水合、花粉管的萌发及伸长等，其中涉及很多复杂而有序的调控机制，近年来人们在这一方面的分子机制研究中已取得诸多进展。
本研究鉴定到拟南芥UPS基因的两个不同位点的T-DNA插入突变体，这两个突变体的杂合体自交后代中杂合体植株数与野生型植株数的比例接近1∶1，没有纯合突变体。
分析杂合体植株与野生型植株互交后代基因型发现，该基因的突变导致雄配子体传递率显著下降。
但是亚历山大染色、DAPI染色和体外萌发实验表明杂合体植株的花粉在形态、活性等方面与野生型植株的花粉相比没有明显差异。
但是柱头表面突变的花粉粒容易被表面活性剂NP-40冲洗掉，突变体的花粉粒不能在柱头上萌发并生长出花粉管。
ups突变体的成熟花药中含有两种结构不同的花粉粒，一种与野生型类似，均匀分布大量电子透明的小液泡，约占花粉的62％。
另一种花粉富含许多大液泡，细胞质的电子密度也明显增大，这类花粉粒的线粒体内膜也变地较为模糊。
表明ups突变导致花粉的液泡和线粒体发育出现异常，可能是突变体花粉粒不能在柱头上萌发的原因。
GUS活性分析及原位杂交结果显示UPS在花粉发育过程中表达，11时期花药（花药开裂前，药室退化为两室）中
的花粉UPS表达量最高，但到花粉成熟散出时，却检测不到UPS的表达。
本研究通过研究UPS在花粉与柱头互作中的作用，进一步补充花粉与柱头相互作用中基因的调控网络，使人们进一步了解雄配子体基因在花粉与柱头互作中的作用。
拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法随着生物技术的快速发展，从分子到基因组层面的遗传研究已经成为许多生物学实验室的重要研究方向。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)则是其中一种最常用的模式植物，它拥有许多基因遗传和发育过程的相似性，因此被广泛用于生物学研究。
本文将着重介绍拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法。
1. DNA转化和质粒构建在拟南芥基因研究中，DNA转化和质粒构建是十分重要的实验方法。
DNA转化即将外源DNA导入拟南芥细胞内，常使用的方法有冷冻处理法、电穿孔法等。
而质粒通常可以用于转化拟南芥细胞，以研究基因结构、调节元件、绿色荧光蛋白构建等。
2. 基因敲除基因敲除是在已知某个基因的功能和表达模式，并通过基因突变得以验证。
敲除分为生理性敲除和人工性敲除两种，其中后者可以通过质粒导入方法实现。
基因敲除在拟南芥遗传学研究中被广泛应用，可以探究基因对于生长发育过程的途径以及在各种逆境下的适应能力等。
3. 基因表达基因表达研究是在基因的各种调节元件上构建不同启动子，将被测量的基因与这些元件进行组合，从而研究基因表达的条件和模式。
例如通过全基因组转录组分析方法，可以了解到各种条件对基因表达的影响。
基因表达研究在植物逆境抗性和发育过程等方面都有广泛的应用。
4. 突变体筛选突变体是指基因序列中发生变异引起的表型重要变化，通常是由于自然或人为诱变引起。
突变体的筛选在拟南芥属植物分子遗传学中有着重要的地位。
目前已开发出几十种突变体筛选方法，包括靶向突变、随机诱变、胚乳培养及基因组分析等。
通过筛选突变体，我们可以了解到基因在植物生长发育中的重要性和相互间的关系。
5. 遗传交叉和构建突变遗传交叉是通过交叉杂交的方式寻找某一特定基因或显性性状的控制，以了解基因型和表型特征之间的关系。
而构建突变则是利用特定的载体将人工合成的单个核苷酸序列插入到目的基因中，从而创造特定的基因突变。
这些方法在研究基因调控途径、寻找新型基因等方面都有着重要的应用。
HY5‐215The Arabidopsis HY5 gene encodes a bZIP protein that regulates stimulus‐induced development of root and hypocotyl, Genes Dev. 1997 Nov 15; 11(22): 2983–2995.In the genome of hy5‐215, the splicing acceptor site of the first intron (=G) was replaced by A, suggesting that this mutation causes aberrant RNA processingIn hy5‐215, the nucleotide g‐1117 (white letter), which is the last nucleotide in the first intron, is replaced by an aHY5‐215的突变位点与野生型相比，并没有酶切位点的变化。
引物在有一个错配位点的情况下，可以产生一个新的酶切位点PsiI，从而将野生型、杂合、纯合进行区分。
Design proper primers and choose proper a enzyme by dCAPS Finder 2.0(/dcaps/dcaps.html)HY5proF GAGAGAATATGCGAGTGAATGAC Len 22 TM 54 HY5proR TCTAAAGTCTCTTTTATGTTTTA T A Len 25 TM 50.8PsiI:但是，实验室并没有PsiI ，所以只能再去寻找新的内切酶。
在设计的引物有2个错配位点时，可以产生新的酶切位点，AluI 将野生型切断。
HY5-215 F CGTATCTCCTCATCGCTTTCAATAG Len 25 TM 60.0 HY5-215 R GTCCCGCTCTTTTCCTCTTTATC Len 23 TM 60.8AluI:MYCTThe Arabidopsis bHLH Transcription Factors MYC3 and MYC4 Are Targets of JAZ Repressors and Act Additively with MYC2 in the Activation of Jasmonate Responses, Plant Cell. 2011 Feb; 23(2): 701–715.MYC2Mutagen : T‐DNA insertionInsertion FlankingSequence:TAAAACCGCCGGAGAATCAGATCACTCCGATCTAGAAGCT(Length:40)根据T‐DNA PrimerDesign（/tdnaprimers.2.html）设计引物PRODUCT_SIZE 1186Myc2LP TGGTTTTTCTTGGTTTCGATG Len 21 TM 59.96Myc2RP CTCTAATCATTGCGTCCCAAC Len 21 TM 59.58LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC BP+RP_PRODUCT_SIZE 558‐858MYC3Mutagen : T‐DNA insertionmyc3 F AAGGTGGGTTGTTGAAATCTAATG Len 24 TM 58.3myc3 R GTTTTCTCCGACTTTCGTCATCA Len 23 TM 61T-DNA ATATTGACCATCATACTCATTGC Len 23 TM 55.2MYC4Mutagen : T‐DNA insertionmyc4 F TCTCTCACAACTTGATCCAGCTAA Len 24 TM 60.0myc4 R TAACCGATTACCATCTCAACCAA Len 23 TM 59.2T-DNA ATATTGACCATCATACTCATTGC Len 23 TM 55.2Phyb‐9Mutations in the gene for the red/far‐red light receptor phytochrome B alter cell elongation and physiological responses throughout Arabidopsis development. Plant Cell v.5(2); 1993 Febhy3-EMS742 is a G-toA mutationphyb9 F CTGTTCAATCGCAGAAACTCGCGGT Len25phyb9 R CCGTCACATTTCACTAAGTCCAT Len 23 TM58.6MnlI:但是，实验室并没有MnlI，所以只能再去寻找新的内切酶。
本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述系别林学与园艺学院班级园艺102班姓名唐辉学号103231228答辩时间年月新疆农业大学林园学院拟南芥突变体的筛选综述唐辉指导老师：王燕凌摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。
在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试验。
在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na2SeO3、钾、硒、NaCl等化合物或者化学元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。
概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。
总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。
关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究Screening Summary of Arabidopsis MutantsTang Hui Instructor:Wang YanlingAbstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screeningproposed resilience of Arabidopsis mutants.Key words: Arabidopsis；Mutant；Filter；Research拟南芥（Arabidopsis）为十字花科(Cruciferous)、拟南芥属（Brassicaceae、Arabidopsis）一年生或二年生的细弱草本植物。
拟南芥突变体的功能鉴定及应用拟南芥是一种模式植物，因其具有小型、短周期、基因底子丰富等特点，成为了植物学和遗传学领域的研究工具。
通过突变体的筛选，拟南芥成为了研究植物生长发育和基因功能的重要模式植物之一。
在拟南芥突变体筛选中，以T-DNA插入技术为主，通过敲定不同基因，以观察植物的生长发育状态，挖掘新的生物学机制。
拟南芥突变体是利用突变体筛选技术，自然形成的或通过基因操作人工获得，产生了某些特殊表型的植物。
以T-DNA插入技术为例，将T-DNA随机插入到植物基因组中，导致部分基因的功能紊乱，从而产生了特殊的表型表现。
因此，拟南芥突变体不仅具有丰富的基因型资源，也是研究基因功能、分子生物学和植物生长发育的重要材料，其发现和应用有直接联系。
因此，如何鉴定拟南芥突变体的功能尤为重要。
目前鉴定方法主要包括：表型分析、基因克隆、启动子分析、蛋白质相互作用网络分析、分子标记等技术手段。
表型分析是首先考虑的鉴定方法，通过比较突变体与野生型在不同生长条件下的表型差异，筛选出表现异常的突变体。
对鉴定有难度的突变体，使用其他鉴定方法，如基因克隆，会有更好的效果。
其中，启动子元素克隆有助于探究基因表达特异性。
蛋白质相互作用网络分析有用于探究基因调控网络方式。
分子标记在表型特征不明显时，如果phentoype特征无法激活突变体，可以发现突变原因及搜索对应的遗传切口。
同时，拟南芥突变体在研究中的应用也非常广泛。
例如：研究花器官发育中的关键基因，通过拟南芥突变体突变鉴定方法，筛选出相关基因，进而探究开花的分子机制。
利用拟南芥突变体进行耐盐性、耐旱性等方面的研究。
在探究植物防御基因的调节网络时，拟南芥突变体也广泛地使用。
此外，还可用作药物和环境污染物筛选的生物传感材料，如zinc、生物染色体修复等方面的研究。
拟南芥突变体是全面了解植物生物学机理的重要材料，是揭示生长发育和基因功能的主要途径之一。
随着逆境应对、营养吸收、发育调控等方向的研究的深入，对拟南芥突变体的催生和应用必将愈加广泛。
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。
实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。
通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。
关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统1.前言拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。
同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。
2.实验2.1实验目的（1）提取植物基因组DNA的方法；（2）PCR操作方法；（3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。
2.2实验原理Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。
将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
“三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。
