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腺病毒载体操作手册中文版解析腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
自噬荧光研究方法及具体步骤自噬(Autophagy ) 一词来源于古希腊语，是“auto” (自我)与“phagein” (吞噬)的结合。
自噬发生在细胞内,是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器，使其包被进入双层膜曩泡(自噬体)，进而与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物的过程，自噬的意义在于实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
在自噬过程中,自噬体的形成是关键,其直径平均500mn ,霆泡内包裹胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等。
与其他细胞器相比，自噬体的半衰期很短,只有8min左右，说明自噬是细胞对于环境变化的有效反应。
细胞质中的线粒体等细胞器首先被曩泡所包被,这种曩泡主要来自于内质网和高尔基体；曩泡最终形成双层膜结构,即自噬体(autophagosome )；自吞噬体与胞内体融合形成中间自体吞噬泡，最终自体吞噬泡的外膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome ),由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。
自I®观察检测方法：1 •透射电镜下直接观察自噬体Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜；自噬体的特征为：双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等；自噬溶酶体的特征为：单层膜,胞浆成分已降解。
2利用Western Blot检测LC3-H I比值的变化以评价自噬形成自噬形成过程中，胞浆型LC3(LC3-I)会酶解掉一段多肽，转变为膜型LC3 ( LC3-II \ 故而LC3-WLC3-I比值的大小可估计自噬水平的高低。
3 .在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成无自噬时, GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,—个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
单荧光检测系统该系统通过外源表达系统在宿主细胞中过表达GFP- LC3B融合蛋白。
自噬研究方法工具汇总---BIO-RAD细胞自噬细胞自噬（autophagy）是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程。
这个过程可以清除功能异常的细胞器、细胞内病原体以及再循环细胞组分。
尽管自噬最早被发现是应答饥饿，现在发现自噬受到各种胁迫信号的诱导，基础水平的自噬有利于细胞内稳态的维持.很多因素包括激素刺激的天然免疫信号及能量耗尽或高温等引起的物理胁迫会诱导自噬上调。
相反，很多疾病如癌症、传染性疾病和神经退行性疾病及衰老和自噬的下调都有关联。
自噬主要有三种信号通路:●Microautophagy小自噬通过溶酶体的膜内陷“吞入”目标分子，起到降解细胞质中小体积物质的作用.这个过程研究得不是很清楚,膜内陷相关的GTPaseVps1p蛋白和自噬相关蛋白(Atg)参与其中。
● 分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediatedautophagy,CMA）直接将细胞质蛋白带到溶酶体。
带KFERQ—序列的蛋白质和热休克蛋白Hsc70及其它分子伴侣相互作用形成的复合体和溶酶体膜上的Lamp-2A受体结合后，导致Lamp—2A 聚合引发复合体中的底物易位穿越溶酶体膜.● Macroautophagy大自噬被研究得最多,可以降解更大量的胞浆物质，由特殊的细胞器自噬小体介导。
大自噬起始于吞噬泡装配点(PAS）的形成和Unc51—likekinase (Ulk)复合体的组装,这启动了自噬小体的形成(图1）。
接着是成核阶段，Ulk复合物与由beclin—1、Vps15、Vps34、Atg14组成classIII PI3K 复合物相互作用形成吞噬泡。
接着吞噬泡膜扩展形成自噬小体，在这个过程中Atg12/5/16复合物促成了磷脂酰乙醇胺（PE）和LC3(酵母中是Atg8）的偶联，这是自噬小体膜唯一已知的标志物。
PE-LC3偶联物在几个关键步骤中起作用：自噬泡膜的扩展、自噬体的识别及自噬溶酶体的形成。
整个过程涉及30多个自噬相关基因（Atg蛋白），包括Beclin-1、溶酶体相关膜蛋白(Lamp—1 and Lamp—2)和微管相关蛋白1A/1Blight chains 3A/B （MAP1LC3A/B 或简称LC3)，这些都是自噬常见的标志物.最后一步，完全形成的自噬小体与溶酶体融合释放内含的物质被降解。
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。
AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。
rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM 操作手册目录第一章简介 1 3.2AdEasyTM 系统中产生重组腺病毒的时程 3第二章应用重组腺病毒的长处 2 第四章主要流程 4第三章 AdEasyTM 技术 3 4.1 将基因克隆入 AdEasyTM 转移载体 43.1 技术概略 3缩写英文全称中文全称AdAdenovirus 腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB 培育基Ad5Adenovirusserotype5 血清 5 型腺病毒MCSMultipleCloningSite 多克隆位点AdVAdenoviralVector 腺病毒载体MinMinute 分钟AmpAmpicillin 氨苄青霉素MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) 感染复数β-Gal β-Galactosidase - 半β乳糖苷酶mRNAMessengerRNA 信使 RNAbpBasePair 碱基对MWCOMOIecularWeightCut-offBSABovineSerumAlbumin 小牛血清白蛋白PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis 聚丙烯凝胶电泳cDNAComplementaryDNA 互补 DNA PBSPhosphateBufferedSaline 磷酸盐缓冲液cccDNAClosedCircularCoiledDNA 闭环螺旋 DNA PFUPlaqueFormingUnit 空斑形成单位CPECytopathicEffect 细胞病理效应piPostInfection 感染后CsClCesiumChloride 氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus 增殖性腺病毒DMEMDulbecco’ sModifiedEagleMediumDMEM 培育基RITRRightInvertedTerminalRepeat 右边反向尾端重复DMSODimethylSulfoxide 二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate 十二烷基硫酸钠DTTDithiothreitol 二硫苏糖醇TBETrisBorate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid 乙二胺四乙酸乙酸EtBrEthidiumBromide 溴化乙锭TCID50TissueCultureInfectiousDose5050% 组织培育感染剂FBSFetalBovineSerum 胎牛血清量HrHour 小时TCPTotalCellularProtein 细胞总蛋白ITRInvertedTerminalRepeat 反向尾端重复TETris/EDTATE 溶液KanKanamycin 卡那霉素wtWildType 野生型kbKilobases 千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5- 溴KDaKiloDaltons 千道尔顿-4-氯 -3-吲哚 -β-D- 半乳糖苷第一章简介此刻基因输送技术的发展日益复杂，一些治疗药物（生长激素、扰乱素、抗病毒和抗癌复合物）和诊疗性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP（-RFP）-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。
建议不要在-20℃下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。
腺相关病毒引言腺相关病毒（AAVs）是一种复制缺陷型细小病毒，其生产性感染需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以生产出无需辅助病毒的重组人血清型2型腺相关病毒（AAV-2）。
AAV HELPER-FREE SYSTEM利用已经明确用于调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物，并且这些基因产物能通过转染引进宿主细胞。
在AAV HELPER-FREE SYSTEM中，生产具感染性的AAV 病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A,E4和VA RNA 基因）大部分由和人AAV-2载体ＤＮＡ共转染进细胞的pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。
本系统包括通过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的AAV-293细胞。
通过消除对活的辅助病毒的需求，AAV Helper-Free System提供一个更安全，更纯净和更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。
野生型AAV-2基因组由病毒rep和cap基因（分别编码复制和基因）及位于两侧的包含所有辅助和包装必须的顺式作用元件的反向末端重复序列（ITRs）组成。
在AAV Helper-Free System中，rep和cap 基因从病毒载体中移除并转移到pAAV-RC质粒中，AAV-2 ITRs仍位于病毒载体中。
AAV rep和cap基因的转移允许感兴趣的外源基因插入病毒基因组中。
本系统可以容纳最大插入3kb。
在传统的基因传递系统中，有一个很大的顾虑是通过重组而恢复病毒野生型。
在本系统中，包含AAV-2末端重复序列的质粒(pAAV-MCS, pAAV-LacZ 和pAAV-hrGFP 以及 pAAV-IRES-hrGFP)与包含rep/cap基因的质粒(pAAV-RC)没有任何共同区域，从而阻止通过重组来野生型AAV-2。
为了确保这种无共同区域的保持，只用本系统提供的组件是非常重要的。
自噬双标腺病毒( mRFP-GFP-LC3 )使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食(Self-eating )”的现象，凋亡是“自杀( Self-killing )”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜(目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层)包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3勺剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP(-RFP) -LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技(上海)有限公司自主研发了用于实时监测自噬( 流)的mRFP-GFP-LC腺病毒，mRFP用于标记及追踪LC3, GF啲减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GF荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭, 此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
mRFP-GFP-LC3 腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80 C冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80 C冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4C保存（尽量一周内用完）。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。
建议不要在-20 C下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。
自噬研究—汉恒自噬腺病毒登Cell主刊---附：汉恒专家教你如何发Cell小编非常欣慰的告知大家，汉恒荧光自噬双标病毒产品再次荣登世界级权威杂志---不过这次换成了Cell主刊，2016年的影响因子：30.41！2017年7月27日，来自上海交通大学医学院附属仁济医院消化科的房静远教授、陈萦晅副教授、洪洁和陈豪燕副研究员与美国密西根大学邹伟平教授合作在Cell 正刊发表了题为“Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy”的研究论文，该研究表明核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）通过激活结直肠癌（CRC）细胞自噬诱导CRC对化疗药物耐受。
“该研究为临床上评估结直肠癌治疗后的复发风险和进一步加强联合治疗提供了非常广阔和重要的应用前景。
（Bioart）”在这篇论文中，研究者使用汉恒生物荧光自噬双标病毒产品mRFP-GFP-LC3有力地证明了F. nucleatum激活了CRC细胞自噬（Figure 1和2），而使用的方法恰是汉恒生物一直倡导的“自噬研究的金指标”-①LC3的Western blot、②自噬双标工具检测自噬流变化、③电镜直接观测自噬小体和自噬溶酶体的产生（Figure 3）.换言之，做自噬，必须要用荧光自噬双标病毒mRFP-GFP-LC3做自噬流检测。
【广告】汉恒生物荧光自噬双标病毒产品mRFP-GFP-LC3属于病毒现货产品，囊括了三大主流病毒-慢病毒、腺病毒和在体研究专用的腺相关病毒（AAV）。
同时还包括一系列线粒体自噬研究的现货工具。
详情请点击下方“阅读原文”获取资料。
Figure 1. F. nucleatum激活HCT116和HT29细胞的自噬（该图源于原文Fig2）.Figure 2. F. nucleatum激活HCT116细胞自噬是通过miR-18*和miR-4802介导的（该图源于原文Fig 4）.Figure 3. 汉恒生物自噬研究三大金指标（该图来源于汉恒讲坛系列PPT。
自噬单标、双标腺相关病毒使用指南汉恒生物科技（上海）有限公司目录⏹背景 (2)⏹病毒实验注意事项 (2)⏹腺相关病毒的存储与稀释 (3)自噬单标/双标腺相关病毒的操作 (3)⏹腺相关病毒的感染与使用 (3)（一）AAV感染目的细胞 (4)（二）AAV感染组织 (5)（三）结果分析 (7)附1 实验室病毒操作应急预案 (9)⏹背景自噬（Autophagy）是通过溶酶体的水解酶非特异的降解细胞质中蛋白质、细胞器等底物的一种过程，是细胞正常生命活动的一部分。
自噬异常往往是引起细胞损伤和老化的首要驱动因素，在肿瘤、衰老、炎症、免疫应答、心脑血管疾病、氧化应激、神经退行性疾病、代谢、发育等生物学过程中几乎都有自噬参与。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP/RFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
LC3是用来标记定位自噬小体到自噬溶酶体的动态变化，特别是利用mRFP-GFP-LC3差异化标记酸性和中性LC3阳性的囊泡，用颜色变化来指示自噬的不同阶段（由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭此时只能检测到红色荧光）可以在活细胞水平动态监测自噬流的强弱，满足定性和定量分析的要求。
GFP-LC3和RFP-LC3单标探针可以监测LC3蛋白参与自噬起始过程自噬较少时，GFP-LC3和RFP-LC3融合蛋白主要弥散在胞浆中；自噬增加时，GFP-LC3和RFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低）。
对于单标探针GFP-LC3或RFP-LC3与双标探针mRFP-GFP-LC3的主要区别需要作进一步的说明：GFP-LC3和RFP-LC3单标探针对于监测自噬体的形成特别有用，但这两种单标探针不利于自噬流的整个过程进行动态检测，比如无法精确监测溶酶体是否参与也无法示踪自噬体的成熟过程等。
因此，单标探针往往需要联合其他探针，比如溶酶体探针Lamp1-RFP、Lamp1-GFP一起使用，根据共定位的信息来更加精细的示踪自噬体的成熟过程。
而mRFP-GFP-LC3串联双标记探针则可以解决这个问题比如从自噬小体到自噬溶酶体的动态变化等。
汉恒生物构建RFP-GFP-LC3双标的腺相关病毒（AAV）载体，包装成双标的腺相关病毒，可在体观察自噬，实时检测自噬流的强弱，更加准确、清晰、直观！弥补了LC3自噬双标腺病毒在体转染的缺陷，并且可根据组织器官的亲和性，选择不同的AAV血清型，是最有效的在体自噬流检测工具！⏹病毒实验注意事项1）病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2）操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3）操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4）如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5）病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理，实验完毕通过肥皂水清洗双手。
6）未尽事宜请咨询汉恒生物技术人员了解详情，汉恒生物全国免费热线400-092-0065；7）您可登录汉恒生物官网 观看病毒实验操作视频，并与我们的客服人员互动交流。
⏹腺相关病毒的存储与稀释（一）腺相关病毒的储存收到病毒液后如在短期内使用腺相关病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 L/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
（二）腺相关病毒的稀释当需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞的PBS或生理盐水混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
自噬单标/双标腺相关病毒的操作⏹腺相关病毒的感染与使用（一）AAV感染目的细胞AAV对离体细胞的感染能力比较有限，所需病毒MOI大于104，一般不推荐用AAV进行细胞感染实验。
虽然AAV感染离体细胞能力较差，通过选择合适的血清型并使用合适的病毒感染MOI仍然可以达到一定的感染效果。
表1.不同血清型AAV感染体外培养细胞比较1.细胞培养：将状态良好的目的细胞接种到细胞培养皿中，尽量使用小孔培养皿（24孔板或者48孔板），接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。
2.确定MOI：MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。
通常MOI越高，AAV病毒感染后宿主细胞内保留的腺病毒基因组数量以及目的蛋白的表达量越高。
AAV病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。
每种细胞对应每种类型的病毒都应该进行最适MOI摸索实验，设置MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI进行实验。
MOI一般以104：105：106进行梯度摸索。
3.MOI对应病毒体积的换算转染时细胞数（一般以传代计数细胞数×2计算）×MOI=病毒个数；则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。
例子：转染细胞数为105个，MOI为105，则需要病毒的个数为1010个，病毒如果滴度为1012v.g/ml，则需要加入的病毒体积为1010/（1012v.g/ml）=10-2ml=10ul。
4.病毒感染：感染实验分为两组，分别添加相应腺体病毒载体和等滴度同体积的对照病毒载体，1/2体积培养液感染（详见下表格）。
加入的病毒量范围推荐MOI为=104；105；106内。
1/2体积感染2小时后，不换液，追加1/2新鲜培液，继续37度感染过夜。
感染24小时候换新鲜培液。
对于polybrene适用的细胞，1/2体积感染的培液中，polybrene浓度为固定值（5～8ug/ml）；如2小时后停止感染置换新鲜培液，则无需再加入polybrene（针对上述增殖能力弱的细胞）；如2小时1/2 体积感染后继续追加培液感染过夜，则补充的新鲜培液中要含有等终浓度的polybrene。
表2.不同培养皿加入的培养液体积参考表格（二）AAV感染组织1.AAV血清型选择AAV病毒主要应用于在体组织器官的感染，根据不同的组织选择合适的血清型，可用于神经系统、眼睛、心机、肝脏、肺脏、肾脏和肌肉等组织器官。
表3.不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性2.AAV注射方式关注汉恒生物微信公众号：菜单栏——微官网——实验视频，可以观看动物不同部位的AAV具体注射方式。
表4.注射方式及血清型选择3.AAV注射后的观察AAV注射感染组织器官至少3周后可取材进行冰冻切片直接观察荧光（如GFP, RFP 等）、石蜡切片（可以组化染色）、荧光定量PCR（qPCR），甚至免疫印迹（WB）来考察基因表达情况。
（一般情况下，对于心肌、骨骼肌、肝脏、肾脏、皮肤等适合原位注射的组织器官，如果AAV带有GFP荧光标记，注射感染适量病毒3~4周后肉眼即可观察到注射部位组织发绿。
）（三）结果分析mRFP-GFP-LC3串联荧光蛋白腺相关病毒中表达的GFP和mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体融合形成自噬溶酶体（由GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭，此时只能检测到红色荧光，原理如下图所示）。
图1. mRFP-GFP-LC3原理使用激光共聚焦显微镜拍照，然后用ImageJ软件分析荧光的相对强度。
GFP在酸性环境中会降解，而RFP则不会。
因此，黄色斑点（由红色和绿色之间的重叠形成）表示自噬体，而红色斑点表示自噬溶酶体。
如果自噬被激活，红色信号将多于黄色。
如果自噬被抑制，则黄色信号多于红色信号，如下图所示。
图2.在合并后的图像中，黄色斑点表示自噬体，而红色斑点表示自噬溶酶体。
与sham 组相比，IR 组中红色斑点百分比明显增加，黄色斑点百分比减少，说明缺血/再灌注导致自噬溶酶体增加，自噬体减少。
J Pineal Res. 2017 Apr;62(3).附1 实验室病毒操作应急预案一、针对病毒（慢病毒、腺病毒、腺相关病毒及逆转录病毒）溢出1、戴一次性乳胶手套及实验用口罩，穿实验服，必要时需进行脸和眼睛防护，在生物安全柜中操作病毒实验。
2、当有少量的病毒液体泼溅，立刻停止实验，向纸巾上倾倒，适当的消毒剂，并立即覆盖周围区域（通常可以使用 84 消毒液）。
3、使用消毒剂时，从溢出区域的外围开始，朝向中心进行处理。
作用适当时间后（例如 30 min），将所处理物质清理掉。
4、如果含有碎玻璃或其他锐器，则要使用镊子、簸箕或硬的厚纸板来收集处理过的物品，并将它们置于可防刺透的容器中以待处理。
切勿直接用手进行操作。
5、对溢出区域再次清洁并消毒（如有必要，重复第 2～4 步）。
将污染材料置于防漏、防穿透的废弃物处理容器中。
二、病毒液体接触到皮肤或眼睛1、脱掉污染的手套或者其他防护物，立即用含75%乙醇消毒液（或者0.2-0.5%的过氧乙酸、500-10000 mg/L有效氯消毒液、碘酒）的棉球擦拭，切不可用 84 消毒液，以免灼伤皮肤。
并且用大量清水冲洗，至少 15 分钟。
2、如果遇到针头扎伤或者刀片割伤时，第一时间处理伤口，应立即用力捏住受伤部位，向离心方向挤出伤口的血液，不可来回挤压，同时用流动水清洗伤口，至少 15 分钟。
3、若感染性物质意外进入眼睛、口腔，立即用大量流动清水或生理盐水冲洗，至少 15 分钟。
4、病毒污染眼部或眼睛周围：立刻用洗眼器或洗眼液冲洗眼部，至少 15 分钟，并到医院开具抗病毒眼药水。
5、经简单处理或消毒后，务必立即前往急诊室就诊。
保留完整适宜的医疗记录。
6、意外受伤或感染后必须在 24 小时内报告实验室管理人员，并填写生物安全事件报告书。
三、病毒溢出污染离心机1、遇病毒溢出污染离心机，应立刻停止离心，离开实验室，开启实验室紫外灯60 分钟。
离心机一个小时后打开，让病原物质沉降一下，然后工作人员戴双重口罩或N95口罩，用镊子和酒精擦拭污染部位。
2、处理完毕后，脱弃外层手套，再开紫外照射 60 分钟。
填写意外事故登记表。
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