小鼠骨髓细胞染色体标本制作与观察

小鼠骨髓细胞染色体标本制备中的失误与对策

刘涌涛马全祥刘慧娟（新；医学院基础部河南新乡４５３…’≠；７９岛

动物骨髓细胞具有数量多且分裂旺盛的特点·可以直接利用其进行染色体标本的制备，这种方法具有方便快捷、不需体外培养和无菌操作，并且可以真实地反映完整机体所受环境影响的优点．常用于环境中致畸、致突变因素的检测和小型动物染色体的研究·在临床上也常用于白哑病、多发性骨髓瘤等恶性血液病的研究。小鼠骨髓细胞染色体制备实验也是遗传学及细胞生物学的重点实验之…。ｌ问题的提出一个优良的动物骨髓细胞染色体制片应该是：全部染色体较集中．其中各染色体分散均匀且互不重叠，染色体长度适中．能清晰地显示出着丝点位置，染色体呈玫瑰红色。该标准是正确进行核型分析韵基础－然而由于该实验的操作复杂，实际制片过程中达到这个标准并不容易。总结翩片结果中经常出现的失误有以下８种：Ａ．细胞多，中期分裂相很少．染色体形态正常；Ｂ．细胞及中期分裂相均较多．染色体过于短小－ｃ．细胞多．中期分裂相很少，染色体过于短小；Ｄ．细胞及中期分裂相均较少｝Ｅ．染色体分散不好．多重叠在一起；Ｆ．染色体分散范围过大，不集中呈圆盘状；Ｇ。染色体边缘发毛，结构不清晰ＩＨ．染色体呈蓝色．而不是易于观察的玫瑰红色。２相应的解决对策失误Ａ、Ｂ、ｃ出现的原因均与骨髓细胞有丝分裂的中期阻断有关。骨髓细胞可用于直接进行染色体标本制备的原因在于其具有旺盛分裂的能力，但是由于中期时相较整个细胞周期的对相相对极短，所以骨髓细胞的分裂若未经中期阻断的话，骨髓内正好位于分裂中期的细胞是不多的。为获得较多的中期分裂相，实验中一般采用秋水仙案于处死小鼠前４ｈ左右对小鼠进行中期阻断，原理是秋水仙素可以抑制微管的聚合从而抻制纺锤体的形成．将细胞阻断在有丝分裂中期。处于间期的细胞由于受药物的影响相对较弱，常可持续运转到分裂期，因而在药物持续存在的情况下中期细胞的数量会逐渐增加。在中期阻断时秋水仙索的传统注射用量是１．５～２ｐｇ／ｇ体重，经试验把剂量适当增加到４ｐｇ／ｇ体重，则能获得更多的中期细胞，并且染色体长度适中。在使用秋水仙素阻断时应注意必须严格保证剂量和时间，时间过短及剂量过低对收获不到足够的中期细胞，导致出现失误Ａ，时间过长及剂量过高时则会出现失误Ｂ，这是因为秋水仙索还有使染色体收缩的作用．染色体的适当收缩可使自身形态清晰，但秋水仙素作用时间过长及剂量过高则会使染色体过于缩短，不和于显带及微小结构畸变的检出。值碍注意的是为了节省阻断时间而过高加大秋水仙素用量的做法是不可取的，因为细胞周期的时间是相对恒定的，过短的阻断时间及过高秋水仙素用量不仅不会使中期分裂相数目增加，反而会使染色体过于缩短而难以辨别，导致出现失误ｃ。此外，中期分裂相的数目还与小鼠的身体状况有关．通过实验发现采用２５ｇ左右健壮雄性小鼠取得的中期分裂相数目较多，这是由于此类小鼠免疫力强ｔ骨髓细胞分裂特别旺盛所致。失误Ｄ出现的原因和实验中的多种因素均有关系。首先与骨髓细胞的收集有关．取材时材料丢失过多是造成失误Ｄ的直接原因。为了尽可能多地获得中期细胞。在取骨髓时注意尽可能靠近骨髓腔的两端剪断股骨，然后采用适合骨髓腔太小的注射器针头．插人骨髓腔内用低渗液反复冲洗到骨髓腔发白为止。造成Ｄ的第２个原因与低渗有关，低渗的作用是使细胞吸水膨胀以便在制片时破裂并利于染色体的散开。低渗的时间、温度要适中，如时间过长及温度过高则会使大量细胞提前破裂，造成制片时细胞及中期分裂相均较少；低渗时间过短或温度低碰又会导致失误Ａ，这是由于很多中期细胞由于膨胀不足在制片时不能破裂所致。要获得较多的中期分裂相，必须掌握好低渗的条件，传统低渗时采用ｏ．０７５ｍｏｌ／ＬＫｃＩ溶液，３７Ｃ保温３０ｍｉｎ，实际上采用较低浓度的Ｏ．０７ｍｏＩ，ＬＫｃｌ低渗液进行低渗处理，能使骨髓细胞膨胀得更好，染色体更分散。造成Ｄ的第３个原因和低渗后的离心、吹打过程有关，经过低渗的细胞变得膨胀易破．离心、吹打都必须小心。此时离心的转速不能太高，如转速过高则使细胞在此时破裂而丢失。一般选用１ｏｏＯｒ／ｍｉｎ离心ｌｏｍｌｎ，转速不宜超过１２００ｒ／ｍｌｎ。在离心后悬浮细胞时最好使用吸管插人渡面以下用气泡吹打的方式进行，吹打时用力要轻，防止吸管内壁上牯留细胞及用力过大使细胞破裂。实验中所用离心管及吸管等要求洁净，脏污的话会使细胞过多滞留于管壁而丢失。造成Ｄ的最后一个原因与制片时细胞悬液的浓度过稀和染色完毕后的冲洗有关。一般滴片时细胞悬液呈少许乳白色即表示细胞浓度适当。冲洗染液时水流要缓，不要直接冲洗细胞所在位置，避免把细胞或染色体从玻片上冲离。低渗和制片是控制染色体标本质量的关键步骤，其操作失误除了与失误Ｄ相关外，也涉及失误Ｅ、Ｆ。低渗过度，如低渗时间长或低渗温度高会使大量细胞提前破裂，一鳇没有破裂的细胞经制片后则易形成染色体过度分散的失误Ｆ；低渗不足，如低渗时间短或低渗温度低２００３年第３８卷第６期

小鼠骨髓细胞染色体标本的制备

【目的要求】

1.掌握小鼠细胞染色体标本制备方法。

2.计数并观察小鼠骨髓细胞分裂中期染色体的数目及特点

【基本原理】

在骨髓细胞中，有丝分裂旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到中期细胞。骨髓细胞具有高度的分裂活性，经秋水仙素或秋水酰胺处理后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。

【实验用品】

1．器材：解剖刀、剪刀、镊子、注射器、离心机、离心管、恒温水浴箱、冰冷载玻片、酒精灯、大培养皿、显微镜、纱布,标签纸，记号笔等；

2．试剂 0.1%秋水仙素溶液、Carnoy’s固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）、0.075 mol / L KCI溶液、Giemsa染液等。

3．材料：65-90天健康小鼠（生技09级72人，新华09生物技术36人，生科08级75人，生技08级70人，共253人，需购小鼠110只）

【方法与步骤】

1．前处理 取材前3～4 h，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动物种类不同而异，一般每克体重注射2～6μg，注射总量不宜超过2 ml（例如一只体重50 g的蟾蜍，若按4μg / g注射，需注射浓度为0.1％ 的秋水仙素溶液0.2 ml ）。秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。

2．取骨髓细胞 处死动物，用装有生理盐水的注射器反复冲洗出骨髓细胞，并用注射器筒轻轻吹打，使细胞团块分散，静置片刻、待大组织团块沉淀后，用吸管将骨髓细胞悬浮液移至离心管中，以1000 r / min 离心5~10 min，弃去上清液。

3．低渗 根据骨髓细胞液的多少，加0.075 mol / L的 KCI液5～6 ml，在37℃水浴箱中或室温下低渗20～30 min。低渗时间过长，易造成细胞破裂；时间过短，则染色体难以分散。

4．预固定 低渗完毕，立即加入1 ml 新配制的预冷Carnoy’s固定液，用吸管将细胞轻轻吹打均匀，进行预固定。然后以1000 r / min 离心8 min。

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普通生物学实验课须知

1.新生进实验室之前要认真阅读实验室基本知识。

2.每次进入实验室的时间为以课表为准，提前10分钟进入实验室。

3.应严格按照实验平台上预约时间进入实验室进行实验，不来者，视为旷课。如因特殊情况请假，需在实验开始前至少三天向指导教师说明，在选课平台系统中取消原预约时间，重新预约，一次不做实验或一次不交报告，即按不及格论处。

4.预习实验内容和有关知识，写好预习报告（手写）,前四部分内容（一、实验目的，二、实验原理，三、实验器材与试剂，四、实验步骤与操作方法），无预习报告者扣10分。

5. 实验过程中应认真操作，仔细观察实验现象，做好原始记录(三个实验需要用相机或手机拍照，DNA指纹图谱实验需用U盘拷贝实验结果，请自备拍照工具和U盘)。

6. 预习、课堂操作、课堂纪律、善后处理、实验报告是评分的依据。

7. 实验完毕，要将自己使用的仪器刷洗干净，药品按序恢复原位，台面擦净，把自己做实验的一套东西找齐，经指导老师检查合格并签字后方可离开。

8. 值日生要认真清扫地面、水槽、台面，检查水、电、门窗是否关好。

9. 实验讲义：实验预约系统中可以下载，也可到生命科学与技术学院网站下载。

10. 实验报告模板见附件，需注明姓名、学号、组号、做实验具体时间。

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植物细胞染色体标本的制作与观察

上课地点：化学楼120 上课时间：选课时

任课教师：陈丽杰 办公地点：生化楼215 电话：84706308

课程要求：

预习实验内容，掌握实验目的及原理、仪器和试剂、实验步骤；

手写完成预习报告（实验名称、实验目的、实验原理、实验器材与试剂、实验方法与步骤），课堂检查预习报告情况。

实验注意事项：

1、实验台上物品按实验室管理老师要求摆放整齐；

2、实验废物按实验室管理老师要求收集；

3、实验结束后，经老师检查后方可离开。

实验纪律：

Isolation and staining of mouse meiotic metaphase chromosomes

小鼠睾丸生殖细胞标本制作及减数分裂期染色体观察

xx 2011级生科四班 201100140120 同组者：xx

【实验目的】

1、learn to isolate mouse testes cells and stain with Giemsa.

学会分离小鼠睾丸细胞并用Giemsa染液染色

2、Observe the number and morphology of mouse chromosomes

观察小鼠染色体的数目及形态特征

【实验材料】

【Reagents】

秋水仙素 colchicine solution

吉姆萨染液 Giemsa stains solution

生理盐水 physiological saline

氯化钾溶液 KCl solution

固定液 fixation solution

【Tools and equipments】

Dissecting tray，beaker，centrifuge tube，microscope，glass slide，pipette，scissors，forceps，copper mesh.

解剖盘，烧杯，离心管，显微镜，载玻片，吸管，剪刀，镊子，铜网

【实验原理】

meiosis is a process of reductional division in which the number of

chromosomes per cell is cut in half. In animals, meiosis always results in the formation of gametes, while in other organisms it can give rise to spores.

减数分裂是细胞分裂染色体数减半的过程，在动物中,减数分裂的结果总是在形成配子,而在其他生物可以产生孢子。