番茄抗病基因Tm-2、Pto、Sw-5和Ve1的SNP标记检测.

分享！番茄抗病标记基因组物理图谱
目前常见的基因组图谱多为背景标记遗传图谱，而与抗病基因连锁的前景标记图谱较为少见。

为使大家在育种过程中更好地利用抗病基因，中心特绘制番茄抗病标记物理图谱Version1.0以供参考。

本物理图谱共整合了与番茄14个病害相关的21个基因连锁标记，物理位置基于番茄参考基因组Solanum lycopersicum 3.0（Cultivar: Heinz1706 ）绘制而得。

如有不当之处，敬请指出！
番茄抗病标记物理图谱
基因聚合分子育种与常规育种技术相结合已成为今后植物育种的主流方向。

基因聚合分子育种主要包括遗传转化基因聚合分子育种和分子标记筛选基因聚合分子育种，抗性基因连锁程度直接影响分子标记筛选法的基因聚合效率。

中心特绘制番茄抗病基因物理图谱V1.0 供各位老师参考，以了解各抗病性状间的聚合效率与难度，从而有针对性地制定育种计划，提升育种效率。

中心会持续更新物理图谱，并一如既往地为各位老师提供优质的分子标记检测服务。

如有新的需求与建议，中心诚挚欢迎各位老师来电洽谈！
请问能拿到抗病基因物理图谱的高清大图嘛
国际种业张经理。

番茄抗病基因分子标记研究进展吴媛媛;李海涛;张子君;邹庆道【摘要】番茄抗病育种是番茄病害防治及提高产量的最直接有效的途径,现代分子标记技术的迅速发展为番茄抗病育种工作者提供了有利的辅助工具,它可以从DNA 水平上鉴定抗病位点,准确、快速,显著提高育种效率.为了对番茄抗病育种提供参考,对分子标记技术在番茄质量抗病性状的基因定位(主要包括番茄叶霉病、番茄根结线虫病、番茄烟草花叶病毒病、番茄枯萎病)和数量抗病性状的基因定位(主要包括番茄灰霉病.番茄晚疫病和番茄青枯病)的研究进展进行了综述.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2010(038)002【总页数】5页(P27-31)【关键词】番茄;抗病基因;分子标记【作者】吴媛媛;李海涛;张子君;邹庆道【作者单位】沈阳农业大学,园艺学院,辽宁,沈阳,110161;辽宁省农业科学院,蔬菜研究所,辽宁,沈阳,110161;辽宁省农业科学院,经济作物研究所,辽宁,辽阳,111000;辽宁省农业科学院,蔬菜研究所,辽宁,沈阳,110161;辽宁省农业科学院,蔬菜研究所,辽宁,沈阳,110161;辽宁省农业科学院,蔬菜研究所,辽宁,沈阳,110161【正文语种】中文【中图分类】S436.412.1+9番茄(Solanum lycopersium.)广泛栽培于世界各地，但随着番茄保护地连续种植，轮作困难，各种病害也随之蔓延，周年频发。

目前已发现的番茄主要病害包括ToMV、TSWV、根结线虫病、白粉病、细菌性斑点病、斑萎病、叶霉病、青枯病、晚疫病等10余种。

每年因各种病害造成的减产给番茄的生产和市场供应都带来严重的影响。

选用番茄抗病品种省钱省力，是解决减产的最直接有效的途径，因此番茄抗病研究在番茄育种中变得越来越重要。

现代分子标记技术的迅速发展为番茄抗病育种工作者提供了有利的辅助工具，它可以从DNA水平上鉴定抗病位点，准确、快速，显著提高育种效率。

作者综述了分子标记技术在番茄抗病基因定位研究中的研究进展，以期为番茄的抗病育种提供参考。

分子标记在番茄抗性育种中研究进展摘要：本文综述了近年来RFLP RAPD SSA AFLP CAPS和SNP分子标记技术在番茄抗性育种上的应用，分析了目前的研究进展，对今后研究的重点进行了讨论。

关键词：分子标记；番茄；抗性；进展。

Molecular marker in tomato resistance breeding research progress inAbstract: This paper reviewed recent RFLP RAPD SSA AFLP CAPS and SNP in the application of tomato resistance breeding, analysis of the current research progress, the focus of the future research are discussed.Key words: Molecular markers; tomato; resistance; progress.番茄既是蔬菜也是水果, 其中含有丰富的维生素C对心血管有良好的保护作用；番茄红素具有良好的抗氧化作用,能清除体内废物,增加免疫力。

它也是营养师大力提倡的减肥食品。

它早已成为人们日常生活中的不可缺少的食物。

随着遗传学的发展,遗传标记的种类和数量也在不断增加。

形态标记、细胞学标记、生化标记都是以基因表达的结果(表现型)为基础,是对基因的间接反映;而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。

与表型标记相比,DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限制;数量丰富;遗传稳定;对生物体的影响表现“中性”以及操作简便等特点。

分子标记的所有这些特性,奠定了它具有广泛应用性的基础。

本文在介绍一些常用的DNA分子标记技术基础上,综述分子标记应用于番茄遗传育种研究的新进展,并就我国今后番茄分子育种主要研究方向进行讨论。

番茄分子标记番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是一种在全世界栽培极为广泛的蔬菜，也是我国的主要栽培蔬菜之一。

番茄原产于南美洲地区，起源于南美的秘鲁、厄瓜多尔、玻利维亚，在南美西部安第斯山脉的狭长地带均有番茄野生种存在。

番茄有着鲜艳的色泽和美观的外形，含有丰富的营养成分，其栽种品种繁多。

据报道至 1990 年，全世界已经收集并保存了 4 万多份番茄材料。

我国引进番茄的历史较短，1949 年以前曾从美国引进大量番茄栽培品种，自 20 世纪 80 年代以来，也先后组织了两次大规模的种质资源收集工作，共收集到各种番茄材料 1912 份生物技术不断的创新发展和广泛应用为传统的遗传育种研究带来了巨大的改变，目前分子标记技术的应用尤为显著。

20 世纪 80 年代，标记技术逐渐发展到植物遗传育种领域，使广大学者大大加深了对某些性状遗传规律的认知。

目前应用在植物遗传多样性和亲缘关系关系方面的分子标记技术主要有RAPD（随机扩增多态DNA）、RFLP（限制性片段长度多态性）、SSR(简单序列长度多态性)与AFLP（扩增片段长度多态性）。

其中，AFLP标记技术（amplified fragmet length polymorphism，扩增片段长度多态性）是1993年由荷兰KEYGENE公司的科学家Zabeau和Vos发明并申请欧洲专利，之后于1995年以论文形式发表的检测DNA多态性的方法。

AFLP技术具有结果稳定可靠、重复性强和多态性丰富等优点，利用此技术分析番茄的遗传多样性和亲缘关系可以保证实验的可靠性和实验鉴别效率。

1 番茄的起源及价值1.1. 番茄的起源及分布番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）在植物分类上属于茄科（Solanaceae）番茄属。

俗称“西红柿”，或“洋柿子”，番茄原产于南美洲的秘鲁、厄瓜多尔与智利。

一年生草本。

植株分有限生长和无限生长两种类型，浆果呈扁圆、长圆、圆或樱挑形等，有红、黄、粉红等不同颜色。

番茄抗性基因Ty-2和Ph-3多重PCR的检测应用引言番茄是世界上重要的蔬菜作物之一，然而番茄常常遭受多种病原体的侵害，其中番茄黄曲叶病毒(ToMV)和番茄斑点落叶病毒(TSWV)是两种常见的病毒性病害。

为了增强番茄对病毒的抵抗能力，科研人员对番茄的抗性基因进行了研究。

番茄抗性基因Ty-2和Ph-3被发现具有抗性作用。

本文将对番茄抗性基因Ty-2和Ph-3的多重PCR检测应用进行介绍，希望能够为相关研究提供帮助。

一、番茄抗性基因Ty-2和Ph-3的功能1. Ty-2基因Ty-2基因是一种番茄对番茄黄曲叶病毒(ToMV)具有抗性的基因。

该基因编码一种NBS-LRR抗性蛋白，能够与ToMV的特定蛋白相互作用，从而激活植物的抗病性反应。

研究表明，Ty-2基因对ToMV的抗性作用非常强大，可以为番茄提供有效的保护。

2. Ph-3基因Ph-3基因是一种番茄对番茄斑点落叶病毒(TSWV)具有抗性的基因。

该基因编码一种RNA依赖性RNA聚合酶，在植物感染TSWV病毒后能够诱导植物的抗病性反应，从而抑制病毒的传播和繁殖。

Ph-3基因对TSWV的抗性作用在番茄抗病性育种中具有重要意义。

二、多重PCR技术在番茄抗性基因检测中的应用多重PCR技术是一种同时检测多个靶序列的PCR技术，可以高效、准确地检测目标基因的存在与否。

在番茄抗性基因Ty-2和Ph-3的检测中，多重PCR技术发挥着重要作用。

1. 多重PCR引物设计针对Ty-2和Ph-3基因序列，可以设计特异性引物进行多重PCR。

通过基因序列比对和分析，选择Ty-2和Ph-3基因的保守区域作为引物设计的靶点，确保引物的特异性和选择性。

然后，设计引物的长度、Tm值和碱基序列，以确保引物的稳定性和PCR的高效性。

通过体外实验验证引物的特异性和敏感性，确保引物能够准确、高效地检测Ty-2和Ph-3基因。

2. 多重PCR反应体系多重PCR反应需要精确控制反应体系，以保证PCR反应的稳定性和准确性。

园艺学报 2014，41（10）：2012–2020 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@番茄抗病基因Tm-2、Pto、Sw-5和Ve1的SNP 标记检测苏晓梅*，高建昌*，王孝宣，国艳梅，杜永臣，胡鸿**（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 10081）摘 要：针对番茄4个抗病基因Tm-2、Pto、Sw-5和Ve1，根据其序列的碱基差异设计引物，经过引物特异性检测和PCR产物克隆测序比对之后，采用高分辨率熔解曲线（High resolution melting，HRM）技术进行多态性检测，共开发了5个SNP标记。

经过验证，所开发的标记均能将抗病基因型不同的番茄材料分型，并且分型结果与已知材料的抗病性状完全一致。

这些标记可以作为功能标记在番茄抗病育种中应用。

关键词：番茄；抗病基因；功能标记；HRM中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）10-2012-09 Detection of SNP Markers of the Important Disease Resistance Genes in TomatoSU Xiao-mei*，GAO Jian-chang*，WANG Xiao-xuan，GUO Yan-mei，DU Yong-chen，and HU Hong**（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China）Abstract：According to the gene sequence differences，primers were designed for 4 disease resistance genes in tomato，Tm-2，Pto，Sw-5 and Ve1. After checking of primer specificity and aligning of the clone sequences of the PCR products，the HRM（High resolution melting）technology was used for polymorphism detection. In this study，5 SNPs were developed，all of which could distinguish the materials with different genotypes. What’s more，the genotype was completely consistent with the known gene. So they can be used as functional markers in tomato disease resistance breeding.Key words：tomato；disease resistance gene；functional marker；HRM分子标记辅助选择技术已成为番茄抗病育种的常规手段，但连锁分子标记选择的准确性取决于标记与抗病基因的连锁程度，即便是紧密连锁的分子标记，也会由于在分离后代中出现标记与抗病基因的交换而导致假阳性，降低选择效率。

result indicated that Pti4and Pti5genes can enhance the resistance of tomato against P.syringae.The present work provided a foundation for further exploring the function of these Pto-interacted Pti proteins,understanding their roles in pathogen-plant interaction,and improving plant genetic disease resistance.Keywords:Pseudomonas syringae;Effector protein;Plant immunity;Protein interactions;Disease resistance目录第一章文献综述 (1)1.1丁香假单胞菌与番茄细菌性斑点病 (1)1.2病原菌入侵与植物免疫防御 (1)1.3丁香假单胞菌抗性蛋白Pto (3)1.4Pto互作蛋白 (4)1.5农杆菌介导的植物基因转化 (5)第二章材料与方法 (8)2.1实验材料 (8)2.1.1植物材料 (8)2.1.2质粒与菌株 (8)2.2主要仪器设备 (8)2.3主要相关试剂 (10)2.3.1分子生物学实验常用酶 (10)2.3.2常用试剂药品及试剂盒 (10)2.4常用试剂 (11)2.4.1LB培养基 (11)2.4.2SOC培养基 (11)2.4.3TAE电泳胶缓冲液 (11)2.4.4聚丙烯酰胺凝胶 (11)2.4.5蛋白质上样缓冲液 (12)2.4.6蛋白质电泳缓冲液 (12)2.4.7Western blot转膜缓冲液 (12)2.4.8TBST（Trish-buffered saline with Tween）缓冲液 (12)2.4.9植物DNA提取液 (12)2.5烟草瞬时表达相关试剂 (12)2.5.1IM溶液 (12)2.5.220×AB盐溶液 (13)2.5.3乙酰丁香酮 (13)2.5.4诱导培养基 (13)2.5.5蛋白质提取缓冲液 (13)2.6番茄遗传转化相关试剂 (13)2.6.1MS培养基 (13)2.6.2组织培养所需激素、抗生素等的配制 (15)2.6.3番茄组织培养所用培养液、培养基 (15)2.7分子生物学实验方法 (18)2.7.1引物设计 (18)2.7.2番茄总RNA提取 (20)2.7.3反转录 (20)2.7.4PCR反应 (21)2.7.5琼脂糖凝胶电泳 (21)2.7.6连接与转化 (21)2.7.7大肠杆菌感受态细胞制备 (22)2.7.8质粒提取 (22)2.7.9质粒酶切 (23)2.7.10DNA片段胶回收 (23)2.7.11基因测序 (24)2.7.12农杆菌感受态细胞制备与转化 (24)2.7.12.1农杆菌感受态制备 (24)2.7.12.2农杆菌转化 (25)2.8目的基因在烟草叶片中瞬时表达 (25)2.9免疫共沉淀 (25)2.10番茄遗传转化 (26)2.10.1获得无菌幼苗 (26)2.10.2愈伤组织预培养 (27)2.10.3农杆菌侵染 (27)2.10.4卡那霉素抗性梯度筛选 (27)2.10.5愈伤组织分化 (27)2.10.6愈伤组织生根培养 (27)2.11转基因植株鉴定与抗病表型分析 (27)2.11.1转基因植株DNA提取 (27)2.11.2转基因植株阳性鉴定 (28)2.11.3病原菌接种 (28)2.11.4叶片菌落计数 (28)第三章实验结果与分析 (29)3.1Pti基因植物瞬时表达载体构建与表达 (29)3.1.1番茄Pti基因扩增 (29)3.1.2pBTEX-Pti-FLAG载体构建 (29)3.1.3Pti4、Pti5和Pti6蛋白的植物体内瞬时表达 (30)3.2Pti蛋白与番茄抗病蛋白的相互作用 (31)3.2.1Pti与Pto蛋白的相互作用 (31)3.2.2Pti与AvrPtoB蛋白的相互作用 (33)3.3Pti植物遗传转化表达载体构建 (33)3.3.1pEASY-Blunt-Pti中间载体构建 (34)3.3.2pBI121-Pti表达载体构建 (35)3.3.3pBI121-Pti载体转化农杆菌EHA105 (36)3.4Pti4、Pti5基因遗传转化 (36)3.4.1预培养和共培养 (36)3.4.2转化组织的筛选分化 (37)3.4.3生根培养 (38)3.5转基因植株鉴定与表型分析 (39)3.5.1转基因植株鉴定 (39)3.5.1.1NPTII筛选标记基因扩增 (39)3.5.2转基因植株抗病表型分析 (40)第四章结论与讨论 (43)4.1结论 (43)4.1.1Pti蛋白在植物体内与Pto、AvrPtoB相互作用 (43)4.1.2Pti4、Pti5过表达转基因植株增强番茄对丁香假单胞菌的抗性 (43)4.2讨论与展望 (44)参考文献 (45)硕士期间发明专利与发表论文 (55)表格清单表2.1实验设备与仪器 (8)表2.2实验器皿 (9)表2.3常用试剂盒 (11)表2.4MS培养基组分 (13)表2.5MS培养基组分 (14)表2.6MS培养基I液 (14)表2.7MS培养基II液 (14)表2.8MS培养基III液 (14)表2.9培养基肌醇溶液 (14)表2.10MS培养基铁盐溶液 (15)表2.11诱导液组分 (15)表2.12AB盐组分 (16)表2.13预培养基组分 (16)表2.14IV液组分 (17)表2.15共培养基组分 (17)表2.16筛选培养基组分 (17)表2.17生根培养基组分 (18)表2.18本研究所用引物序列 (19)插图清单图3.1番茄Pti4、Pti5和Pti6基因的PCR扩增 (29)图3.2pBTEX-Pti载体酶切鉴定 (30)图3.3免疫印迹检测Pti蛋白在烟草中的表达 (31)图3.4Pti蛋白与Pto蛋白的免疫共沉淀检测结果 (31)图3.5Pti蛋白与Pto、PtoY207D蛋白的免疫共沉淀 (32)图3.6AvrPtoB与Pto蛋白的相互作用 (33)图3.7Pti蛋白与AvrPtoB蛋白的相互作用 (33)图3.8pEASY-Blunt-Pti载体酶切鉴定 (34)图3.9pBI121-Pti大肠杆菌菌落PCR鉴定 (35)图3.10pBI121-Pti载体酶切鉴定 (35)图3.11pBI121-Pti农杆菌菌落PCR鉴定 (36)图3.12预培养3d后番茄茎段（A）和叶片(B) (37)图3.13转化番茄茎段（A）和叶片(B)在筛选培养基（kana，60μg/mL）上的生长 (37)图3.14转化番茄茎段（A）和叶片(B)在筛选培养基（kana，65μg/mL）上的生长 (38)图3.15转化番茄茎段（A）和叶片(B)在筛选培养基（kana，70μg/mL）上的生长 (38)图3.16愈伤组织分化形成 (39)图3.17转基因番茄植株PCR鉴定 (39)图3.18番茄转基因植株Pti4、Pti5基因表达水平半定量分析 (40)图3.19接种7d后番茄植株 (41)图3.20接种7d后番茄叶片 (41)图3.21Pst DC300接种7d番茄叶片菌落数 (42)图3.22接种9d后番茄茎秆 (42)第一章文献综述第一章文献综述1.1丁香假单胞菌与番茄细菌性斑点病番茄细菌性斑点病是一种细菌性病害，在世界范围内降低番茄产量、破坏口味[1]，可以寄生在番茄中，所以又称番茄细菌性叶斑病、斑疹病[2]。