2019年枯草芽孢杆菌菌悬液的制备

孢子悬液制备方法
制备孢子悬液的方法如下：
1. 取已培养好的斜面菌种一支，加入5ml无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬浮液置于已灭菌50ml三角瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻璃球，充分振摇后用灭菌的脱脂棉进行过滤，并用无菌水冲洗滤渣2~3次，最终使滤液体积达到，制得孢子悬浮液。

2. 用血球记数板测定孢子浓度。

制备好的孢子悬液可放置于2-8°C，在验证过的有效期内保存及使用。

以上步骤仅供参考，建议咨询专业人士获取更准确的信息。

一、实验目的本研究旨在探究芽孢杆菌的抑菌性能，通过体外实验方法，评估其对特定细菌和真菌的抑菌效果，为芽孢杆菌在生物防治、食品保鲜等领域的应用提供科学依据。

二、实验材料1. 实验菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）。

2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、沙堡培养基。

3. 实验仪器：恒温培养箱、电子天平、移液器、牛津杯、无菌水、无菌滤纸等。

三、实验方法1. 菌悬液的制备：将实验菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基和沙堡培养基中，37℃恒温培养24小时，然后用无菌水稀释至适宜浓度。

2. 抑菌实验：- 将牛肉膏蛋白胨培养基和沙堡培养基分别铺成平板。

- 在平板中央放置牛津杯，并加入适量实验菌株菌悬液。

- 将平板置于恒温培养箱中，37℃培养24小时。

- 观察并记录抑菌圈的大小。

四、实验结果1. 枯草芽孢杆菌对细菌的抑菌效果：- 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为15mm和12mm。

- 对枯草芽孢杆菌自身菌株无抑菌作用。

2. 枯草芽孢杆菌对真菌的抑菌效果：- 对白色念珠菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径为10mm。

- 对枯草芽孢杆菌自身菌株无抑菌作用。

五、讨论与分析1. 抑菌效果分析：- 本实验结果表明，枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌具有一定的抑菌效果，说明其具有一定的生物防治潜力。

- 抑菌效果与菌株的种类和浓度有关，本实验中枯草芽孢杆菌的抑菌效果较好，可能与菌株本身的抑菌物质和代谢产物有关。

2. 实验局限性：- 本实验仅针对部分细菌和真菌进行了抑菌实验，未涉及更多菌株，实验结果可能存在局限性。

- 实验条件可能影响抑菌效果，如温度、pH值等。

六、结论本实验结果表明，枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌具有一定的抑菌效果，为芽孢杆菌在生物防治、食品保鲜等领域的应用提供了理论依据。

常用菌悬液的制备、保存及使用方法摘要: 常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆...常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆形，染色均匀，芽孢椭圆形或圆柱形，位于菌体中央，革兰氏染色阳性，能运动。

培养特性：营养琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，灰黄色，边缘锯齿状，分离时应挑选粗糙形菌落。

普通肉汤培养基：呈少量浑浊并产生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜粘附于试管壁上。

最适宜培养温度30~37℃，生长温度范围：15~35℃，兼性厌氧或需氧。

抵抗力：菌体湿热55℃ 1小时被杀死，芽孢100℃ 3小时或120℃ 40分钟被杀死。

（2）铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10 104]形态与染色：革兰氏阴性杆菌。

菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。

培养特性：本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42℃，最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。

在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等。

在血平板上会有透明溶血环。

（3）白色念珠菌[CMCC(F) 98 001]形态与染色：本菌细胞呈圆形或卵圆形，很象酵母菌，直径3～6μm，比葡萄球菌大5～6倍，革兰阳性，但着色不均匀。

培养特性：本菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，37℃或室温孵育2～3日后，生成灰白乳酪样菌落，涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。

（4）金黄葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄串状，营养琼脂平板培养多呈短链状或双球状，无鞭毛，不能动，不产生芽孢，革兰氏染色阳性。

实验2灰色链霉菌的活化一、实验目的学习制备高氏一号斜面培养基的方法以及斜面接种技术。

二、实验原理高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，用于培养放线菌。

三、实验试剂与仪器1. 菌种：灰色链霉菌；2. 培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）；3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。

四、实验步骤1. 高氏一号培养基的制备（1）按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。

趁热分装于18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。

（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。

高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。

2. 斜面接种接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。

为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。

一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。

（1）左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。

（2）左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。

在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。

划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。

注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。

（3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。

接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。

（4）斜面置于28℃恒温箱中，培养5～6d观察结果。

实验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备一、实验目的学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。

真菌孢子悬浮液的制备
真菌孢子悬浮液的制备是一项常见的实验技术，通常用于研究真菌生长、营养、代谢及其与其他生物之间的相互作用。

以下是真菌孢子悬浮液制备的步骤：
1. 首先选择合适的真菌菌种，并在适宜的培养基上进行预培养。

2. 将真菌菌丝用无菌水或0.9%氯化钠溶液洗涤，去除外部污染物。

3. 用无菌水或0.9%氯化钠溶液将菌丝转移到无菌的容器中，并用显微镜检查，确保菌丝完整无损。

4. 用无菌的酸性缓冲液（pH 4.0-
5.0）或含有表面活性剂的缓冲液将菌丝打破，使孢子从菌丝中释放出来。

5. 将孢子悬浮液离心，去除残留的菌丝和杂质。

6. 用无菌缓冲液调整孢子悬浮液的浓度至所需的浓度。

7. 用显微镜检查孢子悬浮液的质量和浓度，并用无菌滴定管将其分装到无菌小瓶中。

8. 将孢子悬浮液冷藏保存，并在必要时使用。

以上是真菌孢子悬浮液制备的基本步骤，不同的真菌菌种和实验要求可能会有所不同，因此在进行实验前应仔细阅读相关文献并根据实际情况进行操作。

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枯草杆菌菌悬液的制备方法Preparing a Bacillus subtilis suspension involves several steps. First, prepare a liquid growth medium by combining appropriate nutrients, such as glucose, yeast extract, and peptone, with water. Then, sterilize the medium by autoclaving it at high pressure and temperature to kill any existing microorganisms. Once the medium has cooled, inoculate it with a pure culture of Bacillus subtilis and allow it to grow under optimal conditions, such as at a suitable temperature and pH. After incubation, harvest the bacterial cells by centrifugation, and resuspend them in a sterile solution to create the final suspension.制备枯草杆菌悬液涉及几个步骤。

首先，通过将适当的营养物质，如葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨与水混合，制备液体培养基。

然后，通过高压和温度下的高压灭菌使培养基无菌，以杀死任何现有的微生物。

一旦培养基冷却，用纯枯草杆菌菌种接种培养基，并在最佳条件下生长，如适宜的温度和pH值。

孵育后，通过离心法收获细菌细胞，并在无菌溶液中重悬它们以制备最终的悬液。

The first step in preparing a Bacillus subtilis suspension is to select an appropriate liquid growth medium. This medium should contain the necessary nutrients for the bacteria to grow and thrive. Common components of the medium include carbon sources like glucose, nitrogen sources such as yeast extract, and additional amino acids like peptone. These components provide energy and building blocks for the bacteria to carry out essential cellular processes during growth.制备枯草杆菌悬液的第一步是选择适当的液体培养基。

枯草芽孢杆菌常用培养基配方枯草芽孢杆菌常用培养基配方：1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂枯草芽孢杆菌原生质体的制备1 培养枯草芽孢杆菌取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。

2. 收集细胞各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。

如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。

3. 总菌数测定各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。

此为未经酶处理的总菌数。

4. 脱壁二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。

立即进行剩余菌数的测定。

5. 剩余菌数测定取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。

计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。

原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。

标准文件锦州九天药业有限责任公司1.0 目的：建立标准溶液的操作规程，确保检验结果的准确性。

2.0 适用范围：菌悬液配制操作。

3.0 责任：化验员、QC主任对实施本规程负责。

4.0 内容4.1 依据：《中国药典》2005年版（二部）附录。

4.2 菌悬液的种类4.2.1 枯草芽孢杆菌悬液4.2.1.1 试剂与试液：灭菌水4.2.1.2 操作步骤：取枯草芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面营养物,加灭菌水1～2ml将菌苔洗下,制成悬液,用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁营养瓶内,均匀摊布,在35～37℃培养7天.取菌苔少许涂片,革兰氏染色镜检,应有芽孢85%以上,用灭菌水10ml将芽孢洗下,制成芽孢悬液,合并至灭菌大试管内,在65℃水浴中加热30分钟将菌体杀死,待冷后置4℃冷藏箱贮藏.此菌液为浓菌液.日常试验用菌液取上述浓菌液,用灭菌水1:3稀释至灭菌试管中,冷藏箱保存备用.4.2.2 短小芽孢杆菌悬液4.2.2.1 试剂与试液：灭菌水4.2.2.2 操作步骤: 取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面营养物,加灭菌水1～2ml将菌苔洗下,制成悬液,用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁营养瓶内,均匀摊布,在35～37℃培养7天.取菌苔少许涂片,革兰氏染色镜检,应有芽孢85%以上,用灭菌水10ml将芽孢洗下,制成芽孢悬液,合并至灭菌大试管内,在65℃水浴中加热30分钟将菌体杀死,待冷后置4℃冷藏箱贮藏.此菌液为浓菌液.4.2.3 验证菌悬液4.2.3.1 试剂与试液4.2.3.2 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草牙孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中,白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中,培养18～24h;黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基,培养5～7天.用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含500～1000个cfu的菌悬液。

一、菌种提取（1）制备样品稀释溶液称取样品10g，放入盛有90ml无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min，使土样与水分混合，将细胞分散。

用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释度的土壤溶液。

（2）涂布用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。

（3）培养置于37℃温室培养箱，培养24h，固体培养基组成：蒸馏水1L,葡萄糖20g,蛋白胨15g,氯化钠5g,牛肉膏0.5g,琼脂20g二、菌种分离用接菌针挑取单个菌落，接菌到固体培养基。

培养24h。

固体培养基组成同上。

三、菌株生化鉴定1. 革兰氏染色（1）制片取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。

（2）初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。

（3）媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

（4）脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

*革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。

（5）复染用番红染液复染约2min，水洗。

（6）镜检干燥后，用油镜观察。

菌体被染成蓝紫色是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。

2. 芽孢染色：改良的Schaeffer-Fulton氏染色法（1）制备菌悬液：加1—2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。

专利名称：一种枯草芽孢杆菌的干悬浮剂及其制备方法专利类型：发明专利
发明人：刘永锋,孟祥坤,尹小乐,于俊杰
申请号：CN201310301606.4
申请日：20130718
公开号：CN103355290A
公开日：
20131023
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种枯草芽孢杆菌的干悬浮剂及其制备方法，包括有效活性成分、助剂和辅料，其特征在于，所述有效活性成分为枯草芽孢杆菌T500，所述助剂包括润湿剂、分散剂、粘结剂、崩解剂，所述干悬浮剂中枯草芽孢杆菌T500活菌量为6.80×10～8.61×10cfu/g。

制备方法是：将枯草芽孢杆菌T500菌株活化、移入种子罐中发酵培养、发酵罐中发酵培养，获得发酵液；将所述助剂中的润湿剂、分散剂、粘结剂、崩解剂以及辅料混合后与发酵液按0.15∶1的重量/体积比混合搅拌均匀；将混合物干燥即得到枯草芽孢杆菌的干悬浮试剂。

申请人：江苏省农业科学院
地址：210014 江苏省南京市钟灵街50号
国籍：CN
代理机构：江苏圣典律师事务所
代理人：孙忠浩
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