RT-PCR常用引物序列

RT-PCR实验原理与步骤【实验原理】RT-PCR 是以RNA 为模板经逆转录反应（Reverse Transcription，RT）产生cDNA第一链，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。

【实验仪器】1. 恒温金属浴2. PCR 扩增仪【试剂及配制】RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0试剂包括：1. AMV 反转录酶XL (5 U/ul)2. 10×反转录反应缓冲液3. RNAase 抑制剂(40 U/ul)4. 随机引物9 mers (50 pmol/ul)5. RNAase Free dH2O6. TaKaRa Ex TaqTM HS (5 U/ul)7. 5×PCR 反应缓冲液8. dNTP Mixture (各10 mM)【实验步骤】1. 反转录反应1）按下列组成配制反转录反应液MgCl2 2ul2. PCR 反应1）按下列组成配制PCR 反应液2）把此反应液加入到第一阶段反转录结束后的PCR 反应管中，轻轻混匀；3）按以下条件进行PCR 反应：94 ℃ 2 min，94℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72℃ 4 min、30 cycles，72℃ 5 min。

4）琼脂糖凝胶电泳检测结果。

【注意事项】1. PCR 条件设定退火温度可根据实际情况适当地提高或降低（50℃～60℃）。

延伸时间因目的序列长度不同而不同。

cDNA 量较少时，循环次数可增加为40～50 次。

2. 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix），然后再分装到每个反应管中。

3. 使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。

4. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回－20℃中保存。

5. 分装试剂时务必使用新的Tip 头，防止样品间污染。

CXCL12/CXCR4轴通过调节自噬促进乳腺癌细胞对多柔比星的化疗抗性①李霞梁海珊程学②段哲③（海南省中医院输血科，海口 570100）中图分类号R737.9 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）07-1446-06［摘要］目的：探究CXCL12/CXCR4轴在乳腺癌细胞多柔比星（Dox）化疗抗性中的作用及相关机制。

方法：体外培养乳腺癌细胞系MCF-7，通过MTT实验检测在CXCL12作用下乳腺癌细胞对Dox的敏感性变化，RT-PCR和Western blot检测上述细胞中CXCL12受体CXCR4与CXCR7的mRNA及蛋白的表达水平；采用siRNA干扰技术靶向沉默乳腺癌细胞中CXCR4表达，RT-PCR和Western blot检测转染效率后，依次使用MTT、Annexin V-FITC/PI流式细胞术及Western blot明确在CXCL12作用下沉默CXCR4表达对Dox介导的乳腺癌细胞的抑制率，凋亡、自噬及PI3K/Akt信号通路表达的影响。

结果：CXCL12能够通过促进CXCR4的表达，提高乳腺癌细胞对Dox的化疗抗性；转染siRNA能够显著抑制乳腺癌细胞中CXCR4的mRNA及蛋白的表达水平；而沉默CXCR4能显著改善CXCL12作用下的乳腺癌细胞对Dox的敏感性，提高Dox诱导的细胞凋亡率，并通过抑制自噬相关蛋白LC3B与Beclin1表达，下调乳腺癌细胞中的自噬水平；同时，沉默CXCR4能通过抑制PI3K/Akt信号通路中PI3K蛋白表达及Akt蛋白磷酸化水平，下调抗凋亡蛋白BCL-2，促进凋亡相关蛋白Bax与cleaved Caspase-3表达。

结论：CXCL12/CXCR4在乳腺癌细胞Dox耐药性中具有重要作用，而沉默CXCR4表达能通过下调MCF-7细胞的自噬水平，提高Dox诱导的细胞凋亡，从而改善肿瘤细胞对Dox的敏感性。

［关键词］趋化因子12（CXCL12）；CXCR4；乳腺癌；多柔比星；自噬CXCL12/CXCR4 axis promotes chemotherapy resistance of breast cancer cells to doxorubicin by regulating autophagyLI Xia， LIANG Haishan， CHENG Xue， DUAN Zhe. Department of Blood Transfusion， Hainan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Haikou 570100， China［Abstract］Objective：To explore the role of CXCL12/CXCR4 axis in anti-doxorubicin （Dox） resistance of breast cancer cells and its related mechanism. Methods：Breast cancer cell line MCF-7 was cultured in vitro. The sensitivity of breast cancer cells to Dox was detected by MTT assay. The mRNA and protein expression levels of CXCL12 receptor CXCR4 and CXCR7 were detected by RT-PCR and Western blot. siRNA interference was used to silence CXCR4 expression in breast cancer cells. RT-PCR and Western blot were used to detect the transfection efficiency. MTT， Annexin V-FITC/PI flow cytometry and Western blot were used to determine the effects of CXCR4 silencing on DOX mediated proliferation inhibition， apoptosis， autophagy and PI3K/Akt signaling pathway expres‐sion in breast cancer cells. Results：CXCL12 could enhance the chemoresistance of breast cancer cells to Dox by promoting the expres‐sion of CXCR4. siRNA could significantly inhibit the expression of CXCR4 mRNA and protein in breast cancer cells. Silencing CXCR4 can significantly improve the sensitivity of breast cancer cells to Dox and increase the apoptosis rate mediated by Dox， and down-regu‐lation the autophagy level in breast cancer cell by inhibiting the expression of autophagy related proteins LC3B and Beclin1. At the same time， silencing CXCR4 could inhibit the phosphorylation level of PI3K and Akt protein in PI3K/Akt signaling pathway， reduced the anti-apoptotic protein Bcl-2，promoted apoptosis related protein Bax and cleaved caspase-3 expression. Conclusion：CXCL12/ CXCR4 played an important role in Dox resistance of breast cancer cells. Silencing CXCR4 expression could improve the sensitivity of tumor cells to Dox by down regulating autophagy level and increasing Dox induced apoptosis.［Key words］Chemokine 12 （CXCL12）；CXCR4；Breast cancer；Doxorubicin；Autophagy乳腺癌是世界范围内最常见的肿瘤之一，也是女性癌症死亡的首要原因［1-2］。

RT-PCR试剂配制(1)O.1％DEPC水：l ml DEPC+1000 ml双蒸水，高压灭菌后用于配制RNA提取的相关试剂。

如果浸泡RNA提取的相关器皿，则应在DEPC水配制后立即使用。

(2)10 mg·ml-1溴乙锭：1 g溴乙锭溶于100 ml去离子水中，避光保存，溴乙锭的工作浓度为0.5µg·ml-1。

(3)5×TBE储存液:Tris 54g,硼酸 27.5g，EDTA pH8.0(固体NaOH调,先配100ml) 20ml，定容到1L。

(每种药品都用蒸馏水先溶解，都比较难溶，再互溶效果好点。

)0.5×TBE工作液是5×TBE储存液稀释10倍。

(4)1％琼脂糖凝胶：0.3 g琼脂糖溶于30 ml 0.5×TBE溶液中，在微波炉中加热充分溶解琼脂糖，待溶液冷却至60℃左右，加入10 mg·ml-1溴乙锭溶液1µL(终浓度为O.5µg·ml-1)，将琼脂糖溶液倒入制胶模中，在适当位置处插上梳子。

凝胶的厚度一般在3-5mm之间。

在室温下使胶凝固，然后点样放置于电泳槽中进行电泳。

RNA提取前的准备1.组织保存：小鼠处死后脏器迅速冻存于液氮罐中。

2. 研钵，剪刀及镊子的处理1) 自来水反复冲洗；2) 去污剂或者洗涤灵冲洗；3) 自来水反复冲洗；4) 用锡箔纸包裹研钵研棒等，180度干烤4－8小时，除去RNAase3. 枪头及EP管（0.5ml,1.5ml，5ml）的处理1) 0.1%DEPC水浸泡1～2天；2) 用镊子夹起枪头一一装入枪头盒中，用镊子夹起EP管放入饭盒中；3) 高压灭菌50min，45度烘箱烘干（需几天）。

RT-PCR方法总RNA的提取：1.组织匀浆：先放入液氮入碾钵内，把分装放入液氮中的一份肝脏入碾钵内，碾磨，边加液氮边碾磨。

用DEPC水处理的1.5ml的EP管刮下碾钵上的肝脏，加入1ml RNAVzol混匀。

概念RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。

逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。

在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。

随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。

原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。

RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。

RT-P CR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。

）RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。

为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative P CR)。

实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内D NA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。

real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。

一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。

real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。

这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”[编辑本段]PCR技术相关试剂A液：变性液B液：醋酸钠溶液C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1）D液：异丙醇E液：75％乙醇F液：DEPC处理的灭菌去离子水G液：RNA酶抑制剂H液：反转录反应液I液：反转录酶J液：PCR反应液K液：Taq DNA聚合酶(0.5u／µl)L液：矿物油M液：50倍TAE电泳缓冲液N液：溴化乙锭溶液0液：上样缓冲液[编辑本段]PCR各步骤的目的（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。

反转录RT—PCR的内参如何选择？RT—PCR就是将RNA先反转录为cDNA，再将转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应扩增目标片段。

用于反转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异引物的一种。

对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA三种都可。

1）随机引物：适用于长的具有发卡结构的RNA。

适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的转录反应。

主要用于单一模板的RT-PCR反应。

2）Oligo dT:适用于具有PolyA尾巴的RNA.（原核生物的RNA、真核生物的Oligo dT rRNA 和tRNA不具有PolyA尾巴。

）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少.oligo(dT) capture多聚胸腺嘧啶-核苷酸捕捉实际上指的是用Oligo（dT）特异结合到mRNA上PolyA尾端的技术，以此技术可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来，通常用于mRNA的反转录3) 基因特异引物：与模板序列互补,适用于目的序列已知的情况.实时PCR也就是qPCR，它的基本原理与PCR也是一样的，只是在体系中加入荧光指示，可以对PCR的模板进行定量。

一种是加入荧光染料SYBR Green，SYBR Green会嵌入双链DNA的小沟,且只有在嵌入小沟时才会发出荧光，荧光定量PCR没进行一个循环就会对产物进行一次检测，通过检测每个循环后荧光强度(间接得知DNA的量）从而检测整个PCR的过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

SYBR Green不具有特异性，对结果稍有影响。

另一种是加入荧光探针T aq man，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，T aqman探针在PCR体系中会与目标片段杂交，而在PCR的Extension阶段Taq酶以一条链为模板合成目标片段，此时T aq酶的5'－3’外切酶活性将结合在模板上的探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

RT-PCR常用引物序列RT-PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb）β-actin 人有意义链CCTCG CCTTT GCCGA TCC 反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62 kbβ-actin* 大鼠有意义链TACAA CCTCC TTGCA GCTCC 反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62kbβ-actin 小鼠有意义链GTCGT ACCAC AGGCA TTGTG ATGG反义链GCAAT GCCTG GGTAC ATGGT GG 0.49 kbGAPDH 人有意义链 GGTGA AGGTC GGAGT CAACG反义链CAAAG TTGTC ATGGA TGHACC 0.50kbGAPDH 大鼠有意义链GATGC TGGTG CTGAG TATGR CG反义链GTGGT GCAGG ATGCA TTGCT CTGA 0.20 kbDynein 小鼠有意义链 GCGGG CGCTG GAGGA GAA反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 12.3 kbPolymerase ε人有意义链CGCCA AATTT CTCCC CTGAAA反义链CCGTA GTGCT GGGCA ATGTT C 6.8 kbPolymerase ε人有意义链 AAGGC TGGCG GATTA CTGCC反义链GATGC TGCTG GTGAT GTACT C 3.5 kbTuberous Sclerosis 人有意义链GGAGT TTATC ATCAC CGCGG AAATA CTGAG AG反义链TATTT CACTG ACAGG CAATA CCGTC CAAGG 5.3 kb18S rRNA 大豆有意义链CTTTC GATGG TAGGA TAGTG GCCT反义链CAATG ATCCT TCCGC AGGTT CACCT AC 1.5 kb*引物不会扩增假基因PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb）HIV gag region 病毒 SK 38ATTAAT CACTA TCCAG TAGGA GAAATSK 39TTTGG TCCTG TCTTA TGTCC AGAAT GC 0.11kbβ-globin 人 (29923)GGTGT TCCCT TGATG TAGCA CA(34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 4.1kbβ-globin 人 (31194)GCTGC TCTGT GCATC CGAGT GG(34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 2.8kb序列来源：nvitrogen 公司大家用什么稀释引物?引物应该用TE稀释。

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。

(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。

2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。

由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。

RT-PCR实验方法简介RT-PCR定义：是指对组织或细胞的总RNA进行抽提，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。

RT-PCR流程简介一、抽提RNA：1、防止RNA酶污染180℃的高温下干烤6hr以上；0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗；去污剂洗涤，双蒸水冲洗；溶液皆用0.1% DEPC水配置，试剂应为新开封或RNA专用；操作人员戴手套；器械专用。

2、材料的准备组织及细胞最好为新鲜的，或者在－70℃条件下保存半年以下；尽量避免材料的冻融。

3、确认RNA的质量检测RNA溶液的吸光度：OD260/OD280=1.8－2.0RNA的电泳图谱：28S和18S条带明亮、清晰、指条带边缘清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。

二、反转录：单管一步法:反转录和PCR反应在一个管子中完成，得到的全部cDNA产物都一起经PCR 扩增，灵敏度更高，但是容易相互干扰。

两步法:反转录和P CR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如前者高。

三、PCR：1、参照基因PCR参照基因一般选择看家基因（长表达、高表达量的基因），常用18S、β－actin、bubulin、GAPDH，其中ACTIN最为普遍；参照基因与目的基因在同一个管子内进行PCR反应的情况下，称之为内参；参照基因与目的基因在不同管子内反应成为外参；由于内参可能与目的基因竞争模板及酶，或造成其它干扰，外参的应用较为普遍。

2、目的基因PCR典型的引物18到24个核苷长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

RT-PCR实例：1、实验材料：拟南芥野生型Ws及突变体m1、m2花序2、实验目的：分析m1、m2与野生型花序中G1基因的表达的差异3、实验步骤：设计ACTIN及G1基因的引物；分别抽取野生型Ws及突变体m 1、m2花序RNA，DNase I处理，以尽量去除基因组DNA；电泳检测，估计R NA总量；取1ug左右的RNA进行反转录；取反转录好的cDNA总量的1/10（10ul反转录体积则取1ul），稀释10倍（稀释至10ul），取1/10（1ul）为模板，用ACTIN引物、普通PCR体系、20－2 5个循环、以基因组DNA为对照（因为引物跨内含子，所以基因组DNA扩增出的条带大小与cDNA扩增出的条带大小不同，以去除残留的基因组DNA的影响）做PCR；取等量产物电泳，根据电泳条带的亮度调整模板量（如m1的亮度为Ws的2倍，则下次PCR时m1的模板为0.5ul），直到电泳亮度基本一致，可认为此时所取的不同体积的野生型Ws及突变体m1、m2模板里RNA的含量基本相同。

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

一、反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

二、合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。

由于Poly(A )RNA 仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。