2010版药典增补本 阳性菌验证 菌悬液的制备

菌悬液的制备方法
菌悬液是一种用于培养微生物的液体培养基，它可以提供微生物生长所需的营养物质和水分。

制备菌悬液的方法相对简单，下面将介绍一种常用的菌悬液制备方法。

首先，准备所需材料和设备，蒸馏水、培养基粉末、试管或烧杯、移液管、称量器等。

然后，按照一定比例将培养基粉末加入到蒸馏水中。

通常情况下，培养基粉末的用量应根据所培养微生物的特性和需求来确定，一般建议按照厂家提供的配方比例进行配制。

在加入培养基粉末的过程中，需要充分搅拌使其充分溶解，以确保培养基的均匀性。

接着，将配制好的培养基溶液装入试管或烧杯中。

在装液体的容器上盖上适当的盖子或覆膜，以防止外界的污染和水分蒸发。

随后，对培养基溶液进行高温高压消毒。

将装有培养基溶液的容器放入高压灭菌锅中，进行121摄氏度、15分钟的高温高压消毒处理。

这一步骤是为了杀灭培养基中的细菌和真菌等有害微生物，以确保培养基的无菌性。

最后，将消毒后的培养基溶液冷却至室温。

在冷却过程中，需要注意避免外界的污染，以免影响培养基的质量。

待培养基溶液冷却至室温后，即可将其用于微生物的培养。

需要注意的是，制备菌悬液的过程中应严格遵守无菌操作规范，以确保培养基的质量和微生物培养的成功。

另外，在使用培养基前，应对其进行无菌性检测，以确保培养基的质量符合要求。

综上所述，菌悬液的制备方法并不复杂，但需要严格按照操作规范进行操作，以确保培养基的质量和微生物培养的成功。

希望本文介绍的菌悬液制备方法能够对您有所帮助。

磷酸盐标准缓冲液3个月标准缓冲液3个月醋酸盐缓冲液3个月磷酸盐缓冲液3个月醋酸--醋酸铵缓冲液3个月草酸氰钾缓冲液3个月氢氧化钠试液6个月碘试液6个月硝酸银试液6个月硝酸汞试液本液应置棕色瓶内,密闭保存6个月氨试液本液应置橡皮塞瓶中保存6个月硫化氰试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存2个月对二氨基苯甲醛试液6个月三氯化铁试液6个月碘化铋试液6个月氰化钾试液6个月溴化汞试液本液应置玻璃塞瓶内在暗处保存6个月亚铁氰化钾试液本液应临用新制亚硫酸氢钠试液本液应临用新制亚硫酸钠试液本液应临用新制亚硝基铁氰化钠试液本液应临用新制过氧化氢试液6个月次氯酸钠试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存6个月草酸试液6个月草酸铵试液6个月重铬酸钾试液6个月钼酸铵试液6个月铁氰化钾试液6个月稀铁氰化钾试液6个月浓氨试液3个月高锰酸钾试液6个月硅钨酸试液6个月铬酸钾试液6个月硝酸汞试液本液应置玻璃瓶内,在暗处保存。

6个月硫代乙酰胺试液6个月硫代硫酸钠试液6个月硫氰酸铵试液6个月硫酸亚铁试液本液应临用新制。

硫酸钾试液6个月硫酸铜试液6个月硫酸镁试液6个月稀硫酸镁试液6个月氯化亚锡试液6个月氯化钙试液6个月氯化钡试液6个月氯化钴试液6个月氯化铵试液6个月碘化钾试液6个月碘化钾碘试液6个月溴化钾溴试液6个月碱性枸椽酸铜试液6个月碱性酒石酸铜试液6个月碱酸焦性没食子酸试液6个月碳酸氢钠试液6个月碳酸钠试液6个月碳酸钾试液6个月碳酸铵试液6个月醋酸钠试液6个月醋酸铅试液6个月醋酸铵试液6个月醋酸铜试液6个月靛胭脂试液6个月亚硝基铁氰化钠液6个月标准氯化钠液临用前精密量取贮液10ml,用滤纸过滤时滤纸是含有氯化物;可预先用含有硝酸的水溶液洗净后使用。

储备液6个月结晶紫指示液6个月饱和硫化氢水溶液3个月标准铅液临用前精密量贮备液10ml。

(配制与贮存用的玻璃容器均不得含铅储备液6个月黄色调比色液(1号基础液) 12个月浊度标准贮备液本液置冷处避光保存可在两个月内使用,用前摇匀。

常用菌悬液的制备、保存及使用方法摘要: 常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆...常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆形，染色均匀，芽孢椭圆形或圆柱形，位于菌体中央，革兰氏染色阳性，能运动。

培养特性：营养琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，灰黄色，边缘锯齿状，分离时应挑选粗糙形菌落。

普通肉汤培养基：呈少量浑浊并产生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜粘附于试管壁上。

最适宜培养温度30~37℃，生长温度范围：15~35℃，兼性厌氧或需氧。

抵抗力：菌体湿热55℃ 1小时被杀死，芽孢100℃ 3小时或120℃ 40分钟被杀死。

（2）铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10 104]形态与染色：革兰氏阴性杆菌。

菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。

培养特性：本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42℃，最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。

在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等。

在血平板上会有透明溶血环。

（3）白色念珠菌[CMCC(F) 98 001]形态与染色：本菌细胞呈圆形或卵圆形，很象酵母菌，直径3～6μm，比葡萄球菌大5～6倍，革兰阳性，但着色不均匀。

培养特性：本菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，37℃或室温孵育2～3日后，生成灰白乳酪样菌落，涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。

（4）金黄葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄串状，营养琼脂平板培养多呈短链状或双球状，无鞭毛，不能动，不产生芽孢，革兰氏染色阳性。

大肠杆菌斜面
金黄色葡萄球菌斜面
生孢梭菌 需气菌、厌气菌培养基
白色念珠菌 真菌培养基
各类菌种保藏条件及时间
菌种 培 养 基 一般多用于营养琼脂 或根据菌种规定选用 培养基
保存温 度
传 种 时 间
细菌
4~6℃
芽 孢 杆 菌 3~6 个 月 ， 其它细菌每个月
酵母菌
一般用麦芽汁琼脂或 麦芽汁酵母膏琼脂 一 般 用 PDA 琼 脂 、 蔡 氏琼脂或麦芽汁琼脂 等
•
堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼 脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环 伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接 种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜 面的表面上。 • 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵 上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼 灭菌。 • 将已接种毕的细菌管置35~37℃培养22~24 小时，霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培 养7日。取出后放人冰箱保存，一般 3个月转 种一次。
1.琼脂斜面低温保存法
（1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接 种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上， 按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把 培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养 基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏 管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱 中保藏。每隔 2~3个月移种一次，继续进行保 藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可 保藏半年 ~ 一年。有的甚至更长时间。 （2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。
菌种
菌种 工作菌种培养 基 营养琼脂斜面 营养琼脂斜面 营养琼脂斜面 营养琼脂斜面
硫乙醇酸盐培养 基
菌悬液
对照菌液
0.9% 氯 化 钠 溶 液
0.9% 氯 化 钠 溶 液 0.9% 氯 化 钠 溶 液 0.9% 氯 化 钠 溶 液 0.9% 氯 化 钠 溶 液 0.9% 氯 化 钠 溶 液

015-2010版中国药典培训回答（第3部分：无菌检查1）1、供试品传入无菌，对表面进行消毒。

用75%无菌酒精浸泡表面是否可行？可用如何方法。

（等紫外照射1h 酒精喷射，是否可行？注：无缓冲间的情况。

从一般区直接进入传递窗）答：用75%无菌酒精浸泡表面应该可行，但酒精易燃。

可用普通消毒剂如新洁尔灭等消毒。

2、无菌实验供试品在传入无菌传递窗前能否泡消毒液？答：视包装而定。

如：玻璃安瓿，可以；西林瓶，不可以。

3、检验针剂时，安瓿表面消毒可否用碘液浸泡作为消毒，如果可以，它会杀死样品本身的微生物吗？答：我们没有碘液浸泡消毒的经验。

就浸泡方式而言，视包装而定，如：玻璃安瓿，可以；西林瓶，不可以。

4、微生物检查样品传递消毒处理，需作验证吗?如何确定其消毒效果？答：验证当然最好，但也应结合常识、经验等，尽量减低工作量。

5、药典要求只要供试品的特性允许优先考虑薄膜过滤法。

对于小剂量无抑菌作用的注射剂，是直接接种法好还是薄膜过滤法好？答：优先考虑薄膜过滤法，可视样品包装情况而定。

6、无菌检查验证，2010年版方法改变，变换了大肠埃希杆菌，请问从前经过验证的无菌检查方法，实施2010年药典时是否必须从新的验证方法进行验证？验证后从能进行无菌检查？答：应重新验证。

7、如果产品经无菌验证后，是以大肠为对照菌时，可行吗？答：如果验证6种菌均可行，建议按药典阳性对照章节的要求，设定阳性对照菌。

如果验证结果样品是抗革兰阴性菌的，则阳性菌应用大肠埃希菌。

8、无菌制剂的处方与工艺都没有改变，10版药典出版是否还需重新验证？答：10版用大肠埃希替代铜绿假单胞，应重新验证。

9、05版我们已经做了方法验证，10版还要再做方法验证吗？答：如前所述。

10、做阳性对照，为什么同是做5批检样，到最后只是两到三批长菌？原因出在哪？滤膜吗？（我们是做抗菌素的产品）答：原因是多方面的。

请考虑方法的耐用性；此外，操作前后是否一致（比如：供试品溶液溶解是否彻底、供试品溶液的浓度是否一致、对滤膜滤筒的湿润、每次过滤对滤筒的荡洗、抽干、抽干是否过久等等）等等都有可能是影响因素。

真菌孢子悬浮液的制备
真菌孢子悬浮液的制备是一项常见的实验技术，通常用于研究真菌生长、营养、代谢及其与其他生物之间的相互作用。

以下是真菌孢子悬浮液制备的步骤：
1. 首先选择合适的真菌菌种，并在适宜的培养基上进行预培养。

2. 将真菌菌丝用无菌水或0.9%氯化钠溶液洗涤，去除外部污染物。

3. 用无菌水或0.9%氯化钠溶液将菌丝转移到无菌的容器中，并用显微镜检查，确保菌丝完整无损。

4. 用无菌的酸性缓冲液（pH 4.0-
5.0）或含有表面活性剂的缓冲液将菌丝打破，使孢子从菌丝中释放出来。

5. 将孢子悬浮液离心，去除残留的菌丝和杂质。

6. 用无菌缓冲液调整孢子悬浮液的浓度至所需的浓度。

7. 用显微镜检查孢子悬浮液的质量和浓度，并用无菌滴定管将其分装到无菌小瓶中。

8. 将孢子悬浮液冷藏保存，并在必要时使用。

以上是真菌孢子悬浮液制备的基本步骤，不同的真菌菌种和实验要求可能会有所不同，因此在进行实验前应仔细阅读相关文献并根据实际情况进行操作。

- 1 -。

重组人粒细胞刺激因子注射液2. 1.3. 7质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符。

2. 1.3. 8目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。

2.2原液2.2.1种子液制备将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。

2.2.2发酵用培养基采用适宜的不含抗生素的培养基。

2.2.3种子液接种及发酵培养2. 2.3.1在灭菌培养基中接种适量种子液。

2. 2.3. 2在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发 酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、p H值、溶解 氧、补料、发酵时间等。

发酵液应定期进行质粒丢失率检查(附录IX G)02.2.4发酵液处理用适宜的方法收集、处理菌体。

2.2.5 初步纯化采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。

2. 2. 6高度纯化经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行髙度纯化，使其达到3.1项要求，即为重组人粒细胞刺激因子原液。

加人适宜稳定剂，除菌过滤后于适宜温度下保存，并规定其有效期。

2. 2. 7原液检定按3.1项进行。

2. 3半成品2.3.1配制与除菌2. 3. 1. 1稀释液配制按经批准的配方配制稀释液。

配制后应立即用于稀释。

2. 3. 1.2稀释与除菌将检定合格的重组人粒细胞刺激因子原液用2. 3. 1. 1项稀释液稀释至所需浓度。

除菌过滤后即为半成品，保存于2〜8。

2.3.2半成品检定按3. 2项进行。

2. 4成品2. 4. 1分批应符合“生物制品分批规程”规定。

2. 4. 2分装应符合“生物制品分装和冻干规程”及附录I A有关规定。

2. 4. 3规格应为经批准的规格。

2. 4. 4包装应符合“生物制品包装规程”及附录I A有关规定。

3检定3. 1原液检定3. 1. 1生物学活性依法测定（附录X E)。

3.1.2蛋白质含量依法测定（附录YI B第二法）。

3. 1. 3比活性为生物学活性与蛋白质含量之比，每lm g蛋白质应不低于6. 0X107IU…3.1.4纯度3.1.4.1电泳法依法测定（附录W C)。

微生物限度检查法一、细菌、霉菌和酵母菌计数１简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。

也是用于评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。

以在琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。

该法测定结果只反映在该规定条件下所生长的细菌（为一群嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。

不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。

一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。

因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity，cfu），不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。

2 设备、仪器2.1 设备2.1.1 洁净实验室微生物限度检查应有单独的洁净实验室，每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。

2.1.1.1 结构和要求洁净实验室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。

操作间与缓冲间之间应有样品传递舱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。

洁净实验室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。

墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。

操作间内不应安装下水道。

洁净实验室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300LX。

2.1.1.2 温度、湿度洁净实验室内的温度应控制在18～26℃，相对湿度最好在40％～60％。

2.1.1.3 操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。

洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。

操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于10Pa，操作间与缓冲间也应保持相对正压，不低于5Pa。

操作台上备有药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。

常用菌悬液的制备、保存及使用方法摘要：常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征(1)枯草芽抱杆菌［CMCC(B) 63 501］形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆...常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征(1 )枯草芽抱杆菌［CMCC(B) 63 501］形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆形，染色均匀，芽抱椭圆形或圆柱形，位于菌体中央，革兰氏染色阳性，能运动。

培养特性：营养琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，灰黄色，边缘锯齿状，分离时应挑选粗糙形菌落。

普通肉汤培养基：呈少量浑浊并产生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜粘附于试管壁上。

最适宜培养温度30~37 C,生长温度范围：15〜35 C,兼性厌氧或需氧。

抵抗力：菌体湿热55 C 1小时被杀死，芽抱100 C 3小时或120 C 40分钟被杀死。

(2 )铜绿假单胞菌［CMCC(B) 10 104］形态与染色：革兰氏阴性杆菌。

菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。

培养特性：本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42 C,最适生长温度为25~30 C,特别是该菌在4C不生长而在42 C可以生长的特点可用以鉴别。

在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素( pyocynin )与带荧光的水溶性荧光素( pyoverdin )等。

在血平板上会有透明溶血环。

(3) 白色念珠菌［CMCC(F) 98 001］形态与染色：本菌细胞呈圆形或卵圆形，很象酵母菌，直径 3 ~ 6(_im ,比葡萄球菌大5 ~ 6倍，革兰阳性，但着色不均匀。

培养特性：本菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，37 C或室温孵育2〜3日后，生成灰白乳酪样菌落，涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。

(4) 金黄葡萄球菌［CMCC(B) 26 003］形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄串状，营养琼脂平板培养多呈短链状或双球状，无鞭毛，不能动，不产生芽抱，革兰氏染色阳性。

中国药典2010年版 微生物检验增修订概况浙江省食品药品检验所 王知坚 中国医药生物技术协会 20110330ƒ 中国药典2010年版微生物检验增修订概况 ƒ 药品微生物检验实验室关注的重点 ƒ 微生物检验有关问题的答复2中国药典2010年版微生物检验增修订概况3ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ无菌检查法 微生物限度检查法 灭菌法 抑菌剂效力检查法指导原则 药品微生物检验替代方法验证指导原则 微生物限度检查法应用指导原则 药品微生物实验室规范指导原则42010年版中国药典无菌检查法 主要增修订内容及增修订的理由ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ 前言部分 培养基 灵敏度检查 稀释液、冲洗液等 方法验证 供试品的无菌检查 培养及观察 结果判断 表1、表2和表35ƒ 前言部分¾ 规定了防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出ƒ 为了避免出现假阴性的结果¾ 规定了日常检验还需要对环境进行监控 ƒ 为了正确判断检验结果，需要对检验过程各个环节 的符合性提供证据。

需要指出的是这里所指的环境 应该是一个广义的概念，它包括影响无菌检查结果 准确的各个关键要素 ¾ 对无菌检查的人员资质提出了要求 ƒ 为了提高操作人员和管理人员正确执行药典规定的 能力6ƒ 培养基删除了硫乙醇酸盐流体培养基用于培养好氧菌、厌氧 菌的规定 ¾ 删除了改良马丁培养基用于培养真菌的规定 ¾ 删除选择性培养基 项下加入适量中和剂或表面活性剂 后面的 “ 如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品）、聚山 梨酯80（用于非水溶性供试品）或β-内酰胺酶（用于 β-内酰胺类供试品）”等说明。

修订为：“在培养基灭 菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性 剂，其用量同验证试验。

”（中和剂、灭活剂见微生物 限度检查法中表1）¾ƒ 不同的产品在使用选择性培养基时，对中和剂、灭活剂或表面活性剂的使用是不同的，需要在药典中予以规定和明确。

同样要进行培养基的适用性检查： 菌种：同微生物限度检查法 菌液的制备：同微生物限度检查法（计数培养基） 结果判断：同微生物限度检查法（回收率应达70%； 菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致）
抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则
测定方法
菌种：同培养基的适用性检查。若需要，制剂中常见的污 染微生物也可作为试验菌株。
结果判断： 检出试验菌——该供试品可用此法 未检出试验菌——消除供试品抑菌活性，重新验证
抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则
为什么？
——防止制剂在正常贮藏和使用 过程中可能发生的微生物污染和繁殖 使药物发生变质而对使用者造成危害， 尤其是多剂量包装的制剂。
抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则
用途：测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性 目的：1、评价最终产品的抑菌效力
2、检查产品在有效期内抑菌剂的效 力是否符合要求
3、指导生产企业在制剂研发阶段确定 抑菌剂的浓度
抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则
宗旨：1、不管是添加的抑菌剂，还是药物本身 具有抗菌活性，在药物研发阶段，均 应确认其抗菌效力。
2、应验证最终容器中的抑菌剂效力在有 效期内不因贮藏条件而降低。
3、制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。 同时，为保证用药安全，最终包装容 器中的抑菌剂有效浓度应低于对人体 有害的浓度。
抑菌剂（防腐剂）效力检查法指导原则
结果计算：根据菌数测定结果，计算1ml或g供 试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数， 并换算成lg值
效力判断：根据各间隔时间的菌数lg值相对于初 始值（0时菌数lg值）减少程度进行评价
方法消除供试品的抑菌活性
控制菌检查用培养基的适用性检查
检查项目：促生长能力、指示能力、抑制能力

无菌检查方法（中国药典2010版）验证方案验证方案编号：起草单位(Composed by)：质检部(QC Department)起草人(Composer)：日期(Date)：审核人(Reviewed by QC)：日期(Date)：审核人(Reviewed by QA)：日期(Date)：批准人(Approved by)：日期(Date)：目录1. 验证目的2. 验证人员3. 验证依据及参考文件4. 仪器与设备5. 验证过程5.1 培养基及稀释液5.2 菌液的培养与制备5.3 方法验证试验6. 验证总结1. 验证目的：本试验是注射液的抑细菌、抑真菌活性及所用的无菌检查方法的可靠性进行验证，以确认该产品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除至可以忽略。

即：保证所用的无菌检验方法能对该产品进行准确、可靠的检验。

2. 验证人员：验证小组组长：验证小组副组长：验证小组成员：3. 验证依据及参考文件：验证依据：中华人民共和国药典2010版二部参考文件：2010年版中国药典无菌检查方法、验证操作学习班讲稿汇编（中国药品检验所）4. 仪器与设备XG1.DM-0.36B型机动门脉冲真空灭菌器细菌培养箱霉菌培养箱净化工作台5. 验证过程：5.1 培养基及稀释液5.1.1 培养基及稀释液的配制按“中国药典2010版二部附录Ⅺ H无菌检查法”中，有关规定配制本验证所需培养基:5.1.2培养基的适用性检验5.1.2.1 培养基无菌性检查从以上培养基及稀释液中，每批随机取5支（瓶），培养14天，应无菌生长。

结果记录：结论：5.1.2.2 培养基灵敏度检查取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天，逐日观察结果。

取每支装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。

3、新增验证试验存在问题及处理方法
（1）存在问题 在进行验证试验中经常遇 到一些问题，如被检培养基上的菌落 平均数小于对照培养基菌落平均数的 70％，菌落形态、大小与对照培养基 70％，菌落形态、大小与对照培养基 上不一致，验证试验微生物回收失败。 若没有适宜的方法消除供试品的抑菌 作用，那么验证试验中微生物回收的失败 可看成是：
（2）培养时间修改内容 除另有规定外，细菌培养48小 除另有规定外，细菌培养48小 时改为3天，霉菌、酵母菌培养72小 时改为3天，霉菌、酵母菌培养72小 时改为5 时改为5天，必要时，可适当延长培 养时间至7 养时间至7天进行菌落计数并报告
菌数报告规则
1、若同稀释级两个平板的菌落平均数不 小于15，则两个平板的菌落数不能相差 小于15，则两个平板的菌落数不能相差 1倍或以上。 2、细菌、酵母菌平均菌落数在30~300 、细菌、酵母菌平均菌落数在30~300 之间的稀释修改为选取菌落数小于 300cfu、霉菌宜选取30~100之间的稀 300cfu、霉菌宜选取30~100之间的稀 释级修改为霉菌宜选取平均菌落数小于 100cfu的稀释级作为菌数报告的依据。 100cfu的稀释级作为菌数报告的依据。
2、含抑菌作用供试品，增加了可 加入适量无菌中和或灭活剂，或 加大每个容器的培养基用量。供 试品检查时培养基的用量和高度 同方法验证试验 3、删除β-内酰胺或磺氨类供试品 、删除β
表1、表2、表3增修订 、表2、表3
表1（第3列）接种每种培养基改为所需的最少检验数量 （第3 表2（表题）上市抽验样品（液体制剂）的最少检验数量 修改为液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少 检查数量 第二列每支样品接入每管培养基的最少样品量修改为每 支供试品接入每管培养基的的最少样品量 第三列最少检验数量（瓶或支）≤1全量20①修改为供 第三列最少检验数量（瓶或支）≤ 全量20 试品最少检验数量（瓶或支）10 试品最少检验数量（瓶或支）10 ① 注 ① 每种培养基各接种10支供试品修改为若供试品每 每种培养基各接种10支供试品修改为若供试品每 个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的 最少检验数量加倍。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610816495.4(22)申请日 2016.09.09(71)申请人 深圳市泽青源科技开发服务有限公司地址 518000 广东省深圳市前海深港合作区前湾一路鲤鱼门街1号前海深港合作区管理局综合办公楼A栋201室（入驻深圳市前海商务秘书有限公司）(72)发明人 彭志立　黄梦婷　陈强　(74)专利代理机构 深圳市精英专利事务所44242代理人 任哲夫(51)Int.Cl.C12N 1/14(2006.01)A23L 31/00(2016.01)C12R 1/645(2006.01)(54)发明名称一种真菌菌悬液的制备方法及其应用(57)摘要本发明属于生物领域，具体涉及一种真菌菌悬液的制备方法及其应用。

所述方法包括如下步骤：1)制备液体菌种；2)过滤、洗脱；3)加水粉碎，即得菌悬液。

本发明制得的菌悬液菌丝活力强、萌发点多、菌龄一致，生产周期短，污染风险小，生产成本低，经济效益好。

本发明所述方法克服了传统的固体菌种、液体菌种及现有的固种液化菌种的缺点；制得的菌悬液除用于接种生产外，还可用于液体菌种的制备；具有极大的市场前景和经济价值。

权利要求书1页 说明书3页CN 106399125 A 2017.02.15C N 106399125A1.一种真菌菌悬液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)制备液体菌种：取母种接种于灭菌冷却的液体培养基，摇床培养，得到液体菌种；2)过滤洗脱：将步骤1)所得液体菌种过筛，洗脱，得到纯菌丝球；3)加水粉碎：将步骤2)所得的菌丝球加入无菌水粉碎，得到菌悬液备用。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述菌丝球与所述无菌水的质量比为1：100。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述摇床培养的温度为20-25℃，摇床转速为180-220rpm。

真菌孢子悬浮液的制备真菌孢子悬浮液是一种常见的实验室技术，可以用于真菌生长条件的研究、真菌抗菌试验等多种研究领域。

制备过程不是很复杂，但需要仔细操作、选用正确的培养基和保证无菌操作的条件。

接下来，本文将为大家介绍真菌孢子悬浮液的制备过程。

材料和试剂﹣真菌菌株﹣蒸馏水﹣无菌理化盐水﹣无菌的平板培养基﹣无菌培养瓶﹣灭菌的微量棉塞和吸管步骤1.准备工作首先，准备好工作空间和必要的仪器和试剂。

确保所有涉及到的仪器和培养基、溶液均为无菌状态。

使用无菌的工具和设备进行操作，如无菌塞、吸管等。

2.从菌株收集孢子将真菌菌株接种于无菌平板培养基上，在适宜培养条件下培养4-7天。

待菌丝生长到适当的长度后，用少量的理化盐水冲洗，收集菌丝。

将菌丝在无菌的平板培养基上连续传代2-3次，直至菌丝生长繁茂。

利用不同的方法可收集孢子，例如将菌丝移植到无菌的液体培养基上，使其在较长时间内生长，并在适合的环境下促进孢子的形成。

3.孢子数的测定使用一个细胞计数器来测定每毫升真菌孢子的数量。

如果没有细胞计数器，可以使用显微镜进行计数。

子可使用增倍显微镜系统对孢子进行定量。

4.制备悬浮液经过孢子的数量测定后，将孢子加入无菌的理化盐水，将其变为悬浮液。

根据试验的要求，孢子的浓度可以根据需要调整。

一般情况下，5×10^6-1×10^8个孢子/ml的悬浮液为常用浓度。

5.保存和存储悬浮液将制备好的悬浮液分装于无菌的培养瓶中，加上无菌的微量棉塞或吸管，存放在常温下或进行制冷保存，如保存在4°C的冰箱中。

为了能保持孢子的完整性和无菌状态，不要进行摇动、振荡或剧烈搅动。

总结真菌孢子悬浮液的制备不是很复杂，但需要进行严格的无菌操作，备用设备和试剂均需无菌状态。

正确的制备孢子悬浮液，可保证下一步实验结果的可靠性和准确性，为真菌的进一步研究提供了重要的技术支持。

真菌孢子悬浮液的制备
真菌孢子悬浮液的制备是一种常见的实验操作，主要用于菌株的保存、传输或者研究。

制备方法简单，需要准备好适当的培养基和实验设备，操作过程中需要注意无菌操作。

制备步骤如下：
1.选取所需真菌菌株，并在含有适当营养成分的固体培养基上进行预培养。

2.将预培养好的菌株取出，用无菌的生理盐水或0.9%的氯化钠溶液洗涤去除培养基。

3.将洗涤干净的菌株移入含有适当营养成分的液体培养基中，静置培养室中，保持适当的培养条件，如温度、pH值等。

4.在培养过程中，观察菌落生长情况，待菌落生长到一定程度后，将其收集到无菌容器中。

5.将菌落用生理盐水或0.9%的氯化钠溶液进行洗涤，将菌落重悬于含有适当营养成分的液体培养基中，制备真菌孢子悬浮液。

6.悬浮液制备完成后，可以用无菌滤纸过滤去除大颗粒杂质，再用离心机离心沉淀，将上清液收集到无菌容器中，即可得到纯净的真菌孢子悬浮液。

制备好的真菌孢子悬浮液可以通过冷冻保存或干燥保存的方式
进行长期保存。

在实验中使用时，可以根据需要进行适当稀释，用于菌株的传输、保存或研究等。

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•菌悬液和菌片的制备♦收藏转发2008-09-0815:39:23分类：个人日记浏览(727)评论(0)•2.1.1.2.1适用范围制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片，以供消毒剂杀菌试验时使用。

2.1.1.2.2试验器材(1)菌种：金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC15442、大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种ATCC9372、龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉菌ATCC16404。

在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。

(2)有机干扰物：见附录Ao(3)磷酸盐缓冲液：见附录Ao(4)无菌蒸储水。

(5)稀释液：见附录Ao(6)细菌培养基：胰蛋白月东大豆琼脂培养基(TSA),胰蛋白月东大豆肉汤培养基(TSB)等，见附录Ao(7)革兰染色液：见附录Ao(8)芽抱染色液：见附录Ao(9)恒温水浴箱。

(10)玻璃漏斗。

(11)刻度吸管(1.0ml、5.0ml、10.0ml),毛细吸管。

(12)数字可调移液器(10口，20口，100口，200口，1000口)及配套用一次性塑料吸头。

(13)离心机。

(14)电动混合器（15）浊度计。

2.1.1.2.3细菌悬液制备程序（1）细菌繁殖体悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。

取含5.0ml〜10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37c培养18h〜24h。

用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37c培养18h〜24h。

挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37C培养18h〜24h,即为第3代培养物。

2）取菌种第3代〜14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h〜24h）,用5.0ml吸管吸取3.0ml〜5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。