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腺相关病毒（AAV）包装技巧上文已经介绍了腺相关病毒的基础知识，具有如此多优点、功能如此强大的腺相关病毒是如何生产的？本文将为大家揭开腺相关病毒生产的神秘面纱。
腺相关病毒生产流程大致可分为基因克隆、细胞转染、收毒、病毒纯化、滴度检测等步骤，具体步骤我们下文分解？怎么可能，下面就是腺相关病毒生产流程。
1）根据订单不同选择不同的载体，在此以人源基因克隆为例。
2）Vigenebio 公司的 AAV 载体与我们的人源 ORF （注：维真生物拥有18000人源cDNA ORF克隆，可以最快的时间克隆到载体）库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容，通过酶切，连接，转化的方式将基因亚克隆进入 pAV-FH AAV 载体，得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性。
细胞冻存流程1) 按照培养细胞流程，将细胞吹下来加入 50ml 离心管中， 800g 离心5min。
2) 配制冻存液，90% 血清，10% DMSO，混匀。
3) 离心后去上清，将配制的冻存液加入，将细胞吹匀4) 取上述溶液 1ml 分至 1.5ml 细胞冻存管中，做好标记和日期。
5) 放入装有异丙醇的冻存盒中，放入-80度冰箱过夜。
（冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温，使异丙醇的温度达到室温，每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上）。
6) 第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。
1) 10cm 培养盘中加 10cm 新鲜 DMEM 培养基，放培养箱预热至 37℃。
2) 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 ℃～38℃水浴中，使其融化（1-2 分钟左右）。
3) 待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中。
4) 摇晃均匀，放培养箱培养。
5) 4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基（除去冻存液中DMSO 对细胞的毒害作用。
也可在第 3步中 800g 离心 5min，除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的 DMEM 细胞培养皿中）。
1) 生物安全柜紫外灭菌半小时。
知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统【维真⽣物】提供AAV现货和AAV包装服务，已助⼒多位客户在顶级期刊发表⽂章。
产品说明书【详见维真⽣物官⽹→（腺相关病毒包装+腺相关病毒制备+腺相关病毒案例分享+腺相关病毒技术⼿册），或联系官⽹在线客服索要相关内容的链接。
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本产品仅供购买⽅内部研究使⽤，未经维真⽣物公司书⾯许可，严禁转售。
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腺相关病毒安全操作规范1. 请在BL2⽣物安全⼆级⽣物安全柜中操作病毒。
2. 操作病毒和转染细胞时，请务必穿着实验服，佩戴⼝罩和⼿套。
3. 请⼩⼼操作，避免产⽣⽓雾或飞溅。
被病毒污染的超净⼯作台，请⽴即⽤70%⼄醇加1% SDS溶液擦拭⼲净。
接触病毒的枪头、离⼼管、培养板、培养液请使⽤新鲜配制的10％漂⽩粉进⾏消毒操作后丢弃。
4. ⽤显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，⽤70%⼄醇擦拭培养瓶外壁后，显微镜下观察拍照。
观察完毕，请⽤70%⼄醇再次擦拭显微镜实验台。
5. 离⼼病毒时，应使⽤密封性好的离⼼管，或⽤封⼝膜封⼝后进⾏离⼼，请尽量使⽤组织培养室内的离⼼机。
6. 实验完毕脱掉⼿套后，请⽴即⽤肥皂和⽔清洗双⼿。
个⼈保护措施1. 使⽤⼀次性⼿套。
2. 在注射病毒或是其后的解剖时，使⽤⼀次性⼿术服或是相当的⾐物，如果是感染细胞时，可以穿着实验服。
3. 佩戴护⽬镜或是⾯罩。
4. 所有的操作应当是在 Class II ⽣物安全柜中进⾏。
如果实验条件不能满⾜，则应当在空⽓稳定的空间中操作，减少操作时间和病毒与外界接触的时间。
不慎接触病毒时的急救1. 病毒飞溅或是⽓溶胶与⼈体接触–眼，⽪肤或是粘膜⽤⼤量清⽔冲洗眼睛或是其他接触的部位⾄少15 分钟。
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章AdEasyTM 技术 33.1 技术概况33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4? 4.1.1 克隆的一般原则4? 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5? 4.2.1 共转化的一般原则5? 4.2.2 共转化方法5? 4.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6? 4.4.1 细胞铺板6? 4.4.2 磷酸钙转化技术7第五章常用技术85.1 QBI-293A细胞培养8? 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8? 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8? 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 ? 5.2.1 感染QBI-293A细胞9? 5.2.2 病毒空斑形成9? 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞95.3 MOI测定105.4 腺病毒感染力测定10? 5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11? 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 ? 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12? 5.5.3 Western杂交13? 5.5.4 Southern杂交和点杂交13? 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14? 5.5.6 免疫测定14? 5.5.7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 ? 5.7.1 不连续密度梯度离心17? 5.7.2 连续密度梯度离心17? 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集175.8 病毒滴度测定18? 5.8.2 空斑测定法20? 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养226.2 感染力测定226.3 转移载体克隆236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞256.6 筛选和测定256.7 在QBI-293A细胞中表达266.8 重组腺病毒的扩增266.9 纯化266.10 病毒滴度测定27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒感染细胞具体步骤及方法操作工具•慢病毒•腺病毒•腺相关病毒•悬浮细胞专用病毒•质粒基因调控•CRISPR/Cas9•RNA干扰•过表达•非编码基因•组织特异性启动子•Cre-loxp疾病研究•心血管领域•肝脏•眼•肺•脂肪、骨、肾脏神经领域•神经系统•光遗传•化学遗传•钙离子成像腺病毒腺病毒（Adenovirus）是一种线性双链DNA无包膜病毒，对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力，且具有嗜上皮细胞性。
重组腺病毒载体是以腺病毒为基础发展起来的工具病毒载体，它可通过受体介导的内吞作用进入细胞内，但腺病毒基因组不整合进入宿主细胞基因组中。
腺病毒作为一种常用的基因操作工具，在心血管领域、肝脏、肌肉、肺、肿瘤及其他领域广泛应用。
优势腺病毒与其他病毒工具比较，具有以下优势：a. 是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统：腺病毒感染细胞后，1-2 天即可表达，是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统;b. 滴度高：腺病毒系统在转有E1 基因的HEK293 细胞中可进行自我复制，可产生滴度为1010到1011 PFU/mL 的病毒;c. 载体容量大：可容纳不超过5kb 的片段;d. 不整合到染色体中，无插入致突变性：腺病毒除卵细胞以外，几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应。
包装服务质量检测载体选择粒成提供完善的腺病毒产品体系，用于操作编码基因和非编码基因，如lncRNA、microRNA、circRNA。
应用案例1. 细胞感染。
第一节AAV病毒的生活周期腺病毒伴随病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。
这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。
病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组。
从昆虫到人类都已分离到微小病毒。
AAV病毒属于依赖性病毒类（Dependovirus），最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分（Atchinson et al. 1965）, 顾而得名。
从鸟类到许多哺乳动物包括人的体内都分离到各种血清型的AAV病毒。
大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。
在多数情况下，AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染，只有在有辅助病毒包括腺病毒或疱疹病毒共同感染时才发生产毒性感染（Hoggan et al. 1966; Buller et al. 1981）。
因此，AAV病毒长期以来被认为是一种缺陷性病毒。
进一步的研究发现AAV病毒并非缺陷性病毒，而是在正常细胞中偏向于建立潜伏感染,仅在宿主细胞受到刺激时才被诱发进行感染性增殖。
AAV的生活周期有两种不同的胞内期。
在无辅助病毒存在时，AAV病毒颗粒进入细胞，脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达，并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。
这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。
AAV病毒偏向于整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置（Kotin et al. 1990,1991,19 92; Samulski et al. 1993）。
研究被AAV病毒潜伏感染的细胞发现，AAV对细胞表型往往有微弱影响，并影响细胞对刺激的反应能力（Yalkinoglu et al. 1988; Yakobson et al. 1987,1989; Bantel-Schaal et al. 1992, 1991）。
腺相关病毒常见问题解答Q1：AAV的注射方式，有尾静脉注射也有局部原位注射，该怎么选？AAV的体内注射（给药）方式分为系统性给药和局部给药，系统性给药主要有尾静脉、颈静脉、眼眶静脉和腹腔静脉给药；局部给药方式常见的包括脑立体定位、肌肉定点注射、心肌原位注射、玻璃体腔内注射、关节腔注射等；系统性给药是特点是病毒注射的体积较大，一般需要100~1000μl不等，病毒在体内扩散的范围广，一般系统性给药的方式操作较为简单，给药比较方便；局部给药则病毒注射量要求较少，一般100μl以内，但对滴度要求较高；由于是直接将AAV递送到目标组织，局部给药会有更好的靶向性，如果是临床基因治疗，局部给药注射的病毒量少，因此病理毒性会更小。
Q2：AAV注射小鼠，多少病毒量才够呢？影响AAV注射总量的因素很多，比较重要的有血清型、目标组织类型、注射方式（局部or全身）、动物模型（如大鼠or小鼠）等，对于有文献报道的，可参考文献的注射方法，最好设置几个不同的梯度。
例如AAV9感染小鼠心脏组织（心肌细胞），可采用尾静脉注射也可采用心肌多点注射的方式，尾静脉注射推荐1011 vg/mL，100μL；原点注射则推荐1010 vg/mL，20 μL/点。
想了解更多不同组织的AAV注射病毒量的推荐可以联系我们。
Q3：AAV注射后多久起效？有办法缩短其表达时间吗？在我们的上期有提到，AAV进入细胞后需经历一个从单链DNA变成双链DNA的过程，因此，目的基因开始表达所需的时间较长，一般在1周左右或以上可以检测到，这个也跟目的基因相关，不同基因的表达高峰时间是不同的。
另外，可采用自互补AAV（Self-complementary Recombinant Adeno-Associated Virus ，scAAV）加快表达速度，scAAV是通过改造其中的一个ITR使得AAV可形成二聚体，其进入细胞可直接进行表达，在多种组织中表达更迅速且表达水平更高。
腺病毒感染识别技巧腺病毒是一种常见的病毒，可能会引起多种疾病，从轻微的呼吸道感染到严重的肺炎等。
对于腺病毒感染的准确识别至关重要，这有助于及时采取适当的治疗措施，保障患者的健康。
接下来，让我们一起了解一些腺病毒感染的识别技巧。
首先，了解腺病毒感染的常见症状是识别的基础。
腺病毒感染的症状因感染部位和患者年龄而异。
对于儿童，常见的症状包括发热、咳嗽、喉咙疼痛、流鼻涕、眼结膜充血等。
有时还可能出现腹泻、呕吐等胃肠道症状。
而在成人中，腺病毒感染可能主要表现为发热、咳嗽、乏力、肌肉酸痛等类似于普通感冒的症状。
但如果病情较为严重，可能会导致肺炎，出现呼吸困难、胸痛等症状。
在临床检查方面，医生通常会进行血常规检查。
腺病毒感染时，白细胞计数可能正常或稍有减少，淋巴细胞比例可能相对增加。
此外，C 反应蛋白（CRP）和降钙素原（PCT）等炎症指标一般升高不明显，这与细菌感染时的明显升高有所不同。
病原学检查是确诊腺病毒感染的关键方法。
其中，病毒核酸检测是常用的手段之一。
通过采集患者的鼻咽拭子、痰液、血液等样本，采用聚合酶链反应（PCR）等技术检测腺病毒的核酸，具有较高的敏感性和特异性。
另外，病毒分离培养也是一种方法，但由于操作复杂、耗时较长，临床应用相对较少。
血清学检查也能为腺病毒感染的诊断提供帮助。
检测患者血清中的腺病毒特异性抗体，如 IgM 和 IgG 抗体。
如果 IgM 抗体阳性，提示近期感染；而 IgG 抗体在恢复期比急性期有 4 倍及以上升高，也具有诊断意义。
影像学检查在腺病毒感染的诊断中也具有重要作用。
对于出现肺部症状的患者，胸部 X 线或 CT 检查可能会发现肺部的炎症改变。
常见的表现包括肺部斑片状阴影、磨玻璃影等。
除了上述的医学检查方法，还需要结合患者的流行病学史进行综合判断。
如果患者近期接触过腺病毒感染患者，或者处于腺病毒流行的季节和地区，感染的可能性就会相应增加。
此外，要注意与其他病毒感染和细菌感染进行鉴别诊断。
