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RNA的提取及定量操作步骤主要仪器及试剂1.原则避免RNA酶污染。
2.主要仪器及试剂①紫外分光光度计（以下以Bio-Rad公司的SmartSpecTM3000分光光度计为例）。
②无菌乳胶手套（无滑石粉）、口罩、离心管（EP管）、移液器及枪头、匀浆器等。
③Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、乙醇、DEPC处理水等3.操作步骤（全程戴手套和口罩）①Trizol处理。
将细胞培养液细胞吸出后，用PBS洗两次，加入I ml Trizol，室温裂解1~2min，用移液器均匀吹下细胞并置于EP管中，上下轻柔颠倒10次，室温静置5min。
组织样品可以加入Trizol后匀浆，后续的步骤和细胞样品相同。
Trizol的用量一般1ml至少可以处理一个长满的25cm2细胞培养皿的细胞或200mg的组织。
②加1/5体积的氯仿（如1 ml Trizol加0.2ml氯仿），颠倒混匀10次，室温静置5min，4℃，12000/min，离心20min③转上层水相于新EP管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀10次，室温静置10min，4℃，12000r/min，离心15min④用真空泵或移液器小心吸取上清液，加预冷的75%乙醇（乙=0.75）（用DEPC处理水配制），4℃，12000r/min，离心10min⑤弃上清液，EP管倒扣，空气干燥5-10min。
⑥溶于10-100μDEPC处理水中。
⑦定量时将溶于DEPC处理水的RNA进行适量稀释，如50倍或100倍稀释（98μ1去离子水加2μRNA或99山去离子水加1 uI RNA，总体积100u1），用紫外分光光度计的微量石英杯定量，开机后选择RNA 定量，先用100ul去离子水做空白读数去除背景，再检测样品。
读取OD260值及OD260/OD280比值。
PCR技术详细步骤－从RNA抽提到电泳鉴定最近在做PCR，发点相关知识，大家共同学习。
RNA抽提一，准备工作1，实验器具与材料：（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml（8）15ml塑料管一个（配75％乙醇用）2，实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。
（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。
（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。
（不需要泡DEPC水）3，试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml 容量瓶中静置4小时后备用。
配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。
（2）75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。
（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）Trizol：100ml/瓶存放于4℃二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
三，抽提步骤1．匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP 管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。
操作步骤：1. 匀浆处理a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.，大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.c. 单层培养细胞.直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.d.细胞悬液:离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。
加Trizol 前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。
e.血液处理:直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。
弃上清，收集白细胞沉淀。
每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。
2. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤:4 ℃10 000rpm离心10min，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。
“从RNA提取到荧光定量PCR”的解决方案引言：RNA提取和荧光定量PCR是生物学研究和医学诊断中常用的技术手段。
RNA提取是从细胞或组织中提取RNA分子的过程，而荧光定量PCR是用于定量分析RNA或DNA分子的技术。
本文将介绍一种从RNA提取到荧光定量PCR的解决方案，并详细描述其中的步骤和技术要点。
材料和试剂准备：1.细胞或组织样品2. RNA提取试剂盒（例如，Trizol）3. RNase-Free DNase I4. Reverse Transcription Kit5. 荧光定量PCR试剂盒（例如，SYBR Green）6.PCR引物实验步骤：1.细胞或组织样品的收集和保存：a. 收集足够数量的细胞或组织样品，并立即放入RNase-free离心管中。
b.尽快冷藏或冷冻样品，以保持RNA的完整性。
2.细胞或组织样品的破碎：a. 在RNase-free实验台上，将样品离心管取出，并加入足够的裂解缓冲液（根据试剂盒的说明书），使样品完全覆盖。
b.使用离心机将样品离心，以破碎细胞或组织。
c.将破碎液转移至新鲜的离心管中。
3.RNA的提取：a.加入等体积的酚/氯仿混合液，混合均匀。
b.离心混合液，以分离上清液和有机相。
c.将上清液转移到新鲜的离心管中，加入等体积的异丙醇，混合均匀。
d.倒置离心管数次，以沉淀RNA。
e.离心样本，以沉淀RNA。
f.倒掉上清液，使用75％乙醇洗涤RNA沉淀。
4. RNase-Free DNase I的处理：a. 使用RNase-Free DNase I去除DNA污染。
将DNase I缓冲液和DNase I酶加入洗涤后的RNA样本中。
b. 在适当的温度下，孵育RNA样本和DNase I混合物。
c. 使用DNase I缓冲液和DNA Inactivation Reagent停止反应。
d.离心样本，以除去沉淀物。
5.反转录：a.准备逆转录反应混合液，包括逆转录酶、逆转录缓冲液和逆转录引物。
实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40μgRNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE 中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：35μl×0.84μg/μl=29.4μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南RNA提取是一项重要的实验技术，也是分子生物学和基因表达研究的前提之一。
RNA提取的操作步骤、注意事项和可能出现的问题是影响实验结果的关键因素。
本文将介绍RNA提取实验的操作步骤、注意事项和问题指南，以便帮助读者更好地完成RNA提取实验。
RNA提取实验操作步骤1. 样本的准备在实验开始前，需要准备好样本。
样本可以是组织、细胞、菌落等，在RNA提取中通常使用 TRIzol 或 RNeasy 等试剂进行样品裂解和提取。
样本的数量和来源需要根据实验的需要来决定。
2. 细胞裂解样品准备好之后，需要进行细胞裂解，使细胞内部的 RNA 释放出来。
裂解的方法可以是机械裂解、化学裂解或声波裂解等。
3. RNA 的提取和纯化经过细胞裂解后，需要使用 RNA 提取试剂对 RNA 进行提取和纯化。
经过提取和纯化后，可以通过检测 A260/A280 值的比例来确定 RNA 的纯度和浓度。
4. 聚合酶链式反应（PCR）检测经过 RNA 的提取和纯化之后，需要进行 PCR 检测，确定 RNA 是否已经被成功提取和纯化。
PCR 检测需要使用适当的引物和探针，并遵守相应的反应条件和分析方法。
RNA提取实验注意事项1. 样品选择选择合适的样品，保证样品的活性和稳定性。
不同类型的样品需要使用不同的RNA 提取试剂，因此需要选择适当的试剂和方法。
2. 操作规范在 RNA 提取过程中，需要保持操作规范，如穿戴实验手套和实验衣服等，避免 RNA 受到污染。
在实验过程中要注意操作细节，如注射器和离心管应保证干净和无漏，对样品的取用和储存要进行标记和记录。
3. RNA 的质量控制在 RNA 提取的过程中，需要进行质量控制，如测定 RNA 的纯度和浓度等。
在进行下一步操作之前，必须检查 RNA 的质量和质量指标，如 A260/A280 值的比例要在 1.8 ~ 2.0 之间， RNA 的完整性要保证。
