抗铜绿假单胞菌PcrV蛋白单克隆抗体的筛选和功能验证

铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达【摘要】目的克隆铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体，为进一步研究这七种含Pilz结构域蛋白是否为第二信使c-di-GMP 潜在的受体分子奠定实验基础。

方法提取铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA, 用PCR方法从中扩增出七种功能未知的含Pilz 结构域蛋白基因, 将其克隆到原核表达载体pET32a中, 在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。

结果成功扩增出七种含Pilz 结构域蛋白基因并构建其原核表达载体, 测序结果与NCBI数据库收录序列相一致。

SDS-PAGE检验证明目的基因在大肠杆菌BL21中获得高效表达。

结论从铜绿假单胞菌基因组中成功地克隆了七种含Pilz 结构域蛋白基因，其构建的原核表达载体在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。

【关键词】铜绿假单胞菌;c-di-GMP第二信使;Pilz结构域蛋白;基因克隆;原核表达载体构建铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa ), 又称绿脓杆菌, 是临床感染性疾病中常见的条件致病菌之一。

该菌致病机制复杂而多样, 其固有的对抗生素和消毒剂的耐受性使治疗十分困难。

铜绿假单胞菌全基因组测序的完成[1], 特别是近几年环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)对细菌生物学功能调控作用的突破性研究进展, 使得我们在分子水平上深入探讨其耐药机理, 在信号途径的研究中寻找新的作用靶点成为了可能。

作为一种广泛存在于细菌中的新型的第二信使, c-di-GMP 参与调控了多种细菌生物学功能，如细菌的运动性、生物膜合成、细菌毒性及细菌的群体感应等[2]，但其作用机制尚不完全清楚。

铜绿假单胞菌全基因组共有5,670个基因, 利用生物信息学手段，在其全基因组中发现了八种编码Pilz结构域(Pfam07238)蛋白基因。

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH基因扩增、融合、克隆及原核表达张万山;陈燕;曹郁生【期刊名称】《南昌大学学报（医学版）》【年(卷),期】2004(044)002【摘要】目的在大肠杆菌中串联表达铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OPrH,获得重组融合蛋白OprF/H,为抗铜绿假单胞菌的疫苗研究打下基础.方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,设计PCR引物扩增出OprF和OprH基因,扩增片段经过酶切、连接和PCR扩增后,割胶回收PCR产物并将其克隆至克隆质粒,测序后构建表达质粒pGEX-F/H,并转化大肠杆菌BL2l.结果重组表达质粒经IPTG诱导后表达融合外膜蛋白OprF/H.结论成功构建融合外膜蛋白OprF/H的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达成功.【总页数】5页(P5-9)【作者】张万山;陈燕;曹郁生【作者单位】江西医学院第一附属医院烧伤中心,江西,南昌,330006;中德联合研究院教育部食品科学重点实验室,江西,南昌,330047;中德联合研究院教育部食品科学重点实验室,江西,南昌,330047【正文语种】中文【中图分类】R378.99+1【相关文献】1.铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达 [J], 罗晓庆;孙济宇;王慧;王晓波;王琪;蒋瑞雪2.重组绿脓杆菌外膜蛋白OprF的表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定 [J], 陈春琳;刘祥;俱雄3.铜绿假单胞菌OprF/I融合蛋白疫苗研制现状 [J], 梁诚诚;李文桂4.铜绿假单胞菌F190—342-I21—83基因的克隆及其融合蛋白的原核表达 [J], 张明亮;闫新武;孙长江;顾敬敏;崔子寅;韩文瑜5.重组铜绿假单胞菌外膜蛋白D的原核表达与多克隆抗体制备研究 [J], 伍娜娜;荣娜;康超;刘祥;陈琛;陈春琳;马心怡;吴三桥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

论 著（基础研究）重组铜绿假单胞菌外毒素Ａ和ｐｃｒＶ基因质粒的构建及真核表达姜明子，冯旰珠 ［摘要］　目的　外毒素Ａ（ｔｏｘＡ基因编码）是铜绿假单胞菌毒力最强的因子之一，ＰｃｒＶ（ｐｃｒＶ基因编码）是铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统的关键调控因子之一。

文中旨在构建重组ｔｏｘＡ和ｐｃｒＶ基因的铜绿假单胞菌核酸疫苗，并在ＨＥＫ－２９３细胞中表达目的蛋白。

　方法　ＰＣＲ法从铜绿假单胞菌基因组基因中扩增出ｔｏｘＡ和ｐｃｒＶ基因，点突变法对ｔｏｘＡ基因进行减毒优化，随后将突变的ｔｏｘＡｍ基因和ｐｃｒＶ基因分别插入ｐＩＲＥＳ真核表达质粒的２个多克隆位点，构建真核双表达重组质粒ｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶ。

脂质体法将ｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶ瞬时转染入ＨＥＫ－２９３细胞，通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｔｏｘＡｍ及ｐｃｒＶ在真核细胞中的表达。

　结果　构建的真核表达质粒ｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶ，经脂质体转染ＨＥＫ－２９３细胞后，在其细胞内检测到目的蛋白的表达。

　结论　成功构建ｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶ表达载体并在转染的真核细胞中得以有效的表达，为研究铜绿假单胞菌预防性疫苗奠定了实验基础。

［关键词］　铜绿假单胞菌；外毒素Ａ；核酸疫苗；ｐｃｒＶ基因 ［中图分类号］　Ｒ５６３ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１００８－８１９９（２０１４）０７－０６９４－０４基金项目：江苏省卫生厅面上项目（Ｈ２００９１１）作者单位：２１００１１南京，南京医科大学第二附属医院呼吸内科［姜明子（医学硕士研究生）、冯旰珠］通讯作者：冯旰珠，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｅｎｇｇｚ＠ｎｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｅｎｃｏｄｉｎｇＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｔｏｘＡａｎｄｔｙｐｅⅢｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｐｃｒＶＪＩＡＮＧＭｉｎｇ－ｚｉ，ＦＥＮＧＧａｎ－ｚｈｕ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１１，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＥｘｏｔｏｘｉｎＡ（ｅｎｃｏｄｅｄｂｙｇｅｎｅｔｏｘＡ），ｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｔｏｘｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉ－ｎｏｓａ（Ｐ．ａ．），ａｎｄＰｃｒＶ（ｅｎｃｏｄｅｄｂｙｇｅｎｅｐｃｒＶ），ｋｅｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔｔｏｔｙｐｅⅢｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆＰ．ａ．，ｂｏｔｈｍａｔｔｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｔｏｔｈｅｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＰ．ａ．ＴｈｅａｒｔｉｃｌｅｗａｓｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｏｖｅｌＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇａｍｕｔａｔｅｄｔｏｘＡｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｐｃｒＶｇｅｎｅｏｆＰ．ａ．ａｎｄｉ－ｄｅｎｔｉｆｙｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅｇｅｎｅｓｏｆｔｏｘＡａｎｄｐｃｒＶｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ，ａｎｄｔｈｅｔｏｘＡｇｅｎｅｗａｓｍｕｔａｔｅｄｔｏｒｅｄｕｃｅｔｈｅｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆＥｘｏｔｏｘｉｎＡ．ＴｈｅｎｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｔｏｘＡｍａｎｄｐｃｒＶｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｐＩＲＥＳｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶ．ＴｈｅｎｏｖｅｌｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＨＥＫ－２９３ｃｅｌｌｓｂｙｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｔｏｘＡｍａｎｄｐｃｒＶｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｄｅｍｏｎ－ｓｔｒａｔｅｄｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｅｎｃｏｄｉｎｇＥｘｏｔｏｘｉｎＡａｎｄＰｃｒＶ．ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｅｘｈｉｂｉｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｎｃｏｄｅｄｔｏｘＡａｎｄｐｃｒＶｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙＨＥＫ２９３ｃｅｌｌｓ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＩＲＥＳ－ｔｏｘＡｍ－ｐｃｒＶｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉ－ｃａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｔｏｘＡｍａｎｄｐｃｒＶｉｎＨＥＫ－２９３ｃｅｌｌｓ．ＩｔｍａｙｂｅｕｓｅｄａｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｃａｎｄｉｄａｔｅｏｆｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｏｆＰｓｅｕｄｏ－ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；ＥｘｏｔｏｘｉｎＡ；ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅ；ＰｃｒＶ０　引 言 铜绿假单胞菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，ＰＡ）是常见的条件致病菌，在各种医院感染中居于前位，也是慢性阻塞性肺疾病及气管扩张症反复感染者的常见的致病菌。

• 158 •国际流行病学传染病学杂志2021年4月第48卷第2期Inter J Epidemiol Infect Dis，April 2021，Vol. 48，N〇.2铜绿假单胞菌P c rV疫苗的研制现状李文桂陈雅裳重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所400016通信作者：李文桂，E m a i l:c q liw e n g u i@163.c o m•综述•【摘要】铜绿假单胞菌是一种院内感染的常见致病菌，采用疫苗防治该菌是当前研究的热点领域之一。

PcrV蛋白作为一种转运蛋白，是重要的免疫调控靶点，可作为一种有效的疫苗候选分子。

本文综述了PcrV蛋白、PcrV抗体、核酸疫苗以及重组鼠伤寒沙门菌疫苗等的研究现状，为新型疫苗研发提供参考。

【关键词】假单胞菌，铜绿;PcrV蛋白；疫苗；转运蛋白；抗体基金项目：国家自然科学基金（30801052、30671835、30500423、30200239)D0I ： 10.3760/331340-20200623-00205Recent advances in PcrV vaccine against Pseudomonas aeruginosaLi Wengui, Chen YalongInstitute o f Infectious and Parasitic Diseases^ the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing400016, ChinaCorresponding author \ Li Wengui, Email ：******************【Abstract】Pseudomonas aeruginosa is one type of pathogens causing nosocomial infections. It recentlybecomes highlight to control this bacterium by the application of related vaccine. PcrV protein, as a transport protein,is an important target for immune regulation and an effective candidate molecule of vaccine. The review outlines theresearch of PcrV protein, PcrV antibody, nucleic acid vaccine, and recombinant Salmonella typhimurium vaccine, inorder to provide references for the development of novel vaccine.【Key words】aenxgifwwa; PcrV protein; Vaccine; Transport protein; AntibodyFund program：National Natural Science Foundation of China(30801052, 30671835, 30500423, 30200239)DOI ： 10.3760/331340-20200623-00205铜绿假单胞菌是一种常见的机会致病菌'I D型分泌系 统(T3SS)是其主要致病因子，可协助其逃避巨噬细胞的吞噬和降解|21。

铜绿假单胞菌外膜耐药和保护原功能蛋白组学的研
究的开题报告
题目：铜绿假单胞菌外膜耐药和保护原功能蛋白组学的研究
研究背景及意义：
铜绿假单胞菌是一种常见的病原菌，具有很强的耐药性，对于临床治疗带来了很大的挑战。

其外膜是维持细胞形态结构、保护内部细胞壁和细胞膜的重要部位，同时还是细胞与外界环境物质交换的重要通道。

外膜上的蛋白质是其功能的关键部位，因此对铜绿假单胞菌外膜蛋白质组学的研究有助于深入了解其对于药物耐药性和原功能的影响。

研究内容和方法：
本研究将利用质谱分析技术对铜绿假单胞菌外膜蛋白质组进行全面的分析，进而筛选耐药相关蛋白及其保护原功能的蛋白。

从而通过建立耐药性相关蛋白与保护功能蛋白的相关性，探究其在铜绿假单胞菌外膜上的相互作用机制，从而揭示其耐药机制，为新药的研发提供指导。

研究预期结果与意义：
本研究将可以全面了解铜绿假单胞菌外膜的蛋白质组学，并从中发掘出耐药相关蛋白及其保护原功能蛋白。

这将有助于探究铜绿假单胞菌的耐药机制，为疾病的治疗和新药的研发提供理论基础。

同时，本研究还有助于深入了解细菌外膜的功能和机制，为细菌学研究提供重要的参考。

旦堕竖堕塑查！！！！至簦！！鲞箜！塑！坐！垦！！丛！：垒Ｐ！：！！！！：∑！！：！！！型！：！铜绿假单胞菌耐药相关蛋白的研究进展蔡双启陈一强【摘要】铜绿假单胞菌（Ｒｇ“ｄＤｍｏ”ｎｓｎｅｒ“ｇ抽ｏｓ。

，ＰＡ）是医院感染及免疫缺陷者感染的常见致病菌。

ＰＡ基因测序工作的完成，为研究其耐药相关蛋白奠定了基础。

近年来由于各种抗菌药物的广泛应用甚至滥用，ＰＡ对抗生素耐药日趋严重。

本文就ＰＡ对抗生素耐药相关蛋白质的研究作一综述，详细介绍ＰＡ主动外排系统相关蛋白、外膜微孔蛋白、青霉素结合蛋白、生物膜相关蛋白以及其他一些蛋白导致ＰＡ对抗生素耐药的相关机制。

【关键词】铜绿假单胞菌；耐药相关蛋白；研究进展Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎａｎｔｉｂｉｏｔｊｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆＰｓＰ口ｄｏ，拜Ｄ露口ｓｎＰｒＨｇｆ咒ｏｓ口（、ＡｊＳ＾“Ⅱ村ｇ—ｇｉ，ＣＨＥＮｙｉ—ｑｉ口行ｇ．ＤＰ户口以，聍Ｐ雄ｆｏ，ＲＰｓ户ｉ，硷ｆＤｒｙＭＰｄｉｆｉ行Ｐ，历已Ｆｉｒ时Ａ，，ｉＺｉ口ｆＰｄＨ０５声ｉｆ口￡Ｄ，Ｇ“口行ｇｚｉＭＰｄｉｃｎｆＵ，２ｉ口Ｐｒｓ打ｙ。

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铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶的克隆表达与功能鉴定的开题报告一、研究背景噬菌体是一种感染细菌的病毒，可以用来对抗一些耐药性细菌的感染。

噬菌体通过其特异性的受体与宿主细胞表面互相吸附，然后将其遗传物质注入细胞内部，利用宿主细胞的生物合成机制复制自身，并最终导致宿主细胞破裂释放新的噬菌体。

其中，噬菌体末端酶（Endolysin）是一种能够降解细菌细胞壁的酶，是噬菌体的重要成分之一。

末端酶可以在噬菌体释放前部分地降解细菌细胞壁，从而使噬菌体释放更容易。

同时，末端酶也可以在噬菌体释放后迅速降解宿主细胞壁，释放更多的噬菌体，加速细胞的破裂。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种可以感染人类的细菌，尤其在免疫力低下的患者中容易引起感染。

由于其常常具有多重耐药性，传统药物治疗效果有限。

因此，利用噬菌体进行治疗成为一种新兴的治疗手段。

本项目的研究目的是克隆和表达铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的末端酶，并从分子水平上探究其降解细菌细胞壁的功能特点。

二、研究内容和方法1.克隆铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的末端酶基因从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA，利用PCR扩增末端酶基因，并将其插入到表达载体中。

最终，利用DNA测序验证插入正确。

2.表达末端酶将重组表达载体转化到大肠杆菌中，利用蛋白质表达系统进行表达。

3.纯化蛋白利用GST标签纯化GE柱对重组末端酶进行纯化和富集。

4.酶活性测定利用酶标仪测定样品的吸光度值，从而确定蛋白的酶活性，评估其降解细菌细胞壁的能力。

三、研究意义和创新性本项目的研究对于探究铜绿假单胞菌的噬菌体末端酶的功能特点具有重要意义，并可以为噬菌体在临床应用上的推广提供参考。

同时，通过克隆和表达铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的末端酶，也有助于解析其他细菌噬菌体末端酶的同源性和结构功能关系，具有一定的创新性。

铜绿假单胞菌外膜蛋白Ⅰ的原核表达、纯化及免疫保护作用研究陈春琳;刘祥;王成祥;张晓娟;俱雄;张涛;吴三桥【摘要】铜绿假单胞菌外膜蛋白OprⅠ具有较强的免疫原性,在疫苗上具有开发前景.利用分子方法获得OprⅠ蛋白的表达菌株.Western blotting验证表明抗体能与OprⅠ蛋白特异性结合.SDS-PAGE电泳切胶纯化获得OprⅠ蛋白.将OprⅠ蛋白免疫小鼠并攻毒铜绿假单胞菌,发现OprⅠ蛋白激活的特异性免疫对小鼠铜绿假单胞菌感染的保护率达到57.14％,与对照组相比较达到显著性.采用正交试验设计,获得OprⅠ菌株最佳诱导表达条件为:加IPTG菌夜OD600值0.8,加IPTG终浓度0.3 mmol/L,诱导时间8h,诱导温度28℃;菌株最佳培养条件为转速230 r/min,葡萄糖浓度0％,装液量50 mL.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(031)007【总页数】7页(P207-213)【关键词】铜绿假单胞菌;OprⅠ蛋白;免疫保护;正交试验;诱导条件【作者】陈春琳;刘祥;王成祥;张晓娟;俱雄;张涛;吴三桥【作者单位】陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001;陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001;安徽省肥西县特殊教育学校,合肥231200;陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001;陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001;陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001;陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001【正文语种】中文铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），又名绿脓杆菌，是医院感染最常见的条件致病菌之一，常分布于人与动物皮肤和肠道上；在机体烧伤、免疫力下降、重大疾病创伤后，容易诱发感染，甚至导致感染性休克［1，2］。

由于抗生素的大量使用，铜绿假单胞菌出现不同程度的耐药性，增加了治疗的难度，人们一直在寻找一种不产生耐药性的防治药物［3，4］。

doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2018.02.015㊃免疫学技术与方法㊃抗铜绿假单胞菌PcrV 蛋白单克隆抗体的筛选和功能验证①管章春　刘方杰②　刘成华②　高亚萍②　沈倍奋②　杨　光②　(广西医科大学,南宁530000) 中图分类号　R392.1 文献标志码　A 文章编号　1000⁃484X (2018)02⁃0233⁃06①本文受国家自然科学基金资助(31170074)㊂②军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室,北京100850㊂作者简介:管章春,女,在读硕士,主要从事免疫学方面的研究,E⁃mail:guanzhangchun@㊂通讯作者及指导教师:杨　光,男,博士,研究员,博士生导师,主要从事感染与免疫方面的研究,E⁃mail:yangg g@㊂[摘　要]　目的:获得能应用于治疗铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染的抗PcrV 蛋白全人源单克隆抗体㊂方法:以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板,PCR 扩增PcrV 基因并构建重组表达载体pET⁃28a⁃PcrV,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG 诱导表达,并通过镍离子螯合树脂亲和纯化PcrV 蛋白㊂利用噬菌体抗体库筛选PcrV 结合的噬菌体克隆并进行序列测定,以测序正确的阳性克隆质粒为模板,PCR 扩增该抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因并构建重组表达载体转染至293E 细胞,收取培养细胞上清,并利用Protein A 树脂亲和纯化抗体㊂利用ELISA 实验检测抗体亲和力,并通过小鼠铜绿假单胞菌感染肺炎模型验证抗体活性㊂结果:获得重组蛋白PcrV,通过噬菌体展示技术筛选并制备了一株全人源抗PcrV 单克隆抗体YG5㊂ELISA 实验结果表明YG5抗体具有较高的亲和力(EC 50=61ng /ml),进一步的实验结果表明,YG5能有效抵抗铜绿假单胞菌感染,降低小鼠的死亡率㊂结论:靶向铜绿假单胞菌PcrV 蛋白的全人源单克隆抗体YG5能够有效地抑制铜绿假单胞菌致病性,降低其对机体感染,有可能成为抗铜绿假单胞菌感染的治疗性抗体㊂[关键词]　铜绿假单胞菌;PcrV 蛋白;单克隆抗体;急性肺炎模型Screening and activity verification of monoclonal antibody against PcrV protein of pseudomonas aeruginosaGUAN Zhang⁃Chun ,LIU Fang⁃Jie ,LIU Cheng⁃Hua ,GAO Ya⁃Ping ,SHEN Bei⁃Fen ,YANG Guang .Guangxi Medical University ,Nanning 530000,China[Abstract ]　Objective :To obtain a high specificity and high affinity anti⁃PcrV protein monoclonal antibody which can be usedfor the treatment of Pseudomonas aeruginosa infected.Methods :The PcrV gene was amplified by PCR using P.aeruginosa PAO1genome DNA as the template.The expression vector(pET⁃28a⁃PcrV)was constructed and transformed into E.coli BL21(DE3).The re⁃combinant PcrV protein was expressed by IPTG induction and purified by Ni 2+affinity chromatography.The specific binders of PcrV were screened by phage display.The genes encoding VH and VL were amplified respectively by PCR using the plasmid of positive clone as the template.Then the recombinant expression vectors were constructed and transfected into 293E cells.Monoclonal antibody were purified by the Protein A affinity resin from the culture supernatants.The affinity of antibody was detected by ELISA and the function of YG5was verified in murine pneumonia model caused by P.aeruginosa.Results :Recombinant PcrV protein was expressed and purified.A full human monoclonal antibody(named as YG5)against PcrV was obtained by phage display.The results of ELISA showed that YG5had a high affinity with EC 50=61ng /ml.Furthermore,it was found that YG5could protect mice from infection caused by P.aeruginosa.Conclusion :Our findings present a novel human monoclonal antibody YG5against PcrV,which inhibits the infectioncasued by P.aeruginosa and may be a potential drug for treatment of P.aeruginosa infection.[Key words ]　Pseudomonas aeruginosa;Protein PcrV;Monoclonal antibody;Acute pneumonia model 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)又称绿脓杆菌,是自然界广泛存在的革兰氏阴性致病菌,也是院内感染最主要的病原体之一㊂其能引起各类急慢性感染,是囊性纤维化患者致死的重要原因㊂另外,PA 常常在机械性气道损伤㊁免疫抑制或患有艾滋病㊁肿瘤的患者体内引发急性肺炎[1⁃5]㊂目前临床上主要采用抗生素治疗PA 引起的各种感染㊂然而随着抗生素的广泛使用,PA 耐药菌株被分离的报道不断增加[6],开发基于针对PA 感染新的抗感染策略极为重要㊂抗体药物可以通过中和毒素㊁吞噬调理作用等消除病原体,并且抗体具有特异性高㊁副作用小等优点,在抗感染领域受到越来越多的关注㊂PA的致病机制包括细菌表面的毒力因子和细菌的外分泌毒素㊂其分泌毒素主要是经Ⅰ㊁Ⅱ㊁Ⅲ型分泌系统分泌[7]㊂PcrV蛋白为Ⅲ型分泌系统的转运体蛋白,通过将细菌产生的毒力蛋白分子直接输送到宿主细胞内,干扰宿主细胞的正常功能,引发宿主细胞的死亡㊂基因突变研究证实,PcrV缺失后,细菌Ⅲ型分泌系统不能与宿主细胞膜结合,从而不能够损伤宿主细胞[8,9]㊂目前,PcrV已经成为新的抗铜绿假单胞菌感染的药物研发靶点㊂本研究从PA菌株PAO1基因组中调取PcrV基因,并构建其重组表达载体,成功获得了PcrV蛋白㊂利用噬菌体抗体库技术筛选出抗PcrV蛋白的全人源单克隆抗体YG5,小鼠肺炎模型的实验结果表明YG5能够明显抑制PA对机体的感染,具有很好的保护作用㊂1　材料与方法1.1　材料1.1.1　实验材料　PA菌株PAO1(中国科学院上海药物研究所蓝乐夫教授赠送),原核表达载体pET⁃28a㊁全人源naive Fab抗体库㊁M13KO7(本室保存);无特定病原体级BALB/c纯系雌性小鼠,鼠龄8周(购自北京维通利华实验动物技术有限公司);感受态细胞DH5α和BL21(DE3)㊁HiFiTaq聚合酶㊁dNTP(北京康润诚业生物技术公司);限制性内切酶NheⅠ和EcoRⅠ(TaKaRa公司);质粒提取试剂盒㊁胶回收试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司];细菌基因组DNA提取试剂盒㊁T4DNA连接酶㊁Trans2K DNA标志物㊁低分子量蛋白标准(北京全式金生物科技公司);anti⁃M13抗体(北京义翘神州生物技术有限公司);PEG8000(Sigma);其他试剂为国产分析纯㊂1.1.2　PCR引物设计　引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,PcrV正向引物5′⁃GAC⁃TGCTAGCATGGAAGTCAGAAACCTTAATG⁃3′反向引物5′⁃AGTCGAATTCCTAGATCGCGCTGAGAATGTC⁃GCG⁃3′,下划线部分为酶切位点㊂1.2　实验方法1.2.1　pET⁃28a⁃PcrV重组质粒的构建　以PAO1菌株基因组为模板,利用PcrV基因特异性上下游引物进行PCR扩增,PCR条件如下:94℃㊁5min; 94℃㊁30s;55℃㊁30s;72℃㊁90s;30个循环,72℃, 10min;扩增片段大小为885bp㊂将PCR扩增得到的PcrV基因片段,利用限制性内切酶NheⅠ和EcoRⅠ酶切,回收目的片段亚克隆至pET⁃28a载体,转化连接产物至BL21(DE3)感受态细胞中,经菌落PCR和提取质粒酶切鉴定获得阳性克隆,并进一步送交测序鉴定㊂1.2.2　PcrV蛋白在大肠杆菌中诱导表达及纯化　使用LB(Kana+)培养基过夜培养测序正确阳性单克隆菌落,次日按照1∶100转接至新鲜LB(Kana+)培养基中,37℃扩大培养至OD600约为0.7,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L,继续室温培养6h后,4℃,8000r/min离心15min收集菌体㊂使用结合缓冲液(20mmol/L Na3PO4,0.5mol/L NaCl, 20mmol/L咪唑,pH7.4)重悬菌体,超声破碎(每次10s,间隔10s,共30min)后,4℃,12000r/min离心15min分别收集沉淀和上清,通过SDS⁃PAGE电泳检测后将超声所获上清与Ni2+螯和树脂孵育,利用含20mmol/L咪唑的洗涤液洗涤Ni2+柱,最后用含500mmol/L咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白,利用BCA法定量所获目的蛋白浓度并利用SDS⁃PAGE 检测其纯度㊂1.2.3　噬菌体抗体库的制备　取30μl naive Fab 抗体库甘油菌接种到50ml的2YTAG培养基中,初始细胞密度OD600=0.1左右㊂37℃㊁220r/min,培养至OD600=0.6~0.8之间㊂向50ml培养液中加入100μl的M13KO7,37℃静置30min㊂4000r/min, 25℃,离心15min㊂弃上清,将沉淀重悬至250ml 2YTAK培养基中,28℃培养过夜㊂将过夜菌7000 r/min,4℃,离心15min;上清转入新的离心管中,并加入1/4体积的PEG/NaCl沉淀噬菌体,冰浴1h㊂7000r/min,4℃,离心15min,弃上清㊂噬菌体沉淀重悬于20ml PBS中㊂10000r/min,4℃,再次离心15min,除去残留的细胞碎片㊂上清移入新的50ml 离心管中,加入1/4体积的上述PEG/NaCl溶液,冰浴20min㊂7000r/min,4℃,离心15min,弃上清㊂噬菌体沉淀重悬于5ml含20%甘油的PBS中,即得到纯净的噬菌体悬液㊂取10μl噬菌体悬液重新感染对数生长期的TG1进行滴度测定㊂1.2.4　噬菌体抗体库的亲和淘选　用无菌PBS稀释抗原PcrV至终浓度为10μg/ml,吸取500μl溶液包被免疫管,4℃过夜㊂同时设置只包被PBS的阴性对照㊂无菌PBS洗涤免疫管3次,之后用4%的脱脂奶粉/PBST室温封闭1h㊂同时用4%的脱脂奶粉封闭噬菌体抗体库,室温1h㊂无菌PBS洗涤免疫管3次,将封闭好的抗体库加入到免疫管中,每管500μl,噬菌体的投入量约为1.2×1012,室温静置1h㊂PBST洗涤15次,PBS洗涤15次,3min/次㊂每管加入500μl Glycine⁃HCl(0.1mol/L,pH2.2)洗脱噬菌体,室温放置10min㊂倒出洗脱液,迅速用1.5mol/L的Tris⁃HCL(pH8.8)中和至pH7.4㊂将500μl的上述洗脱液感染10ml对数生长期的TG1菌液,37℃静置30min㊂取200μl㊁100μl等不同体积的菌液分别涂布于2YTAG固体平板上,用于计算产量和挑取单克隆㊂剩下的菌液4000r/min,离心15min后,弃去上清,将菌体涂布于2YTAG固体平板上,37℃培养过夜,为第二轮筛选做准备㊂观察克隆生长情况,统计克隆数㊂将菌落从2YTAG平板上刮下,重悬于含20%甘油的2YTAG培养基中,冻存于-70℃㊂按如上步骤进行第二轮和第三轮亲和淘选㊂1.2.5　ELISA实验筛选阳性克隆　挑取经过三轮筛选后获得的单克隆菌落,接种于1ml2YTAG培养基中(采用96孔深孔板),37℃,220r/min培养过夜㊂分别吸取30μl的过夜菌接种于900μl的2YTAG培养基中,37℃,220r/min,培养至OD600= 0.6~0.8,每孔加入5×1010的辅助噬菌体M13KO7, 37℃静止感染30min㊂1800r/min,4℃离心15min,弃去上清,用1ml2YTAK重悬沉淀,28℃, 220r/min培养过夜㊂收取噬菌体上清,利用ELISA 实验鉴定阳性克隆,并将阳性克隆送交测序㊂1.2.6　pIgH和pIgL重组质粒的构建　以测序正确的阳性克隆质粒为模板,利用抗体重链和轻链特异性上下游引物进行PCR扩增,PCR扩增条件如下: 94℃㊁5min;94℃㊁30s;60℃㊁30s;72℃㊁30s;30个循环,72℃㊁10min;扩增片段大小为360bp和321 bp㊂将PCR扩增得到的VH和VL基因片段,利用限制性内切酶NheⅠ和SalⅠ酶切,回收目的片段亚克隆至pIgH和pIgL载体,连接产物转化至DH5α感受态细胞中,经菌落PCR和提取质粒酶切鉴定获得阳性克隆(分别命名为pIgH⁃YG5VH和pIgL⁃YG5VL),并进一步送交测序鉴定㊂1.2.7　Anti⁃PcrV抗体YG5的表达及纯化　将测序正确的阳性单克隆pIgH⁃YG5VH和pIgL⁃YG5VL分别接种至100ml2YTA培养基中,37℃,220r/min 培养过夜㊂8000r/min,4℃,离心15min收菌㊂然后采用无内毒素质粒大提试剂盒提取pIgH⁃YG5VH 和pIgL⁃YG5VL质粒备用;75μg质粒(pIgH⁃YG5VH 和pIgL⁃YG5VL比例为1∶1)重悬于2.5ml FreeStyle F17细胞培养基中,225μg转染试剂PEI也重悬在2.5ml FreeStyle F17细胞培养基中;将PEI缓慢的加入到质粒中,充分混合,室温放置约15min;将上述混合液加入到45ml293E细胞中(细胞密度为1×106ml-1),37℃细胞摇床培养7d㊂3000r/min,离心15min收取培养细胞上清㊂采用装有Protein A填料的树脂亲和纯化抗体㊂使用0.2mol/L pH2.2的Glycine⁃HCl洗脱抗体,然后使用1.5mol/L 的Tris⁃HCL(pH9.1)将洗脱液中和至pH7.4㊂将纯化后抗体超滤浓缩,使用PBS(pH7.4)重悬后利用SDS⁃PAGE检测抗体纯度㊂1.2.8　ELISA实验检测全人源抗体YG5亲和力　使用包被液稀释PcrV至终浓度10μg/ml,加入至ELISA板孔中,4℃包被过夜㊂PBST洗涤后,使用4%脱脂奶粉封闭,37℃㊁1h㊂PBST洗涤5次, 200μl/孔,2min/次㊂将样品加入ELISA板孔中, 100μl/孔,37℃孵育1h㊂PBST洗涤5次, 200μl/孔,2min/次㊂将HRP标记的山羊抗人IgG 按1∶40000稀释于4%奶粉中,100μl/孔,37℃孵育1h㊂TMB显色液显色,100μl/孔,室温显色2~ 5min㊂用2%H2SO4终止显色,50μl/孔㊂读取450nm吸光值,使用GraphPad软件分析数据㊂1.2.9　急性肺炎模型验证YG5抗体活性　将雌性BALB/c小鼠21只随机分为3组,每组7只㊂分别腹腔注射0.5mg/ml的抗体㊁对照抗体或无菌PBS 200μl㊂其中,对照抗体为抗金黄色葡萄球菌外分泌蛋白的全人源单克隆抗体㊂4h后使用1%戊巴比妥纳麻醉小鼠后固定于专用手术台,75%乙醇消毒后自颈部正中切开皮肤,钝性分离直至暴露气管,用1ml注射器将铜绿假单胞菌(1×106CFU)悬液经气管缓慢注入两肺㊂观察记录小鼠48h内的死亡情况㊂1.3　统计学处理　采用Graph Pad Prism5.0软件进行作图,Log⁃rank(Mantel⁃Cox)Test分析不同数据间统计学差异㊂2　结果2.1　PcrV重组蛋白的表达2.1.1　表达载体pET⁃28a⁃PcrV的构建　以PAO1基因组DNA为模板,利用PcrV基因上下游特异性引物进行PCR扩增㊂琼脂糖凝胶电泳检测显示,扩增得到约885bp大小的单一条带(图1A),使用NheⅠ和EcoRⅠ酶切获得PcrV基因片段,再克隆至表达载体pET⁃28a㊂菌落PCR鉴定结果显示成功构建pET⁃28a⁃PcrV重组表达载体(图1B)㊂2.1.2　PcrV蛋白的表达和纯化　挑取测序正确的阳性菌落,IPTG诱导后收集菌体并超声处理分别收取超声上清及沉淀,SDS⁃PAGE电泳结果显示,在相对分子质量30kD 处检测到目的条带,且其以可溶性形式表达㊂进一步利用Ni 2+螯合树脂纯亲和化获得纯度较高的目的蛋白PcrV(图2)㊂2.2　特异性抗体YG5的表达2.2.1　与PcrV 特异性结合的阳性噬菌体克隆的筛选与鉴定　包被PcrV 蛋白,利用naive Fab 抗体库筛选PcrV 蛋白特异结合噬菌体克隆㊂经过三轮筛选,与PcrV 结合的噬菌体克隆得到明显富集㊂将第三轮筛选后洗脱的噬菌体感染TG1,从中随机挑取84个克隆,加入辅助噬菌体,获得展示单一Fab 的噬菌体克隆(phage⁃Ab),利用ELISA 检测phage⁃Ab 与PcrV 结合能力㊂图3所示,根据吸光值(OD450nm)不同,我们将挑选的克隆分为2组(OD450nm<1∶23个克隆和OD450nm≥1∶61个克隆),挑选阳性克隆(OD450nm≥1)进行序列测定,结果发现所有克隆中的质粒所编码的抗体可变区序列完全相同,我们将该抗体命名为YG5㊂图1　表达载体pET⁃28a⁃PcrV 的构建Fig.1　Construction of expression vector pET⁃28a⁃PcrVNote:A.PCRamplificationofPcrVgene;B.Identificationofrecombinant vector of pET⁃28a⁃PcrV;M.Trans2K DNAmarker.图2　PcrV 蛋白的表达和纯化Fig.2　Expression and purification of PcrV proteinNote:M.Protein marker;1.Whole bacteria cleavage products;2.Wholebacteriacleavagesupernatant;3.Wholebacteriacleavageprecipitation;4.Purification of PcrV protein.2.2.2　pIgH⁃YG5VH 和pIgL⁃YG5VL 重组质粒的构建　我们以包含YG5重链和轻链可变区(YG5VH 和YG5VL)的质粒为模板,利用抗体重链和轻链上下游特异性引物进行PCR 扩增㊂琼脂糖凝胶电泳检测显示,扩增得到约360bp 和321bp 的条带(图4)㊂利用NheⅠ和SalⅠ酶切YG5VH 和YG5VL 片段,克隆至表达载体pIgH 和pIgL㊂经酶切鉴定和序列测定,重组表达载体(pIgH⁃YG5VH 和pIgL⁃YG5VL)构建成功㊂2.2.3　特异性抗体YG5的表达及纯化　我们将培养测序正确的pIgH⁃YG5VH 和pIgL⁃YG5VL 阳性克隆细菌,提取pIgH⁃YG5VH 和pIgL⁃YG5VL 质粒,并共转染至293E 细胞㊂使用ProteinA 树脂从细胞培养上清亲和纯化YG5抗体,并通过SDS⁃PAGE 电泳检测抗体纯度㊂结果显示,在还原条件下,在相对分子量约55和25kD 处可检测到目的条带,在非还原电泳条件下,在相对分子量约150kD 处可检测到目的条带(图5)㊂2.2.4　利用ELISA 实验检测YG5抗体与PcrV蛋白亲和力　我们将纯化后的YG5抗体稀释至不同图3　ELISA 检测阳性克隆Fig.3　Detection of positive clones byELISA图4　YG5抗体VH 和VL 片段的扩增Fig.4　Amplification of VH and VL fragments of YG5an⁃tibodiesNote:M.Trans2K DNA marker;1.VL fragments of YG5antibodies;2.VH fragments of YG5antibodies.的浓度,利用ELISA 实验检测其与PcrV 蛋白结合能力㊂采用GraphPad 软件做图并分析数据,结果显示,YG5与PcrV 结合的EC 50值为61ng /ml(图6)㊂2.3　急性肺炎模型验证YG5抗体抗感染活性　由图5　YG5SDS⁃PAGE 分析Fig.5　SDS⁃PAGE analysis of YG5Note:M.Protein marker;1.Reduced SDS⁃PAGE analysis;2.Non⁃reducing SDSanalysis图6　ELISA 检测YG5亲和力Fig.6　Detection of YG5affinity byELISA图7　小鼠生存曲线Fig.7　Survival rate of MouseNote:The control antibody is an antibody against Staphylococcus aureusexocrine protein.*.P <0.05;**.P <0.01.于铜绿假单胞菌是诱发肺部感染的主要致病菌之一,我们在随后的研究中,通过气管插管注入细菌的方式建立了小鼠肺部感染铜绿假单胞菌的致死性模型,并在此基础上检测YG5抗体是否能够抑制铜绿假单胞菌的感染,提高小鼠的存活率㊂我们的研究结果发现与对照抗体和PBS 组相比,YG5能有效抑制铜绿假单胞菌的感染,降低小鼠的死亡率(图7)㊂3　讨论本研究成功构建了pET⁃28a⁃PcrV 重组表达载体,表达并纯化铜绿假单胞菌重组蛋白PcrV㊂利用噬菌体抗体库筛选出具有较高亲和力的抗PcrV 单克隆人源抗体YG5㊂进一步的研究结果表明,YG5抗体能有效保护小鼠抵御铜绿假单胞菌的感染㊂目前已知铜绿假单胞菌能够感染宿主细胞导致疾病的主要原因是其能够通过Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretion system,T3SS)的作用,逃避宿主巨噬细胞的吞噬降解㊂T3SS 蛋白按功能可分为分泌装置㊁转位器装置㊁毒素蛋白和分子伴侣四部分㊂分泌装置锚定在细菌胞膜上,通过针管状结构连接转位器装置,转位器装置被激活后,插入宿主细胞膜,形成转位孔道,向宿主细胞输入毒素蛋白,杀伤靶细胞[10]㊂PcrV 蛋白是形成转位孔道的必需条件,是T3SS 至关重要的组成部分,已成为免疫治疗的重要靶点[11]㊂针对微生物感染性疾病,治疗性抗体相关药物的研发取得了很大的进展㊂目前已经有4个用于治疗感染性疾病的单抗药物被FDA 批准上市,分别是抗呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)的Palivizumab 单抗(Synagis )㊁抗炭疽杆菌的Raxibacumab 单抗(ABthrax)和Obiltoxaximab 单抗(Anthim)以及抗艰难梭菌感染的Bezlotoxumab 单抗(Zinplava)[12]㊂除了以上几种抗体药物外,还有很多抗感染类的抗体药物正处于临床研究阶段或临床前研究阶段㊂随着病原微生物诱发感染的机制深入研究,会发现和鉴定一系列参与微生物致病的功能分子,这将为治疗性抗体研发提供更多的药物靶点㊂目前针对铜绿假单胞菌感染的在研抗体主要有4种,分别是MEDI3902㊁Panobacumab㊁KB001和Aerucin TM [13⁃15]㊂其中,MEDI3902和Aerucin TM 已经完成Ⅰ期临床实验,Panobacumab 和KB001已经完成Ⅱ期临床实验㊂全人源单克隆抗体YG5是不同于以上抗体的新抗体,能够显著抑制铜绿假单胞菌对机体的感染,有可能成为新的抗铜绿假单胞菌感染的治疗性药物㊂参考文献:[1]　Stover CK,Pham XQ,Erwin AL,et plete genome sequenceof Pseudomonas aeruginosa PAO1,an opportunistic pathogen[J].Nature,2000,406(6799):959⁃964.[2]　Weber DJ,Rutala 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㊃综述㊃D O I :10.3760/c m a .j .i s s n .1673-436X.2013.006.009基金项目:国家自然科学基金资助项目(81170003);上海市卫生系统优青人才项目资助(X Y Q 2011006)作者单位:200433同济大学附属上海市肺科医院呼吸科通信作者:徐金富,E m a i l :jf x u c n @g m a i l .c o m 潜在的新型干预铜绿假单胞菌肺部感染手段 抗P c r V 抗体陆海雯 徐金富 李惠萍ʌ摘要ɔ 铜绿假单胞菌是慢性气道疾病的最重要的致病菌之一㊂Ⅲ型分泌系统广泛存在于其中,并由分泌装置和转运体蛋白构成㊂该系统的关键蛋白P c r V 蛋白对铜绿假单胞菌产生毒力起着重要作用㊂抗P c r V 抗体可以阻断Ⅲ型分泌系统,降低铜绿假单胞菌的生物致病性㊂因此,抗P c r V 抗体可以作为潜在的新型的铜绿假单胞菌肺部感染的辅助治疗手段㊂ʌ关键词ɔ 铜绿假单胞菌;Ⅲ型分泌系统;P c r V 蛋白;抗P c r V 抗体An e w p o t e n t i a l i n t e r v e n t i o nm e a no fP s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a l u n g i n f e c t i o n -a n t i -P c r Va n t i b o d yL U H a i -w e n ,X UJ i n -f u ,L I H u i -p i n g .D e p a r t m e n t o f P u l m o n a r y M e d i c i n e ,S h a n g h a iP u l m o n a r y H o s p i t a l ,T o n g j i U n i v e r s i t y ,S h a n gh a i 200433,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :X UJ i n -f u ,E m a i l :j fx u c n @g m a i l .c o m ʌA b s t r a c t ɔ P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a i s o n e o f t h em o s t i m p o r t a n t p a t h o ge n s i n p a t i e n t sw i t h c h r o n i c a i r w a y d i s e a s e s .T y p e Ⅲs e c r e t i o n s y s t e m (T T S S )c o n s i s t s o fs e c r e t e d e x pr o d u c t s a n d s t r u c t u r a l c o m p o n e n t s ,s u c ha sP c r V ,a n di t p l a y sa ni m p o r t a n t r o l e i nt h ev i r u l e n c eo fP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a .A n t i -P c r V a n t i b o d y b l o c k s T T S S a n d r e d u c e st h ei n f l a mm a t o r y r e s p o n s e .A n t i -P c r V a n t i b o d y h a s p o t e n t i a l e f f e c t s a s a d j u v a n t t h e r a p y f o r l u n g i n j u r y d u e t oP s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a p n e u m o n i a .ʌK e y w o r d s ɔ P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ;T y p eⅢs e c r e t i o n s y s t e m ;P c r V ;A n t i -P c r Va n t i b o d y 铜绿假单胞菌肺部感染率居高不下,且抗生素耐药率极高,治疗难度大㊂研究发现Ⅲ型分泌系统(T T S S )复合物是铜绿假单胞菌的外毒素注入宿主细胞所必需的㊂采用抗体来拮抗T T S S 复合物的关键蛋白P c r V 蛋白,被证实有潜在治疗铜绿假单胞菌肺部感染的价值㊂1 铜绿假单胞菌肺炎治疗存在很大的困难铜绿假单胞菌是非发酵革兰阴性杆菌中毒力最强的,是结构性肺病患者肺炎常见的病原体㊂20世纪70年代,铜绿假单胞菌仅被认为是导致粒细胞缺乏患者发生致死性菌血症的病原体,而到20世纪末及21世纪初,铜绿假单胞菌已是医院获得性感染的主要病原体㊂近年来,越来越多的研究发现,铜绿假单胞菌不仅是医院获得性肺炎的最重要病原体之一,其所致的社区获得性肺炎也很常见㊂与常规肺炎(非铜绿假单胞菌感染所致肺炎)相比,铜绿假单胞菌所致肺炎病死率数倍上升[1-2]㊂目前的突出问题是,临床经常分离到耐多种常用抗生素的菌株和几乎全部耐药的菌株,即耐多药铜绿假单胞菌和泛耐药菌株,使临床医师几乎无药可选㊂作为我国常见病的支气管扩张症,其铜绿假单胞菌肺部感染率更是居高不下,在住院患者中铜绿假单胞菌感染率更高,基本上无法依赖抗生素来清除,且直接导致患者症状反复加重[3-4]㊂2010年版的英国胸科学会指南指出,存在慢性铜绿假单胞菌感染时必须强制性定期随访,确保随时治疗[5]㊂2 T T S S 是目前的研究热点目前针对铜绿假单胞菌的治疗研究大多仍围绕其耐药机制,如主动外排系统㊁减低细胞膜对抗感染药物的通透性㊁靶位青霉素结合蛋白的改变㊂临床上希望通过联合用药㊁足量用药㊁及时用药和针对细菌生物被膜用药来快速清除致病菌,降低体内致病菌负荷,尽可能避免耐药致病菌的产生㊂但全球铜㊃334㊃国际呼吸杂志2013年3月第33卷第6期 I n t JR e s pi r ,M a r c h2013,V o l .33,N o .6绿假单胞菌耐药情况的监测数据表明[6-7],铜绿假单胞菌对各种抗假单胞菌抗生素的耐药情况比较严重且有逐年加重的趋势,同时耐多药和泛耐药铜绿假单胞菌的检出率也逐年上升㊂随着人们对细菌致病机制的研究,毒力因子逐渐成为抗感染治疗的新靶位㊂铜绿假单胞菌作为人类三大机会致病菌之一,其致病机制十分复杂㊂但细菌分泌系统的发现使细菌致病机制研究有了重要进展,其中T T S S广泛存在于致病菌中,通过T T S S,可将细菌毒力蛋白直接注入宿主细胞,改变宿主细胞的功能,如改变肌动骨架蛋白动力学㊁细胞核应答和细胞内物质的运转等[8]㊂铜绿假单胞菌T T S S主要分泌4种毒素:E x o S㊁E x o T㊁E x o Y㊁E x o U㊂其中E x o U是一种磷脂酶,是4种毒素中最具破坏性的㊂其具有磷脂酶A2的活性,可以导致不可逆的细胞膜损伤以及快速的坏死,其在急性肺炎小鼠模型中是主要的毒力因子㊂在机械通气相关肺炎患者中,被携带E x o U铜绿假单胞菌感染的患者重症肺炎比例明显高于普通型[9]㊂T T S S复合物是铜绿假单胞菌分泌效应蛋白注入宿主细胞所必需的,由多种蛋白组成的超分子复合结构㊂其结构类似于一注射器,称之为T T S S注射装置㊂3P c r V是T T S S注射装置的关键部分T T S S注射装置由分泌装置和转运体蛋白构成㊂其中转运体蛋白包括P c r V㊁P o p B㊁P o p D等,其游离于细胞膜外,类似于注射器的针头㊂该注射装置可以帮助细菌定植在宿主细胞的细胞膜上,并将细菌分泌蛋白(效应蛋白)注入宿主细胞[10-11]㊂而此过程并不是简单的针头注射过程,还需要转位体蛋白的协助,转位体蛋白经注射装置分泌插入宿主细胞膜中形成小孔,注射器装置的针头要与转位体蛋白的小孔相对接,细菌的分泌蛋白才可以分泌到宿主细胞胞质中㊂通过透射电镜还发现在铜绿假单胞菌T T S S内,此注射器针头的顶端为P c r V,而P o p B㊁P o p D则线性连接成中空的筒状结构,其内部有专门输送效应蛋白的中心孔道㊂细菌突变研究证实,去除P c r V后,不影响细菌分泌毒素,但细菌T T S S的针无法与宿主细胞膜结合,细菌的效应蛋白无法进入到宿主胞质中,从而无法造成宿主细胞免疫功能改变及细胞上皮损伤[12]㊂故对铜绿假单胞菌而言,P c r V是分布于针头顶端与宿主细胞膜紧密结合的形成毒力的关键部位㊂4抗P c r V治疗在铜绿假单胞菌肺炎中的作用一系列在不同的动物模型中的研究[13-15]也表明,无论单克隆还是多克隆抗P c r V抗体对治疗和预防铜绿假单胞菌感染都有较好的疗效㊂S a w a等[13]在1999年发表文献证实抗P c r v抗体在治疗和预防烧伤小鼠的铜绿假单胞菌感染有明显疗效,如减轻细胞毒性反应,减少肺损伤㊁菌血症及休克发生㊂N e e l y等[14]在2005年通过实验也得出类似结果,其将烧伤并被铜绿假单胞菌感染伤口的小鼠作为模型,并进行皮下给予抗P c r V抗体治疗(伤后24h内),发现治疗组小鼠的存活率显著高于对照组㊂也有实验将铜绿假单胞菌注入小鼠气管内,以此制成实验小鼠模型㊂将1h内给予兔源性多克隆抗P c r V抗体治疗及鼠源性单克隆抗P c r V 抗体治疗作为治疗组,发现治疗组小鼠感染症状轻,血液动力学影响小,肺水肿程度轻㊂并通过实验推测抗P c r V抗体中起治疗作用的可能为F a b片段㊂多项独立的研究也分别证实了鼠源性单克隆抗体(M a b166)的F a b片段在治疗铜绿假单胞菌急性感染中的有效性㊂其中2002年F a u r e等[15]发表了抗P c r V抗体治疗铜绿假单胞菌感染小鼠实验的相关报告,为该结论提供了进一步的依据㊂该实验将急性感染(1h内)铜绿假单胞菌(菌株P A103)的小鼠作为模型,分别按气管内给予兔源性多克隆抗体㊁M a b166及M a b的F a b片段治疗的3种治疗方式分为3个治疗组㊂实验表明:上述3种治疗在减轻小鼠肺水肿㊁减缓氧饱和度的下降㊁减轻代谢性酸中毒中均有效,且M a b的F a b片段在减少肺上皮损伤方面有优势㊂又因M a b的F a b片段相对分子质量小,排异小,推测更有可能改进以适用于人体㊂因铜绿假单胞菌感染多为慢性感染,患者多有支气管扩张㊁支气管肺囊肿等基础疾病㊂针对治疗其慢性感染的实验更具有临床意义㊂其中I m a m u r a等[16]在2007年发表了以观察抗P c r V抗体(兔源性多克隆抗体)治疗慢性铜绿假单胞菌感染的实验结果,实验中以感染铜绿假单胞菌(菌株6073)小鼠作为模型,将第7天及第14天给药(兔源性多克隆抗体)者作为治疗组,实验发现在小鼠支气管肺泡灌洗液中细菌菌落数方面治疗组与对照组无统计学差异,推测抗P c r V抗体无直接杀菌作用㊂但其中炎性介质如巨噬细胞炎性蛋白-2㊁白介素β㊁肿瘤坏死因子α及细胞数尤其中性粒细胞数方面治㊃434㊃国际呼吸杂志2013年3月第33卷第6期I n t JR e s p i r,M a r c h2013,V o l.33,N o.6疗组明显少于对照组(P<0.0001)㊂治疗组小鼠因中性粒细胞介导的气道炎症及肺上皮损伤也较轻微,故治疗组小鼠的致死率及致残率相对较低㊂近期,S o n g等[17]进一步进行了抗P c r V抗体(M a b166)联合抗生素(妥布霉素㊁头孢他定㊁环丙沙星)治疗铜绿假单胞菌感染的相关实验㊂实验小鼠在感染前1h给予M a b166预防性用药,感染后1h 给予不同抗生素治疗㊂实验结果表明,单纯抗生素治疗组7d后生存率为40%~60%,而联合M a b166后可上升至80%以上,其中妥布霉素效果最佳,可升至90%㊂且联合用药在减轻患鼠肺水肿及控制患鼠肺部感染及远处感染播散方面也有明显效果㊂单纯抗生素治疗可减少气道内细菌数量,但仍然不能阻止炎性介质等导致的肺部损伤,最终细菌播散至血液及脾脏,导致小鼠死亡㊂而抗体治疗可以尽量保持气道上皮完整性㊂两者有效结合可明显提高小鼠生存率,同时实验数据也证实M a b166联合妥布霉素治疗后明显减少肺泡腔内炎性细胞渗出(P<0.006),尤其是中性粒细胞㊂5前景与不足铜绿假单胞菌肺部感染与定植已经成为一个严重的社会问题,耗费大量的临床资源,并直接导致患者的死亡㊂目前针对其耐药机制的各种干预手段效果并不显著,故迫切需要探索更为安全有效的新途径㊂抗P c r V抗体能够干扰针状的T T S S复合物,降低铜绿假单胞菌的生物致病性,从而保护宿主细胞及动物模型免受细菌的细胞毒素的侵害㊂其抗体片段在药靶定向性和特异性方面更具有明显的优势,引发免疫原性反应的风险也小㊂针对P c r V蛋白的㊁非免疫原性改造的人抗体有望成为治疗铜绿假单胞菌肺部感染的潜在新疗法㊂但是,从目前资料来看,抗P c r V抗体只能定位于辅助治疗手段㊂单纯依赖抗P c r V抗体抗铜绿假单胞菌并不现实㊂铜绿假单胞菌的致病机制复杂,而且不是所有的铜绿假单胞菌在生长的过程中分泌P c r V,有些菌株,尤其是在慢性感染中分离的菌株, P c r V的分泌受到抑制㊂目前针对T T S S的P c r V 疫苗正在研发中,动物实验的结果显示该疫苗毒力强,对于铜绿假单胞菌急性感染有较好效果,对于控制或改善肺损伤,可能有较大的开发空间㊂但P c r V 疫苗的使用也有许多限制,如感染的细菌须表达P c r V,对存在生物膜形成的菌株可能效果差,甚至无任何作用㊂高浓度抗体下若菌株不能迅速杀灭,是否会诱导急性感染菌株趋向慢性感染菌株转变,这些都是亟待解决的潜在问题㊂参考文献[1] T o r r e sA,M e nén d e zR.E n t e r o b a c t e r i a c 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[13] S a w a T,Y a h r T L,O h a r a M,e ta l.A c t i v e a n d p a s s i v e㊃534㊃国际呼吸杂志2013年3月第33卷第6期I n t JR e s p i r,M a r c h2013,V o l.33,N o.6i mm u n i z a t i o n w i t h t h e P s e u d o m o n a s V a n t i g e n p r o t e c t sa g a i n s t t y p eⅢi n t o x i c a t i o na n d l u n g i n j u r y.N a tM e d,1999,5:392-398.[14] N e e l y A N,H o l d e rI A,W i e n e r-K r o n i s hJ P,e ta l.P a s s i v ea n t i-P c r V t r e a t m e n t p r o t e c t sb u r n e d m ic e a g a i n s tP s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a c h a l l e n g e.B u r n s,2005,31:153-158.[15] F a u r e K,F u j i m o t oJ,S h i m a b u k u r o D W,e ta l.E f f e c t so fm o n o c l o n a l a n t i-P c r Va n t i b o d y o nP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a-i n d u c e da c u t el u n g i n j u r y i nar a t m o d e l.JI mm u n eB a s e dT h e rV a c c i n e s,2003,1:2.[16]I m a m u r aY,Y a n a g i h a r aK,F u k u d aY,e t a l.E f f e c to f a n t i-P c r V a n t i b o d y i n a m u r i n e c h r o n i c a i r w a y P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a i n f e c t i o nm o d e l.E u rR e s p i r J,2007,29:965-968.[17] S o n g Y,B a e r M,S r i n i v a s a n R,e t a l.P c r V a n t i b o d y-a n t ib i o t ic c o m b i n a t i o n i m p r o v e s s u r v i v a li n P s e ud o m o n a sa e r u g i n o s a-i n f e c t e d m i c e.E u rJ C l i n M i c r ob i o lI n f ec t D i s,2012,31:1837-1845.(收稿日期:2012-08-07﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏)㊃简讯㊃实用无创机械通气技术进修班招生简介北京朝阳医院呼吸与危重症医学科(西区)无创正压机械通气的临床应用日趋广泛,从早期用于治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(O S A S)逐步扩展至治疗多种急性呼吸衰竭,在慢性呼吸衰竭的机械通气治疗中无创通气已居于主导地位㊂目前,国内多数医院在呼吸科㊁I C U㊁急诊科㊁心脏科等开展了无创通气治疗,取得一定疗效,但长期以来关于无创通气的一些基本问题仍困扰着临床,如:何种呼吸机可用于无创通气㊁为何上机后患者的血C O2反而更高㊁患者无法耐受无创通气怎么办 ,成为制约无创通气进一步规范㊁普及应用的重要因素㊂北京朝阳医院呼吸与危重症医学科-北京呼吸疾病研究所在国内较早开展无创通气,是国内无创通气多中心研究的牵头单位(中华结核和呼吸杂志,2005,28:680-684;中华结核和呼吸杂志,2006,29:13-17),对无创通气的教学具有丰富经验㊂现以北京朝阳医院呼吸与危重症医学科(西区)为教学基地,举办无创机械通气专项进修班,时间安排为4个月的短期进修,教学安排为前半程在I C U进行理论学习和临床见习㊁后半程在呼吸病房由带教老师指导完整管理无创机械通气患者,通过理论与实践相结合的强化培训使进修生在短期内初步规范掌握无创通气的临床应用㊂招生范围:临床工作中需开展无创机械通气,具有一定呼吸衰竭治疗经验的医生㊂招生时间:每年招收3期,每期4个月,分别于6月㊁10月㊁2月开学㊂报名方式:①在朝阳医院网站(h t t p://w w w.b j c y h.c o m.c n/)首页左下方 最新下载 或在潮阳呼吸支持技术学院网站(h t t p://w w w.c y c r s t.c o m/i n d e x.a s p) 培训专区 下载‘进修申请表“㊂②填写‘进修申请表“,封面进修科目栏填写 呼吸与危重症医学科(西区) ,第三页进修科目要求栏填写 无创机械通气的临床应用 ㊂③将‘进修申请表“邮寄至:北京市石景山区京原路5号北京朝阳医院(西区)I C U朱剑收100043,请在信封上注明 无创通气进修 ㊂我们会及时与您联系,我们的联系电话010-********㊂㊃634㊃国际呼吸杂志2013年3月第33卷第6期I n t JR e s p i r,M a r c h2013,V o l.33,N o.6。

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第43卷第1期2021年1月V ol.43No.1Jan.2021doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202006019铜绿假单胞菌oprL 和oprF 基因二价组合DNA疫苗初免-灭活疫苗加强免疫效果的研究宫强*，翟文汉，郭利娜，杜珍奇（河南科技大学河南省食品微生物工程技术研究中心,河南洛阳471023）摘要：为探索铜绿假单胞菌oprL 和oprF 基因的二价组合DNA 疫苗pOPRL+pOPRF 初免-灭活疫苗加强免疫的效果，本实验以铜绿假单胞菌二价组合DNA 疫苗pOPRL+pOPRF 免疫BALB/c 小鼠后再以灭活疫苗加强免疫，根据两种疫苗的免疫次数分为初免-加强免疫1组和初免-加强免疫2组，同时设置二价组合DNA 疫苗单独免疫组、灭活疫苗单独免疫组以及生理盐水对照组。

免疫后间接ELISA 法测定小鼠血清抗体水平、MTT 法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平，双抗体夹心ELISA 测定小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-2和IL-4的水平。

三免两周后将铜绿假单胞菌以1.35×1010cfu/只的剂量对各组小鼠进行攻毒试验，测定攻毒后各组小鼠的保护率。

结果显示DNA 疫苗初免-灭活疫苗加强免疫诱导的小鼠血清抗体水平、刺激指数（SI ）值及小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2含量显著高于DNA 疫苗单独免疫组（p <0.05）。

且初免-加强免疫1组小鼠的SI 值及分泌的IFN-γ和IL-2含量显著高于灭活疫苗组（p <0.05），但各组小鼠分泌的IL-4含量无显著差异（p >0.05）。

初免-加强免疫1组、初免-加强免疫2组、灭活疫苗组和DNA 疫苗单独组的保护率分别为92%、80%、84%和72%。

表明二价组合DNA 疫苗初免-灭活疫苗加强免疫策略可以诱导小鼠产生较高水平的抗体和Th1型细胞免疫应答，并可为小鼠提供较好的保护率。

PcrV被动及主动免疫在多重耐药铜绿假单胞菌致肺损伤保护作用研究中期报告研究背景：多重耐药铜绿假单胞菌（MDR P. aeruginosa）是一种常见的耐药菌，易导致肺部感染和损伤。

PcrV是铜绿假单胞菌外毒素中的一个组分，与细胞内的Toll样受体2（TLR2）结合，并导致促炎性细胞因子的释放。

PcrV被动免疫和主动免疫是两种可能的预防和治疗MDR P. aeruginosa致肺损伤的方法。

研究目的：本研究旨在探讨PcrV被动免疫和主动免疫对MDR P. aeruginosa致肺损伤的保护作用，并比较两种方法的疗效。

研究方法：本研究采用小鼠模型，将小鼠分为四组，分别为PcrV被动免疫组、PcrV主动免疫组、阴性对照组和阳性对照组。

在第1、3、5周，PcrV被动免疫组和PcrV主动免疫组分别接受PcrV特异性抗体和重组PcrV疫苗的免疫。

在第6周，四组小鼠接受相同剂量的MDR P. aeruginosa。

在MDR P. aeruginosa感染后的24、48和72小时，测量小鼠的体重、肺组织损伤程度、细胞因子水平和细菌数量。

此外，还将比较两种免疫方法的效果。

研究结果：PcrV被动免疫组和PcrV主动免疫组的小鼠体重下降程度、肺组织损伤程度和细胞因子水平均比阴性对照组显著降低，细菌数量也比阳性对照组显著减少。

PcrV被动免疫和主动免疫的保护作用相似，但PcrV主动免疫组小鼠体重下降的程度更小，并且在某些时点测得的细菌数量也更少。

此外，PcrV被动免疫组和PcrV主动免疫组的细胞因子水平也有所不同。

研究结论：PcrV被动免疫和主动免疫都具有保护小鼠免受MDR P. aeruginosa 致肺损伤的能力。

虽然两种方法的保护作用相似，但PcrV主动免疫可能具有更好的疗效。

铜绿假单胞菌单PilZ结构域蛋白PA0012和PA4324突变体生物学表型的初步筛选赵朔;盛硕【期刊名称】《遵义医科大学学报》【年(卷),期】2024(47)1【摘要】目的本研究以铜绿假单胞菌单PilZ结构域的环二鸟苷酸受体蛋白PA0012和PA4324为研究对象,研究这2个蛋白对生物学表型的影响。

方法本研究首先利用同源重组的方法对编码PA0012和PA4324蛋白的基因进行了敲除,得到敲除突变体菌株ΔPA0012和ΔPA4324。

然后,将实验分为3组,以野生型菌株PAO1为对照,用这2个突变体进行了表型筛选,包括群集运动能力、感染生菜的能力、对线虫的致病力和蛋白酶活性等,采用单因素方差分析对各组间的差异进行统计分析。

随后对这2个突变体和野生型菌株进行了RNA测序,分析2个单PilZ结构域蛋白突变导致的基因差异表达,在转录水平上综合分析2个蛋白对生物学表型的影响。

结果本研究发现这2个单PilZ结构域蛋白的突变均能导致铜绿假单胞菌的群集运动增强,感染生菜的能力减弱,对线虫的毒性和蛋白酶活性的影响则无显著变化。

RNA测序结果表明,这2个蛋白突变均可导致铜绿假单胞菌中大量基因的差异表达,且有一些共同的差异基因。

结论铜绿假单胞菌的PA0012和PA4324突变均能增强其群集运动和减轻其对生菜的感染,为后续机制研究奠定了基础。

【总页数】9页(P38-46)【作者】赵朔;盛硕【作者单位】遵义医科大学基础医学院电镜室;华南农业大学群体微生物研究中心/广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室;遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室【正文语种】中文【中图分类】R378.991【相关文献】1.铜绿假单胞菌MexAB-OprM主动外排表型筛选和外排基因检测2.人免疫缺陷病毒包膜蛋白V3多肽与白喉毒素无毒突变体CRM197结构域A融合蛋白的免疫原性分析及单克隆抗体筛选3.SPA单结构域突变体组合噬菌体文库的构建及体外进化筛选4.铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达5.人干细胞生长因子Ca2+依赖糖识别结构域缺失突变体的重组表达及生物学活性的初步探讨因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

铜绿假单胞菌的鉴定及重组外膜蛋白免疫效果的初步研究的开题报告一、研究背景铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性菌，具有较强的耐药性和致病性，是医院感染和呼吸系统感染的主要病原体之一。

由于其致病力强，治疗难度大，已被世界卫生组织列为“高度危险病原体”。

目前对于铜绿假单胞菌的诊断和治疗仍面临诸多挑战，因此对其鉴定和免疫学研究具有重要意义。

二、研究内容1. 铜绿假单胞菌的鉴定：通过常规生化试验、分子生物学技术等方法，对铜绿假单胞菌进行鉴定，建立可靠的鉴定方法。

2. 铜绿假单胞菌外膜蛋白的免疫学研究：利用重组外膜蛋白进行免疫学研究，包括抗原性分析、免疫原性评价等，以期建立有效的免疫防治方法。

三、研究意义1. 为有效预防和控制铜绿假单胞菌感染提供科学依据。

2. 为开发新型铜绿假单胞菌疫苗提供技术支持。

3. 为进一步探究铜绿假单胞菌致病机制提供参考。

四、研究方法1. 从临床样本中分离铜绿假单胞菌。

2. 通过常规生化试验和分子生物学技术对铜绿假单胞菌进行鉴定和鉴定方法的优化。

3. 利用大肠杆菌作为表达宿主，构建重组外膜蛋白表达载体，并表达外膜蛋白。

4. 对重组外膜蛋白进行抗原性分析和免疫原性评价。

五、研究进度目前已完成对外膜蛋白表达载体的构建和外膜蛋白的表达。

下一步将进行外膜蛋白的纯化和鉴定方法的优化。

预计在两年内完成研究任务。

六、研究预期结果1. 建立铜绿假单胞菌的鉴定方法，并验证其可靠性。

2. 研究铜绿假单胞菌外膜蛋白的免疫学效应，为疫苗研发提供技术支持。

3. 探究铜绿假单胞菌致病机制，为其防治提供参考。