第五章 蛋白质

第五章蛋白质的共价结构目的和要求：了解蛋白质的化学组成、分类、蛋白质分子大小、结构组织层次和蛋白质生物功能的多样性；了解肽、肽键的概念、结构和常见肽的性质、作用；掌握蛋白质一级结构的概念，蛋白质一级结构的测定方法与思路，能根据实验结果分析简单多肽的氨基酸顺序；了解蛋白质一级结构和生物功能的关系。

一、蛋白质(protein)通论㈠、蛋白质的化学组成与分类1、组成: 碳50-55%,氢6-8%,氧19-24%,氮13-19%,硫0-4%各种蛋白质含氮量很接近，蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，平均为16%克氏定氮法的基础：100克有机物中蛋白质大体含量= 1克样品中含氮的克数×6.25×100乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.302、分类根据组成可分为单纯蛋白质（simple protein)和缀合蛋白质(conjugated protein)根据分子的形状：球状(globular protein)、纤维状(fibrous protein)和膜蛋白根据功能：酶、调节蛋白、转运蛋白、营养和储存蛋白、收缩蛋白、结构蛋白和防御蛋白等⑴单纯蛋白质清蛋白(albumin)：溶于水、稀酸、稀碱、稀盐，为半饱和硫酸铵沉淀,血清清蛋白、乳清蛋白球蛋白(globulin)：溶于水和不容易水两类，为半饱和硫酸氨所沉淀，血清球蛋白、肌球蛋白、植物种子球蛋白谷蛋白(glutelin)：不溶于水、醇及中性盐，但易溶于稀酸和稀碱，米谷蛋白、麦谷蛋白谷醇溶蛋白（prolamine):不溶于水和无水乙醇，溶于70%-80%乙醇,脯氨酸和酰氨较多，非极性侧链远多于极性侧链，玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白组蛋白(histone)：溶于水及稀酸，可被氨水沉淀,分子中组氨酸、赖氨酸较多，分子呈碱性，小牛胸腺组蛋白鱼精蛋白(protamine)：溶于水和稀酸，不溶于氨水,碱性氨基酸较多，分子呈碱性，鲑精蛋白硬蛋白(scleroprotein)：不溶于水，稀酸和稀碱，作为结绨及保护功能的蛋白质，角蛋白、胶原、弹性蛋白⑵缀合蛋白质糖蛋白(glucoprotein)和粘蛋白(mucprotein)：辅基成分为半乳糖、甘露糖、已糖胺脂蛋白(lipoprotein)：与脂结合的蛋白质核蛋白(nucleoprotein)：辅基是核酸如脱氧核蛋白质、核糖体磷蛋白(phosphoprotein)：磷酸基通过酯键与蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸残基连相连色蛋白（chromoprotein):蛋白质与某些色素类物质结合而成的缀合蛋白,如血红素蛋白(hemoprotein)：辅基为血红素，它是卟啉化合物，卟啉环中心含有金属黄素蛋白(flavprotein)：辅基为黄素嘌呤二核苷酸金属蛋白(metalloprotein)：与金属之间结合的蛋白质醇脱氢酶含锌、铁蛋白含有铁㈡、蛋白质分子的大小和分子量蛋白质分子量变化范围很大（6000-1000000），某些蛋白质是两个或更多的蛋白质亚基通过非共价的结合而形成的，这样的蛋白质称寡聚蛋白。

其分子量可以达上千万（如病毒外壳蛋白）。

蛋白质中较小的氨基酸占优势，平均分子量接近128。

由于每形成一个肽键除去一分子的水，所以氨基酸的平均分子量约为110。

因此，对于不含辅基的简单蛋白质，用110除它的分子量即可粗略地估计氨基酸残基的数目。

㈢、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次1、蛋白质分子构象的概念每种蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常被称为蛋白质的构象2、蛋白质分子结构的四个层次：一级、二级、三级和四级结构。

㈣、蛋白质功能的多样性1、酶—某些蛋白质是酶，催化生物界体内的代谢反应2、调节蛋白，某些蛋白是激素，具有一定的调节功能如调节蛋白，糖代谢的胰岛素，能降低血液中葡萄糖的含量；钙调素参与调节多种蛋白激酶的活性。

3、转运蛋白某些蛋白质具有运输功能，他们携带小分子从一处到另一处，通过细胞膜，在血液循环中不同的组织间运载代谢物。

4、营养和存储蛋白卵清蛋白和牛奶中的酪蛋白是提供氨基酸储存的蛋白。

在某些植物、细菌及动物组织中发现的铁蛋白可以贮存铁。

5、收缩和运动蛋白某些蛋白质赋予细胞和器官收缩能力可使其改变形状和运动，肌肉，鞭毛、微管、微丝等。

6、结构蛋白许多蛋白质起支持细丝、薄片或者缆绳的作用，给生物结构以强度和保护,丝蛋白、角蛋白肌腱和软骨的主要成分是胶原蛋白，它具有很高的抗张强度，韧带在含有弹性蛋白，形成了蛋白质的缆绳，具有双向的抗拉强度。

７、防御蛋白：高等动物的免疫反应是有机体的一种防御机能免疫反应主要是通过蛋白质来实现的８、受体蛋白：动物、植物、微生物对外界刺激的反应均涉及受体蛋白。

如视质红质，味觉蛋白二、肽㈠、肽和肽键的结构氨基酸通过酰氨键共价连接起来形成肽，含有两个氨基酸的称二肽，三个氨基酸的称三肽以此类推。

参加多肽形成的已不是完整的氨基酸分子称氨基酸残基。

肽的命名是根据参与氨基酸残基来确定的，从N端开始称某氨酰某氨酰氨基酸㈡、肽键的特点肽键具有部分双键的性质，限制了酰胺键的自由旋转；肽键具有双键的性质决定了六个原子位于同一平面即肽平面；键长发生了相应改变。

肽平面内，两个碳原子处于反式结构脯氨酸特殊可以是顺式或者反式这种肽键比较灵活这一点在三维构象中有独特的作用。

㈢、肽的物理和化学性质⒈物理性质：短肽是离子晶格，水中是偶极离子存在有一定的旋光性，短肽是各氨基酸的总和。

⒉酸碱性：决定于游离末端氨基、羧基及侧链可解离的基团,长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链，根据具体条件判断小肽带电性。

⒊化学性质具有氨基酸的部分化学性质，特征反应是双缩脲反应，氨基酸没有此反应。

含有两个或两个以上肽键的化合物加上硫酸铜的碱性溶液形成紫色复合物，借助分光光度计可以进行蛋白质定量测定。

㈣、天然存在的活性肽短链且具有生物功能的多肽不算蛋白质，通常称为活性肽！1、激素类：催产素、加压素、舒缓激肽、干扰素、胸腺肽、脑啡肽、睡眠肽等。

2、抗生素：短杆菌肽S、多粘菌素E3、剧毒物质：鹅膏蕈碱、蝎毒素4、谷胱甘肽：谷氨酰半胱酰甘氨酰，红细胞中作为巯基缓冲剂维持血红蛋白和其他红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态三、蛋白质一级结构测定英国学者Sanger1953年报告胰岛素氨基酸序列，现已测定了100000个不同蛋白质的氨基酸序列，有相当一部分是采用Sanger发明的方法；但目前大多数蛋白质氨基酸序列是通过基因的核苷酸序列推导出的㈠、测定蛋白质的一级结构的要求1 样品必需纯（>97%以上）；2 知道蛋白质的分子量；3 知道蛋白质由几个亚基组成；4 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。

5 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。

㈡、蛋白质测序策略测定蛋白质分子中多肽链的数目；断裂二硫键；拆分蛋白质分子得多肽链，并分离纯化每一条多肽链；测定每一肽链的氨基酸组成：完全水解，计算出氨基酸成分比；分析多肽链的N-末端和C-末端；裂解多肽链成较小的片段：用两种或几种不同的断裂方式断裂成几套肽段，并分离、纯化肽段；测定各肽段的氨基酸顺序；片段重叠法确定各肽段的顺序；二硫键位置的确定㈢、测定步骤1、多肽链的拆分由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分，非共价相互作用、二硫桥交联；几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L 尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)；几条多肽链通过二硫键交联在一起。

可在8 mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化2、测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目3、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比4、分析多肽链的N-末端和C-末端多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。

在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。

⑴N-末端基氨基酸测定①二硝基氟苯（DNFB）法Sanger法2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。

该产物能够用乙醚抽提分离。

不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。

②丹磺酰氯法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸，此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1 10-9mol③苯异硫氰酸酯（PITC）法Edman 氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。

此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。

④氨肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。

根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。

最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。

⑵C-末端基氨基酸测定①羧肽酶法羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。

根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。

目前常用的羧肽酶有四种：A、B、C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母羧肽酶A能水解除Pro、Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。

②肼解法多肽与肼反应生成氨基酸酰肼，C-端氨基酸不参加反应，氨基酸酰肼与苯甲醛作用生成二苯基衍生物沉淀，上清液C-端游离的氨基酸借助FDNB或DNS及层析鉴定，肼解过程中谷氨酰氨、天冬氨酸、半胱氨酸被破坏。

③还原法C-末端氨基酸硼氢化锂还原成相应的氨基醇，完全水解后肽段C-端氨基醇用层析法鉴定5、多肽链断裂成多个肽段：可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。

⑴酶解法：胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶①胰蛋白酶：赖氨酸Lys和精氨酸Arg羧基参加形成肽键，专一性较强，水解速度快②糜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶：苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr羧基参加形成肽键水解速度快; 亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His羧基参加形成肽键水解稍慢③胃蛋白酶：苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr形成的肽键水解速度快; 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快④嗜热菌蛋白酶：苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr, 亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸氨基参与形成的肽键，水解速度较快⑤羧肽酶和氨肽酶：分别从肽链羧基端和氨基端水解⑥木瓜蛋白酶：专一性差，赖氨酸、精氨酸羧基参与形成的肽键⑦葡萄球菌蛋白酶(Glu酶）和梭菌蛋白酶（Arg酶）：专一性强，Glu酶水解Glu，Asp羧端参加的肽键，改变pH只水解Glu羧端参加的肽键；Arg酶水解Arg羧基端参加的肽键。