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农产品质量检测技术研究手册第1章绪论 (4)1.1 研究背景及意义 (4)1.2 国内外研究现状 (4)1.3 研究内容及目标 (4)第2章农产品质量检测技术概述 (5)2.1 农产品质量检测的定义与分类 (5)2.2 常见农产品质量检测方法 (5)2.3 农产品质量检测技术的发展趋势 (5)第3章化学检测技术 (6)3.1 液相色谱法 (6)3.1.1 基本原理 (6)3.1.2 方法分类 (6)3.1.3 检测流程 (6)3.2 气相色谱法 (6)3.2.1 基本原理 (6)3.2.2 方法分类 (7)3.2.3 检测流程 (7)3.3 原子吸收光谱法 (7)3.3.1 基本原理 (7)3.3.2 方法分类 (7)3.3.3 检测流程 (7)3.4 原子荧光光谱法 (7)3.4.1 基本原理 (7)3.4.2 方法分类 (8)3.4.3 检测流程 (8)第4章生物检测技术 (8)4.1 酶联免疫吸附测定 (8)4.1.1 基本原理 (8)4.1.2 方法分类 (8)4.1.3 应用实例 (8)4.2 聚合酶链反应 (8)4.2.1 基本原理 (8)4.2.2 方法分类 (8)4.2.3 应用实例 (9)4.3 生物传感器技术 (9)4.3.1 基本原理 (9)4.3.2 方法分类 (9)4.3.3 应用实例 (9)4.4 蛋白质组学技术 (9)4.4.1 基本原理 (9)4.4.2 方法分类 (9)第5章物理检测技术 (9)5.1 磁共振成像技术 (9)5.1.1 磁共振成像原理 (9)5.1.2 磁共振成像在农产品质量检测中的应用 (10)5.2 近红外光谱技术 (10)5.2.1 近红外光谱原理 (10)5.2.2 近红外光谱在农产品质量检测中的应用 (10)5.3 计算机视觉技术 (10)5.3.1 计算机视觉原理 (10)5.3.2 计算机视觉在农产品质量检测中的应用 (10)5.4 超声波检测技术 (10)5.4.1 超声波检测原理 (10)5.4.2 超声波检测在农产品质量检测中的应用 (10)第6章传感器检测技术 (11)6.1 光传感器 (11)6.1.1 光传感器原理 (11)6.1.2 光传感器分类 (11)6.1.3 光传感器在农产品质量检测中的应用 (11)6.2 温度传感器 (11)6.2.1 温度传感器原理 (11)6.2.2 温度传感器分类 (11)6.2.3 温度传感器在农产品质量检测中的应用 (11)6.3 湿度传感器 (11)6.3.1 湿度传感器原理 (12)6.3.2 湿度传感器分类 (12)6.3.3 湿度传感器在农产品质量检测中的应用 (12)6.4 电化学传感器 (12)6.4.1 电化学传感器原理 (12)6.4.2 电化学传感器分类 (12)6.4.3 电化学传感器在农产品质量检测中的应用 (12)第7章检测数据处理与分析 (12)7.1 数据预处理方法 (12)7.1.1 数据清洗 (12)7.1.2 数据集成 (12)7.1.3 数据变换 (13)7.1.4 数据降维 (13)7.2 数据分析方法 (13)7.2.1 描述性统计分析 (13)7.2.2 相关性分析 (13)7.2.3 方差分析 (13)7.2.4 多元回归分析 (13)7.3 机器学习与模式识别 (13)7.3.1 线性判别分析（LDA） (13)7.3.3 决策树 (13)7.3.4 人工神经网络 (14)7.4 数据可视化技术 (14)7.4.1 散点图 (14)7.4.2 直方图 (14)7.4.3 箱线图 (14)7.4.4 热力图 (14)第8章质量安全标准与法规 (14)8.1 我国农产品质量安全标准体系 (14)8.1.1 农产品质量安全标准的分类与制定 (14)8.1.2 农产品质量安全标准的实施与监督 (14)8.2 国际农产品质量安全法规 (14)8.2.1 国际农产品质量安全法规概述 (14)8.2.2 主要国际组织及我国参与情况 (15)8.3 农产品质量安全认证体系 (15)8.3.1 农产品质量安全认证的分类与程序 (15)8.3.2 我国农产品质量安全认证制度 (15)8.4 农产品质量检测实验室建设与管理 (15)8.4.1 农产品质量检测实验室建设 (15)8.4.2 农产品质量检测实验室管理 (15)8.4.3 农产品质量检测实验室能力建设 (15)第9章农产品质量检测应用案例 (15)9.1 水产品质量检测 (15)9.1.1 虾类产品中病原微生物检测 (15)9.1.2 鱼类产品中重金属含量检测 (16)9.2 蔬菜产品质量检测 (16)9.2.1 农药残留检测 (16)9.2.2 有害元素检测 (16)9.3 畜禽产品质量检测 (16)9.3.1 畜禽肉类产品中兽药残留检测 (16)9.3.2 畜禽产品中微生物检测 (16)9.4 粮油产品质量检测 (16)9.4.1 粮食中真菌毒素检测 (16)9.4.2 食用油中塑化剂检测 (16)9.4.3 粮油产品中重金属检测 (16)第10章农产品质量检测技术发展趋势与展望 (16)10.1 新型检测技术的研究与应用 (16)10.2 检测技术智能化发展 (17)10.3 网络技术在农产品质量检测中的应用 (17)10.4 农产品质量检测技术未来展望与发展策略 (17)第1章绪论1.1 研究背景及意义社会经济的快速发展和人们生活水平的不断提高，农产品质量与安全问题日益受到广泛关注。
蛋白质组什么是蛋白质组？蛋白质组（Proteome）是指在特定生物体内或某一特定生物过程中所参与的所有蛋白质的集合。
与基因组类似，蛋白质组也具有复杂性和多样性，涉及到某个生物体或组织中存在的所有蛋白质的种类、数量和功能。
研究蛋白质组可以帮助我们更好地理解生命活动的基本规律以及疾病的发生机制。
蛋白质组研究方法蛋白质组研究涉及到多种方法和技术，以实现对蛋白质组的全面分析和描述。
以下是常用的蛋白质组研究方法：1.二维凝胶电泳（2-DE）：通过将样品中的蛋白质进行电泳分离，然后使用染色剂进行染色，最后对结果进行图像分析和识别。
2-DE是一种传统的蛋白质组分析方法，可以提供目标蛋白质的信息。
2.液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）：液相色谱质谱联用技术结合了液相色谱和质谱技术，可以在蛋白质水平上进行深度分析。
这种方法适用于检测低丰度蛋白质和翻译后修饰，能够更好地揭示蛋白质组的复杂性和多样性。
3.同位素标记定量（Isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ）：iTRAQ是一种用于定量蛋白质组的技术，它通过将不同样品中的蛋白质使用不同的同位素标记，并将它们混合在一起进行质谱分析，从而实现定量。
4.蛋白质芯片技术：蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质组研究方法，可以同时检测成千上万个蛋白质。
它通过固相化学方法将蛋白质捕获在特定位置上，然后使用荧光或质谱方法进行检测。
蛋白质组在科学研究中的应用蛋白质组学研究可以广泛应用于医学、生物学、药物研发等领域，对于认识生物体内蛋白质的种类和功能，以及它们在生理和病理状态下的变化具有重要意义。
1.药物研发：通过研究蛋白质组可以更好地了解疾病的发生机制，从而寻找新的药物靶点和开发治疗手段。
蛋白质组学的应用在药物研发中扮演着重要的角色。
2.疾病诊断和治疗：研究蛋白质组可以帮助鉴定出特定疾病的生物标记物，从而提高疾病的早期检测和诊断的准确性。
生物学实验操作手册1. 实验介绍在本操作手册中，将为您提供一系列生物学实验的操作指南。
这些实验涵盖了从基础的生物学概念到高级的实验技术。
通过遵循本手册中的步骤，您将能够掌握各种生物学实验的基本操作和技能。
2. 实验分类2.1 细胞生物学实验•环境对细胞形态的影响：包括温度、pH值、离子浓度等因素对细胞形态和功能的影响。
•染色体核型分析：使用显微镜观察染色体，并进行核型分析。
•细胞培养与维护：培养和繁殖不同类型的细胞系。
2.2 分子生物学实验•蛋白质表达与纯化：利用细菌或其他表达系统表达目标蛋白，并进行纯化。
•DNA/RNA提取和纯化：从生物样品中提取DNA/RNA，并进行纯化。
•PCR扩增：使用聚合酶链反应（PCR）方法扩增目标DNA片段。
2.3 遗传学实验•杂交与基因组分析：通过杂交实验和基因组分析确定遗传物质的传递方式。
•基因突变分析：利用不同突变体进行基因功能鉴定。
•遗传连锁和基因定位：通过遗传连锁和基因定位方法确定基因的位置。
3. 实验步骤示例3.1 细胞生物学实验中的步骤示例实验名称：观察温度对细胞形态的影响1.准备培养细胞所需的培养基及培养器具。
2.将细胞接种到已经预先消毒并加入培养基的培养皿中。
3.设立不同温度条件下的实验组，将培养皿置于恒温箱中。
4.观察细胞在不同温度条件下的形态变化，并记录相应数据。
5.结束实验后，根据数据结果进行统计和分析。
3.2 分子生物学实验中的步骤示例实验名称：DNA提取与纯化1.准备待提取DNA的生物样本，如血液或植物组织等。
2.使用特定试剂对样本进行细胞破碎和溶解。
3.添加相关酶和缓冲液，促使DNA释放并与其他细胞组分分离。
4.经过离心等步骤，收集纯化后的DNA溶液。
5.使用吸光光度计或凝胶电泳等方法检测DNA提取纯度和浓度。
3.3 遗传学实验中的步骤示例实验名称：杂交实验确定基因型1.准备不同基因型的个体进行交叉杂交。
2.收集得到的杂种后代，并对其表型进行观察和记录。
protein synthesis analysis实验方法
蛋白质合成分析实验方法有多种，其中包括：
1. 免疫印迹法（Western Blot）：通过特异抗体检测蛋白质样品中的特定蛋白，常用于检测蛋白质的表达、定位和定量分析。
2. 蛋白质谱（Protein Mass Spectrometry）：通过质谱技术对蛋白质进行鉴定和定量分析，可以同时检测多种蛋白质。
3. 微阵列技术（Microarray）：通过基因芯片或蛋白质芯片检测细胞或组织中蛋白质的表达水平，可同时检测上千个蛋白质。
4. 串联质谱（Tandem Mass Spectrometry）：一种高通量的蛋白质鉴定技术，可以对蛋白质进行精细分析，包括蛋白质的修饰、剪切和变异等。
5. 荧光共振能量转移技术（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）：通过检测荧光信号的转移效率来分析蛋白质之间的相互作用和距离，可以用于研究蛋白质的构象变化和动态行为。
6. 磷酸化分析（Phosphorylation Analysis）：通过检测蛋白质磷酸化水平来分析蛋白质的活性状态和信号转导，常用于研究细胞生长、分化、凋亡等过程。
7. 基因表达分析（Gene Expression Analysis）：通过检测特定基因的转录水平来分析蛋白质的表达和调控，可了解蛋白质在不同生理或病理条件下的变化。
这些方法各有特点，可以根据实验目的和需求选择合适的方法进行蛋白质合成分析。
蛋白电泳手册SDS—PAGE及Western blot蛋白电泳蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一，电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用，样品用量少(1—100μg)，分辨率高，凝胶机械强度大，重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.PAGE原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr）和交联剂N，N'—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。
SDS—PAGE原理SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异.因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS —PAGE)。
实验使用过程中，还加入DTT或者＊＊＊,以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。
SDS—PAGE最常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶)。
索引蛋白电泳（SDS—PAGE)……………………电泳试剂总表……………………………………………………制胶………………………………上样及电泳……………………染色蛋白提取蛋白定量Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明Lowry蛋白浓度测定试剂盒使用说明蛋白分子量标准（图）考马斯蛋白胶快速染色液Western blotWestern blotting DAB检测试剂盒Western blotting ECL化学发光检测试剂盒Western blotting 试剂盒使用说明蛋白电泳试剂（部分试剂可以相互替换）系号货号名称1T8060TRIS 三羟甲基氨基甲烷2G8200Glycine 甘氨酸3S8010SDS 十二烷基硫酸钠4A8080Acrylamide 丙烯酰胺5M8200N,N-Methylene Bisacrylamide甲叉双丙烯酰胺6A8090Ammonium Persulfate 过硫酸胺7D8220DTT 二硫苏糖醇8M8210β-Mercaptoethanol β—*＊＊9T8090TEMED 四甲基*＊*10A101030％丙烯酰胺（29:1）11S10514XSDS—PAGE分离胶缓冲液（PH=8.8）12S10524XSDS—PAGE浓缩胶缓冲液（PH=6.8）13P10164×蛋白上样缓冲液(含β-**＊）14P10154×蛋白上样缓冲液(含DTT)15D10701M DTT16A103010%过硫酸氨17T10201M Tris-HCL (PH6。
说明书Pierce®BCA Protein Assay Kit（Pierce® BCA 蛋白定量分析试剂盒）NCI3225CH NCI3227CH2436.0目录号描述NCI3225CH Pierce BCA Protein Assay Kit（Pierce BCA 蛋白定量分析试剂盒），试剂可用于500 次试管或5000 次微孔板分析NCI3227CH Pierce BCA Protein Assay Kit（Pierce BCA 蛋白定量分析试剂盒），试剂可用于250 次试管或2500 次微孔板分析试剂盒组分：BCA 试剂A，1000mL（产品目录号NCI3225CH）或500mL（产品目录号NCI3225CH)。
含有溶解于0.1M 氢氧化钠中的碳酸钠、碳酸氢钠、二喹啉甲酸（BCA）以及酒石酸钠。
BCA 试剂B，25mL，含有4%的硫酸铜白蛋白标准品，2mg/mL，10 1mL 安瓿，包含浓度为2mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）和0.05%的叠氮化钠，溶解于0.9%生理盐水中。
储存：在收到试剂盒后将其储存于室温。
常温运输。
注：如果在寒冷天气进行运输，或在保存期间，试剂A 或试剂B 发生沉淀，可通过对溶液进行温和加热和搅拌，将沉淀溶解。
当试剂盒发生变色，或证明有微生物污染时，请将试剂丢弃。
目录产品简介 (2)标准品和工作液的制备（两种检测方案均适用） (3)试管检测方案（样品与工作液的比例=1:20） (4)微孔板检测方案（样品与工作液的比例=1:8） (6)常见问题及解决方案 (7)Thermo Scientific 相关产品 (8)附加信息 (9)参考文献 (11)产品简介Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白定量分析试剂盒是一种基于二喹啉甲酸（BCA），利用比色法测定总蛋白浓度的蛋白定量试剂盒，可与去污剂兼容。
本方法将双缩脲反应和显色反应结合在一起：前者为在碱性介质中，蛋白质可将Cu2+还原成Cu1+ 的反应，后者为使用含有二喹啉甲酸（BCA）1 的独特试剂，利用比色法检测Cu1+，具有高灵敏度和高选择性的特点。
冷泉港蛋白质组学实验手册
冷泉港蛋白质组学实验手册是一本详尽的教科书，包含了关于冷泉港
蛋白质组学研究的最新技术和策略。
其内容涵盖从样品采集和处理到
数据分析的各个环节，具有很强的实用性，既可以帮助新手熟悉蛋白
质组学技术，也适合作为经验丰富的科学家参考手册。
冷泉港蛋白质组学实验手册首先阐述了该技术的基本原理与技术概述：蛋白质组学技术的定义、基本的技术步骤以及表达分析的优缺点等内容。
在此基础上，手册深入剖析了每个步骤中的细节，并阐明其相关
的技术和��色设备的使用，使读者能够熟练掌握蛋白质组学实验技术。
此外，手册还提供了关于蛋白质组学实验数据分析的建议，帮助
读者合理地处理获取的蛋白质组学实验数据，便于得出统计学有意义
的结论。
冷泉港蛋白质组学实验手册的内容丰富而详尽，结构清晰，着力于解
决面临的科学问题，系统地介绍了蛋白质组学的全流程实验设计及数
据分析。
手册中还介绍了多种经典技术，如2-DE、流式细胞术、硅胶
电泳、基因组测序、生物信息学分析等，同时还引入了大量新发展的
技术，如质谱分析、硫酸氢锌技术等，丰富了临床检测和研发的技术
支持。
冷泉港蛋白质组学实验手册是一本权威而有效的参考书，着重介绍了
蛋白质组学的全流程实验技术，并给出了大量具体应用的例子，可以
帮助你更好地了解蛋白质组学的真实状况，获得有效的技术支持，从
而推动蛋白质组学领域的发展与进步。
第一部分组织和细胞蛋白样品的制备1 材料和方法1.1 材料1.1.1 组织和细胞的来源：1.1.2 仪器设备机械组织匀浆器低温高速离心机(>40,000 g)超速离心机超生细胞破碎仪超纯水装置1.1.3 试剂三氯醋酸(TCA)丙酮二硫苏糖醇(DTT)尿素CHAPSPMSFEDTA乙醇磷酸考马斯亮蓝R350抑肽素A亮肽素●试剂纯度均应是分析纯或以上。
1.1.4 溶液配制(1)PBS：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L；(2)EDTA 储存液：18.61 g Na2EDTA·2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。
可高压灭菌后分装备用；(3)亮肽素储存液(50 μg/ml，100×)10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存；(4)抑肽素储存液(70 μg/ml，100×)1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存；(5)PMSF储存液(10 mM, 100×):17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。
(6)DTT 储存液(1 M):0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃保存(DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。
(7)裂解液:Lysis buffer A(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Final concentration Amount9 M 10.8 gUrea (FW 60.06,Sigma, >99.5%)4% (w/v) 0.8 gCHAPS (FW 614.89,Sigma, >98%Ultrapure H2O to 20 mlprepare fresh or store in aliquots at –20℃A cocktail of proteaseinhibitorsDTT(FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysisbuffer (15.5×stock),-20℃(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of proteaseinhibitors)Lysis buffer C40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Final concentration AmountUrea (FW 60.06) 8 M 9.6 gCHAPS 4% (w/v) 0.8 gTris base (FW 121.1)Ultrapure H2O to 20 mlprepare fresh or store in aliquots at –20℃A cocktail of proteaseinhibitorsDTT (FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysisbuffer (15.5×stock),-20℃Lysis buffer E(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Final conc. AmountUrea 5 M 3.0 gThiourea (FW76.12)2 M 1.52 gSB 3-10 (FW 307.5) 2% 0.2 gCHAPS 2% 0.2 gUltrapure H2O to 10 mlA cocktail ofprotease inhibitorsDTT (FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysis buffer(15.5×stock), -20℃100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
(8) 蛋白酶抑制剂混合物[3]成分终浓度蛋白酶抑制剂混合物PMSF 35 μg/ml or 1 mMEDTA 0.3 mg/ml (1 mM)抑肽素0.7 μg/ml亮肽素0.5 μg/ml1.2 方法1.2.1组织蛋白提取方法1.3.1.2.1.1 三氯醋酸/丙酮沉淀法[1](1)冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步；(2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织；(3)将粉末悬浮于含DTT (0.2% w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中；(4)蛋白–20℃沉淀过夜；(5)35 000×g (6℃) 离心30 min；(6)将沉淀重悬于含0.2% DTT的预冷丙酮中；(7)-20℃放置1 h；(8)35 000×g (6℃) 离心30 min；(9)在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀；(10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100 mg 组织需要1 ml裂解液）；(11)15℃, 40 000×g，离心1hr；(12)用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75℃保存。
1.2.1.2 超速离心法(1)取材；(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1 g样品加入0.5 ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30 s；(3)组织悬液15℃，10 000×g离心10 min；(4)上清液4℃，150 000×g超速离心45 min；(5)小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃40,000g再次离心50min；(6)取离心上清。
Bradford法定量，分装后置–75℃保存。
1.2.2 培养细胞蛋白提取1.2.2.1循环冻融法(1)吸出培养液弃去，0.01 mol/L PBS洗一次；(2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10 ml离心管中；(3)500×g，离心5 min；(4)弃上清，PBS洗三次（室温,500× g，5 min），(5)在离心管中加入1ml PBS，重悬细胞，用1 ml 微量加液器移入Eppendorf管中；(6)执行Biofuge存储程序8，500×g 5 min离心；(7)用200 μl微量加液器吸出PBS，弃去；(8)吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3 s，室温融化)，DTT在第一次冻融后加入；(9)执行Biofuge存储程序6，15℃，40 000×g，离心1hr (Biofuge)；(10)上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。
1.2.2.2 超声破碎法(1)取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去，0.01 mol/L PBS洗一次；(2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10 ml离心管中；(3)室温，500× g，离心5 min；(4)弃上清，PBS洗3次（室温,500× g，5 min）；(5)在离心管中加入1ml PBS，重悬细胞，用1 ml 微量加液器移入Eppendorf管中，500× g离心5 min；(6)吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀，移入1.5ml Eppendorf管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞（3×10 s）；(7)15℃, 40 000×g，离心1hr (Biofuge)；(8)上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。
2 结果和讨论蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。
我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法；破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。
循环冻融法操作简便，比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。
使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。
因为产生泡沫会导致蛋白质变性，同时要注意散热。
匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。
由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法；由于神经组织比较柔软，液氮研磨法也很适合，本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织，中枢神经组织由于富含脂类，沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。
高速离心的缺点是需要样品量大，如Beckman L7- 65超速离心机的离心管容量为8 ml，不适用小量样品的制备。
在众多的裂解液配方中，我们主要采用9 M 尿素, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% 两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。
针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用，高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度，尿素就容易析出，影响蛋白的溶解)，过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度，同时有利于等待聚焦。
早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解，但是由于盐离子的引入，导致IEF电压过低，影响聚焦。
为了防止蛋白的酶解，我们使用了一种广谱的蛋白酶抑制剂混合物，成分见本实验1.1.4。
第二部分第一向等电聚焦(IEF)等电聚焦（isoelectrofocusing, IEF）是60年代建立起来的蛋白质电泳分离技术，无论是载体两性电解质，还是固相pH梯度技术，其基本原理都是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定、连续和线性的pH梯度中进行分离和分析。
1. 材料与方法1.1 仪器设备仪器设备生产商IPGphor™等电聚焦仪IPG凝胶条槽Immobiline DryStrip 3-10L, 3-10NL DryStrip覆盖液Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech1.2 试剂试剂尿素CHAPSIPG缓冲液DryStrip覆盖液DTTTris溴酚蓝甘油叠氮钠IPG凝胶条槽清洁液1.3溶液配制(1) 水合储液(8 M urea, 2% CHAPS, 0.4% DTT and 0.5 % IPG buffer).成分终浓度用量尿素(FW60.06) 8 M 12 gCHAPS 2% (w/v) 0.5 g溴酚蓝痕量数粒用纯水配成25 ml溶液，1 ml分装–20℃保存以下的试剂在临用前加入IPG buffer 0.5% (v/v) 2.5 μl (500 μl)DTT 0.4% 13 μl (500 μl)(2) SDS平衡缓冲液(50 mM Tris-Cl pH 8.8, 6 M尿素, 30% 甘油, 2% SDS, 溴酚蓝, 200 ml)终浓度用量1.5 M Tris-Cl, pH 8.8 50 mM 6.7 ml尿素(FW 60.06) 6 M 72.07 g甘油(87% v/v) 30% 69 mlSDS (FW 288.38) 2% 4.0 g溴酚蓝痕量数粒加纯水至200 ml，10 ml分装–20℃保存1.4方法(1)首先清洗凝胶条槽。
