小鼠骨髓细胞染色体标本制备中的失误与对策
刘涌涛马全祥刘慧娟（新；医学院基础部河南新乡４５３…’≠；７９岛
动物骨髓细胞具有数量多且分裂旺盛的特点·可以直接利用其进行染色体标本的制备，这种方法具有方便快捷、不需体外培养和无菌操作，并且可以真实地反映完整机体所受环境影响的优点．常用于环境中致畸、致突变因素的检测和小型动物染色体的研究·在临床上也常用于白哑病、多发性骨髓瘤等恶性血液病的研究。小鼠骨髓细胞染色体制备实验也是遗传学及细胞生物学的重点实验之…。ｌ问题的提出一个优良的动物骨髓细胞染色体制片应该是：全部染色体较集中．其中各染色体分散均匀且互不重叠，染色体长度适中．能清晰地显示出着丝点位置，染色体呈玫瑰红色。该标准是正确进行核型分析韵基础－然而由于该实验的操作复杂，实际制片过程中达到这个标准并不容易。总结翩片结果中经常出现的失误有以下８种：Ａ．细胞多，中期分裂相很少．染色体形态正常；Ｂ．细胞及中期分裂相均较多．染色体过于短小－ｃ．细胞多．中期分裂相很少，染色体过于短小；Ｄ．细胞及中期分裂相均较少｝Ｅ．染色体分散不好．多重叠在一起；Ｆ．染色体分散范围过大，不集中呈圆盘状；Ｇ。染色体边缘发毛，结构不清晰ＩＨ．染色体呈蓝色．而不是易于观察的玫瑰红色。２相应的解决对策失误Ａ、Ｂ、ｃ出现的原因均与骨髓细胞有丝分裂的中期阻断有关。骨髓细胞可用于直接进行染色体标本制备的原因在于其具有旺盛分裂的能力，但是由于中期时相较整个细胞周期的对相相对极短，所以骨髓细胞的分裂若未经中期阻断的话，骨髓内正好位于分裂中期的细胞是不多的。为获得较多的中期分裂相，实验中一般采用秋水仙案于处死小鼠前４ｈ左右对小鼠进行中期阻断，原理是秋水仙素可以抑制微管的聚合从而抻制纺锤体的形成．将细胞阻断在有丝分裂中期。处于间期的细胞由于受药物的影响相对较弱，常可持续运转到分裂期，因而在药物持续存在的情况下中期细胞的数量会逐渐增加。在中期阻断时秋水仙索的传统注射用量是１．５～２ｐｇ／ｇ体重，经试验把剂量适当增加到４ｐｇ／ｇ体重，则能获得更多的中期细胞，并且染色体长度适中。在使用秋水仙素阻断时应注意必须严格保证剂量和时间，时间过短及剂量过低对收获不到足够的中期细胞，导致出现失误Ａ，时间过长及剂量过高时则会出现失误Ｂ，这是因为秋水仙索还有使染色体收缩的作用．染色体的适当收缩可使自身形态清晰，但秋水仙素作用时间过长及剂量过高则会使染色体过于缩短，不和于显带及微小结构畸变的检出。值碍注意的是为了节省阻断时间而过高加大秋水仙素用量的做法是不可取的，因为细胞周期的时间是相对恒定的，过短的阻断时间及过高秋水仙素用量不仅不会使中期分裂相数目增加，反而会使染色体过于缩短而难以辨别，导致出现失误ｃ。此外，中期分裂相的数目还与小鼠的身体状况有关．通过实验发现采用２５ｇ左右健壮雄性小鼠取得的中期分裂相数目较多，这是由于此类小鼠免疫力强ｔ骨髓细胞分裂特别旺盛所致。失误Ｄ出现的原因和实验中的多种因素均有关系。首先与骨髓细胞的收集有关．取材时材料丢失过多是造成失误Ｄ的直接原因。为了尽可能多地获得中期细胞。在取骨髓时注意尽可能靠近骨髓腔的两端剪断股骨，然后采用适合骨髓腔太小的注射器针头．插人骨髓腔内用低渗液反复冲洗到骨髓腔发白为止。造成Ｄ的第２个原因与低渗有关，低渗的作用是使细胞吸水膨胀以便在制片时破裂并利于染色体的散开。低渗的时间、温度要适中，如时间过长及温度过高则会使大量细胞提前破裂，造成制片时细胞及中期分裂相均较少；低渗时间过短或温度低碰又会导致失误Ａ，这是由于很多中期细胞由于膨胀不足在制片时不能破裂所致。要获得较多的中期分裂相，必须掌握好低渗的条件，传统低渗时采用ｏ．０７５ｍｏｌ／ＬＫｃＩ溶液，３７Ｃ保温３０ｍｉｎ，实际上采用较低浓度的Ｏ．０７ｍｏＩ，ＬＫｃｌ低渗液进行低渗处理，能使骨髓细胞膨胀得更好，染色体更分散。造成Ｄ的第３个原因和低渗后的离心、吹打过程有关，经过低渗的细胞变得膨胀易破．离心、吹打都必须小心。此时离心的转速不能太高，如转速过高则使细胞在此时破裂而丢失。一般选用１ｏｏＯｒ／ｍｉｎ离心ｌｏｍｌｎ，转速不宜超过１２００ｒ／ｍｌｎ。在离心后悬浮细胞时最好使用吸管插人渡面以下用气泡吹打的方式进行，吹打时用力要轻，防止吸管内壁上牯留细胞及用力过大使细胞破裂。实验中所用离心管及吸管等要求洁净，脏污的话会使细胞过多滞留于管壁而丢失。造成Ｄ的最后一个原因与制片时细胞悬液的浓度过稀和染色完毕后的冲洗有关。一般滴片时细胞悬液呈少许乳白色即表示细胞浓度适当。冲洗染液时水流要缓，不要直接冲洗细胞所在位置，避免把细胞或染色体从玻片上冲离。低渗和制片是控制染色体标本质量的关键步骤，其操作失误除了与失误Ｄ相关外，也涉及失误Ｅ、Ｆ。低渗过度，如低渗时间长或低渗温度高会使大量细胞提前破裂，一鳇没有破裂的细胞经制片后则易形成染色体过度分散的失误Ｆ；低渗不足，如低渗时间短或低渗温度低２００３年第３８卷第６期
小鼠骨髓细胞染色体标本的制备
【目的要求】
1.掌握小鼠细胞染色体标本制备方法。
2.计数并观察小鼠骨髓细胞分裂中期染色体的数目及特点
【基本原理】
在骨髓细胞中，有丝分裂旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到中期细胞。骨髓细胞具有高度的分裂活性，经秋水仙素或秋水酰胺处理后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。
【实验用品】
1．器材：解剖刀、剪刀、镊子、注射器、离心机、离心管、恒温水浴箱、冰冷载玻片、酒精灯、大培养皿、显微镜、纱布,标签纸，记号笔等；
2．试剂 0.1%秋水仙素溶液、Carnoy’s固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）、0.075 mol / L KCI溶液、Giemsa染液等。
3．材料：65-90天健康小鼠（生技09级72人，新华09生物技术36人，生科08级75人，生技08级70人，共253人，需购小鼠110只）
【方法与步骤】
1．前处理 取材前3～4 h，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动物种类不同而异，一般每克体重注射2～6μg，注射总量不宜超过2 ml（例如一只体重50 g的蟾蜍，若按4μg / g注射，需注射浓度为0.1％ 的秋水仙素溶液0.2 ml ）。秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。
2．取骨髓细胞 处死动物，用装有生理盐水的注射器反复冲洗出骨髓细胞，并用注射器筒轻轻吹打，使细胞团块分散，静置片刻、待大组织团块沉淀后，用吸管将骨髓细胞悬浮液移至离心管中，以1000 r / min 离心5~10 min，弃去上清液。
3．低渗 根据骨髓细胞液的多少，加0.075 mol / L的 KCI液5～6 ml，在37℃水浴箱中或室温下低渗20～30 min。低渗时间过长，易造成细胞破裂；时间过短，则染色体难以分散。
4．预固定 低渗完毕，立即加入1 ml 新配制的预冷Carnoy’s固定液，用吸管将细胞轻轻吹打均匀，进行预固定。然后以1000 r / min 离心8 min。
２００８年８月 第２７卷第８期 绵阳师范学院学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＭｉａＩｌｙａＪｌｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｍｉｔｙ Ａｕｇ．，２００８ Ｖ０１．２７ Ｎ０．８
两栖动物骨髓细胞染色体标本制备方法的改进
唐桂容，石红艳
（绵阳师范学院珍稀动物生态与系统进化研究所，四川绵阳６２１０００）
摘要：核型分析是细胞遗传学及细胞分类学等相关学科的基本研究方法，要得到高质量的染色体标本，获 得可靠的镜检结果，必须要有很好的制片方法。对骨髓细胞蒸汽固定法进行改进，得到一种制备两栖类动物染色 体标本的简便方法。在实验设备简陋，实验经费少的条件下应用该方法能够制备出质量较好的染色体标本，且成 功率高。该方法可以广泛推广到遗传学研究及实验教学中。 关键词：方法；染色体；骨髓细胞；两栖动物 中图分类号：Ｇ６４２．４２３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２－６１２ｘ（２００８）０８－００７８－０４
核型分析是细胞遗传学、染色体工程、基因定位及细胞分类学等学科的基本研究方法 Ｊ。染色体标本
的制备是核型分析最基础的工作，要制作高质量的染色体标本，获得可靠的镜检结果，必须要有很好的制
片方法。两栖类动物染色体体积大，数量少，是细胞生物学和细胞遗传学研究的重要材料 。】。有关两栖
类染色体制片方法，早期主要采用石蜡切片法和以生殖细胞为材料的水低渗压片法，然而生殖细胞受季节
的限制较大，所得的中期分裂相亦不多 。自Ｈｓｕ首次把组织培养技术应用于哺乳动物染色体的研究以
来－６ Ｊ，两栖类染色体标本的制备越来越多地采用外周血细胞及其它组织细胞培养制备法 ｌ４】。细胞培养
法有效提高了染色体组型研究的精确性，但细胞培养需要繁琐而又严格的无菌操作，费时较长，细胞培养
所需的实验条件、实验药品要求较高，在一般的实验室条件下是无法进行的，目前该方法在国内难以普及。
此外，也采用骨髓细胞一常规空气干燥法制备染色体 ’ ，这省去了细胞培养所花费的大量工作，但骨髓
５２ 生物学通报 ２００６年第４１卷第１期
动物骨髓细胞染色体标本制备失败的原因分析
黄 燕 赵小平 余 红 陈绍坤
（四川泸州医学院 物学与遗传学教研室 四川泸州 ６４６０００）
摘要 旨在对动物骨髓染色体标本制备失败的原因进行分析并提出解决的方法。在对动物骨髓染
色体标本制备中，被选取动物的健康、免疫力情况，秋水仙素的用量，低渗的温度及时间，离心速度，细 胞悬液的浓度以及摘片的技巧，染液的ｐＨ值均可影响标本的好坏。特别是秋水仙素和低渗操作对制
片效果影响最大。针对这些因素采取相应的解决方法，掌握关键步骤的操作，避免不利因素的影响．就
能取得良好的制片效果。
关键词 豚鼠 染色体标本制备 失败原因 解决方法
动物骨髓细胞染色体标本制备是医学生物学实
验课中重要的实验之一，它具有不需培养，操作方便等
优点，但由于它每个步骤要求严格，稍有疏忽，便可导
致整个实验失败，得不到满意的标本，无法进行观察
我们在长期的教学实践中，对这一实验效果不好的原
因进行了认真分析，本文就相关问题予以讨论
制备良好的实验动物骨髓染色体标本在镜下可
见骨髓细胞多，染色体染成紫红色，分散好．长度适
中，无重叠、缠绕，染色体结构清晰，这样的标木不仅
能准确地计数，还能识别相关动物染色体形态结构和
组形
图１ 制备良好的豚鼠骨髓细胞染色体标本放大倍数１０×１ＯＯ 而制备失败，标本质量不佳，通常可出现以下几
种情况：
１）骨髓细胞虽多，染色体ｒｆ１期分裂相却很少。
２）中期分裂相多，但染色体短小，形态结构不清晰
３）染色体分散不好，出现重叠、缠绕，无法计数。
４）染色体边缘发毛，结构不清晰。
５）细胞和染色体染成浅蓝色，且着色不均匀。
图２制备欠佳的豚鼠骨髓细胞染色体标本（染色体重叠，分散不好） 造成标本制备失败的原因及怎样正确操作．避免
这些问题应注意以下几个方面：
１）选材：制备良好的标本，选材十分重要。如果材
料不好，当然不可能获得有足够数量的良好染色体分
