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初始污染菌检验方法适用性验证方案文件编号：编制/日期：审核/日期：批准/日期：XXXX有限公司1.验证目的---------------------------------------------------------32.范围-------------------------------------------------------------33.验证小组成员及职责-----------------------------------------------34.参考资料---------------------------------------------------------35.检验仪器及器具---------------------------------------------------36.菌种信息---------------------------------------------------------47.试验环境---------------------------------------------------------48.产品选择---------------------------------------------------------49.方法适用性验证---------------------------------------------------410.修正系数（校正因子）--------------------------------------------611.测试结果--------------------------------------------------------712.再验证周期------------------------------------------------------713.结论------------------------------------------------------------714.附表------------------------------------------------------------81.验证目的证明本公司医疗器械产品初始污染菌洗脱培养计数检验方法的适宜性和准确性。
药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。
细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。
特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。
2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。
（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。
（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。
6. 写出验证资料。
示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。
2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。
霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。
2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。
土壤微生物洗脱分离随着人们对土壤微生物的关注度不断提高，研究人员们开始对土壤微生物进行分离和鉴定。
而土壤微生物的洗脱分离是其中的一项重要步骤。
本文将探讨土壤微生物洗脱分离的方法和意义。
一、土壤微生物洗脱分离的方法1. 土壤样品的采集：首先，需要在不同地点采集土壤样品。
为了保证样品的代表性，应该选择不同类型的土壤和不同深度的土壤进行采集。
采集时要注意避免污染和样品混合。
2. 土壤样品的处理：采集到的土壤样品需要进行处理，包括除去杂质、破碎土壤团聚体等。
这样可以提高土壤微生物的分离效率。
3. 微生物洗脱液的选择：选择合适的洗脱液可以有效地分离土壤微生物。
常用的洗脱液有生理盐水、缓冲液等，可以根据需要选择合适的洗脱液。
4. 洗脱分离的方法：常见的土壤微生物洗脱分离方法有摇床法、超声波法、震荡法等。
其中，摇床法是最常用的方法之一。
通过在摇床上摇动土壤样品和洗脱液的混合物，使微生物从土壤中洗脱出来。
5. 微生物的分离与培养：将洗脱出的微生物进行分离和培养，可以得到纯培养物。
分离方法包括稀释法、划线法、扩散法等。
培养时需要提供适当的培养基和条件，以促进微生物的生长和繁殖。
二、土壤微生物洗脱分离的意义1. 研究土壤微生物的多样性：土壤微生物是土壤生态系统中的重要组成部分，对土壤的质量和功能具有重要影响。
通过洗脱分离，可以获取不同类型土壤中的微生物样品，从而研究土壤微生物的多样性和分布规律。
2. 研究微生物的功能和代谢特性：洗脱分离的微生物样品可以用于研究微生物的功能和代谢特性。
通过分离和培养纯培养物，可以进行生理生化实验和基因测序等，从而了解微生物的功能和代谢途径。
3. 开发微生物资源：土壤微生物是一种丰富的微生物资源库，其中包含了许多具有潜在应用价值的微生物。
通过洗脱分离，可以开发和利用这些微生物资源，用于环境修复、农业生产、制药等领域。
4. 土壤微生物的应用研究：洗脱分离的土壤微生物样品可以用于研究微生物在土壤中的生态功能和作用机制。
微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。
4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取、分离和纯化方法。
2. 掌握酶活性测定和蛋白质浓度测定技术。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种胞壁质酶，具有破坏细菌细胞壁的能力。
本实验采用鸡蛋清为原料，通过提取、分离和纯化等步骤，制备高纯度的溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋清- 酶活性测定试剂盒- 蛋白质浓度测定试剂盒- 溶菌酶纯度鉴定试剂盒- 分子量测定试剂盒2. 实验仪器：- 低温高速离心机- 酶标仪- 荧光分光光度计- 凝胶电泳仪- 凝胶成像系统四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）取一定量的鸡蛋清，加入适量的生理盐水，搅拌均匀。
（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取上清液。
（3）用酶活性测定试剂盒检测上清液中的溶菌酶活性。
2. 溶菌酶分离纯化（1）取上清液，加入适量的硫酸铵，使蛋白质沉淀。
（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取沉淀。
（3）将沉淀用生理盐水溶解，加入适量的G-25凝胶柱，进行凝胶过滤。
（4）收集洗脱液，用酶活性测定试剂盒检测洗脱液中的溶菌酶活性。
3. 溶菌酶纯度鉴定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入溶菌酶纯度鉴定试剂盒，进行电泳分析。
（2）观察电泳图谱，鉴定溶菌酶的纯度。
4. 溶菌酶分子量测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入分子量测定试剂盒，进行SDS-PAGE电泳分析。
（2）观察电泳图谱，计算溶菌酶的分子量。
5. 溶菌酶活性测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入酶活性测定试剂盒，进行酶活性测定。
（2）记录酶活性值。
6. 溶菌酶蛋白浓度测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入蛋白质浓度测定试剂盒，进行蛋白浓度测定。
（2）记录蛋白浓度值。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取上清液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
2. 溶菌酶分离纯化洗脱液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
3. 溶菌酶纯度鉴定电泳图谱显示，溶菌酶的纯度为XX%。
文件编号：TS-YZ-WF-006-03 生效日期: 页码：共页**软膏微生物方法学验证方案******制药有限公司验证方案起草部门起草人职务签字日期质量部*** QC主任质量部*** QC质量部*** QC验证方案审核部门姓名职务签字日期质量部*** 部长验证方案批准批准人职务签字日期*** 质量受权人目录1. 目的--------------------------------------------------------------------4 2．概述--------------------------------------------------------------------43. 验证小组----------------------------------------------------------------44. 相关文件和人员培训的验证------------------------------------------------4 4.1 确认所需文件的验证---------------------------------------------------44.2人员培训的验证--------------------------------------------------------45. 验证内容：槐芩软膏微生物方法学------------------------------------------5 5.1细菌、霉菌及酵母菌的检查----------------------------------------------5 5.2三批样品的细菌、霉菌及酵母的检查--------------------------------------7 5.3控制菌（金黄色葡萄球菌）的检查----------------------------------------7 5.4三批样品的金黄色葡萄球菌的检查----------------------------------------8 5.5控制菌（铜绿假单胞菌）的检查------------------------------------------95.6三批样品的铜绿假单胞菌）的检查---------------------------------------106. 偏差分析及处理----------------------------------------------------------117. 拟定日常监控及再验证周期------------------------------------------------118. 结果与评价--------------------------------------------------------------119. 附录--------------------------------------------------------------------111.目的：对建立的微生物限度检查方法进行验证，以证明该方法是否适合于槐芩软膏的微生物限度检查试验。
白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～28小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml ，采用10倍递增稀释法稀释至10-6～10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu 的孢子悬浮液。
黑曲菌菌液制备：接种黑曲菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，制成每1ml含菌数50～100cfu的孢子悬液。
供试液的制备无抑菌活性的供试品供试液的制备稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加90ml稀释剂，混匀，作为供试液（1：10）固体、半固体、粘稠性供试品：称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，作为供试液（1：10）。
具有抑菌活性的供试品试液的制备当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下：培养基稀释法：取供试液2ml，每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。
每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。
计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法技术规则报告菌数。
控制菌检查时可加大增菌液的用量。
离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。
薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，过滤，冲洗吗，按薄膜过滤法测定其菌落数。
中和法：选取适宜的中和剂消除供试品的抑菌活性后测定。
菌液组：测定所加的试验菌数。
采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50～100cfu）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
抑菌剂效力检查法指导原则抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。
如果药物本身不具有充分的抗菌活性，那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖，尤其是多剂量包装的制剂，避免因药物微生物污染及变质而对患者造成伤害。
在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的 GMP管理，不能作为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。
所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。
同时，为保证用药安全，最终包装容器中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度。
要求具有抗菌活性的制剂（参见制剂通则），不管是添加的抑菌剂，还是药物本身具有抗菌活性，在药物研发阶段，均应确认其抗菌效力。
抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而提高或降低，因此，应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。
本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。
产品分类需要进行本试验的药品分为四类（见表 1），以便标准的制定和执行。
表 1 产品分类类别1 类2 类3 类4 类培养基的制备药品注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于黏膜的乳剂口服非固体制剂（非抗酸制剂）非固体抗酸制剂培养基1. 胰酪胨大豆肉汤培养基酪蛋白胨 17.0g 磷酸二氢钾2.5g大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0 g 氯化钠5.0g葡萄糖 2.5g 水1000ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调 pH 约 7.0，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节 pH 使灭菌后为 7.3±0.2，分装，灭菌。
2. 胰酪胨大豆琼脂培养基除上述胰酪胨大豆肉汤培养基的处方和制法，加入 14.0g 琼脂，调 pH 使灭菌后为 7.3±0.2，分装，灭菌。
微生物实验室检测设备配置方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.1.1试验前的准备：4.1.1.1试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃,灭菌30 min,在3天内使用。
4.1.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制微生物实验室检测设备配置方案说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃, 灭菌15 min，在3周内使用。
4.1.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
一、目的：建立方法适用性检查用菌、阳性对照菌及验证用菌的制备及使用标准操作规程，为操作人员提供正确的操作规程。
二、范围：使用于供试品无菌检查及方法适用性试验，微生物限度检查及方法适用性试验，培养基适用性检查等所用菌液的制备。
三、职责：微生物实验室人员。
四、内容：1、简述:1.1、试验环境：应在环境洁净度C级下的局部洁净度A级的单向流空气区域内或生物安全柜中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
1.2、操作室的清洁与消毒应依照《洁净室(区)清洁、消毒标准操作规程》进行。
2、设备及仪器:2.1、阳性对照室2.2、生化培养箱2.3、压力蒸汽灭菌器2.4、微波炉2.5、玻璃器皿:锥形瓶、培养皿（90mm）、试管及塞、刻度吸管（0.1ml、1ml、5ml、10ml）锥形瓶等用前应洗涤干净。
刻度吸管口上端距0.5㎝处塞约2㎝的适宜疏松棉花，灭菌备用。
2.6、用具:接种环（铂金或镍铬合金，环径4～5㎜、长度6～10㎝）3、试液：3.1、消毒液: 0.1%苯扎溴铵溶液、0.1%醋酸氯已定溶液、CLBⅡ型消毒溶液（规格：0.65g/片）、75%乙醇溶液、杀孢子剂。
消毒液配制按《洁净室(区)清洁、消毒标准操作规程》进行。
3.2、试验用液: 0.9％无菌氯化钠溶液、PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、含0.05%（ml∕ml）聚山梨脂80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.05%（ml/ml）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液。
试验用液配制按《培养基及试验用液配制标准操作规程》进行。
4、培养基: 胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基。
培养基配制按《培养基及试验用液配制标准操作规程》进行。
5、菌种：所用的菌种传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代,一般使用2～5代的菌种），具体如下：金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕大肠埃希菌〔CMCC（B）44 102〕铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕乙型副伤寒沙门菌〔CMCC（B）50 094〕生孢梭菌〔CMCC（B）64 941〕枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕黑曲霉〔CMCC（F）98 003〕6、菌液制备:接种金黄色葡萄球菌、铜绿假胞单菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌的新鲜斜面培养物至胰酪大豆胨液体培养基中；接种生孢梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜斜面培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养24～72小时，观察上述培养物如生长良好，无菌分装约3ml/管（生孢梭菌上层加约1ml液状石蜡隔绝空气，造成厌氧环境），并取1管（其余至4～6℃冰箱冷藏保存，铜绿假胞单菌室温保存，在有效期内使用）用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%的无菌氯化钠溶液，采用10倍级系列稀释法制成每1ml含菌数小于100 cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
