常用菌悬液的制备、保存及使用方法及常用溶液保存期限

微生物检验实验室菌种保存程序1．目的规范菌种保存程序。

2．范围微生物实验室保存的标准菌种和来自临床的标本菌株。

3．职责微生物实验室检验人员正确执行本程序。

4．程序4.1需氧菌保存法4.1.1一般保存法见表6-1表6-1 常见菌种培养基保存期限保存时保存温培养时菌种培养基间度间脱纤维羊血或脱脂牛流感嗜血杆菌 6-20个月18-24奶血琼脂斜面（高层加葡萄球菌、链球菌 18-24 4—8 1—3年液体石蜡）酪蛋白琼脂Soxbean肠杆菌科 18-24 4—8 1年（高层加液体石蜡）+4牛肉汤（6份肉汤肠杆菌科、非发酵 6-20个月胰大豆10%18-24 份甘油或菌、葡萄球菌等甘油）10%-15%肉汤或．苛养菌 18-24 5%小牛血清肉汤 -20 6个月罗氏培养基（加液体3个月18-24分枝杆菌 4—8石蜡）心脑浸液或布氏肉汤幽门螺杆菌 18-24 -70 6年加入甘油注：保存郡主均需培养18~24h。

4.1.2 冷冻干燥法将待保存菌培养18~24小时后，挑取菌落加入一定量的牛肉汤或心脑浸出液加入20%的蔗糖，混匀，分装于安瓿中，置-70℃低温冰箱中迅速冻结，再放入冷冻干燥机内，抽真空16~24小时，然后将安瓿封口，置低温冰箱保存。

大多数菌株可保存10年以上，甚至更长。

4.1.3 超冰冻法保存菌株初代培养18~24小时的菌落、菌苔，加入0.5~1.0ml无菌脱纤维羊血安瓿中，封口，置液氮或-40℃冰箱中保存。

4.2 厌氧菌保存法4.2.1短期保存方法4.2.1.1疱肉培养基保存法用牛肉渣和牛肉浸出液制成疱肉培养管，接种待保存菌株，然后覆盖1~2cm的石蜡，再将培养管垂直放置片刻，待石蜡凝固置35℃培养（无芽胞厌氧菌培养72小时，普通梭菌培养24小时，产气荚膜梭菌和多枝梭菌培养2周左右），最后置室温或-20℃保存。

发酵个3~6次，不发酵糖类的厌氧菌1糖类的厌氧菌每个月转钟月转钟1次。

4.2.1.2 半固体培养基保存法在上述液体培养基中加入.0.2%~0.5%琼脂，制成半固体培养基，接种时用毛细管将待保存的厌氧菌的菌液加入半固体培养管底，表面加入1~2cm厚度的液体石蜡，密封管口，培养48小时，置室温或-20℃保存。

几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。

是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。

1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。

加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。

将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。

1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。

斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。

分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。

1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。

1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。

无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。

适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。

2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。

适用于细菌和酵母菌等。

磷酸盐标准缓冲液3个月标准缓冲液3个月醋酸盐缓冲液3个月磷酸盐缓冲液3个月醋酸--醋酸铵缓冲液3个月磷酸盐缓冲液3个月草酸氰钾缓冲液3个月氢氧化钠试液6个月碘试液6个月硝酸银试液6个月硝酸汞试液本液应置棕色瓶内,密闭保存6个月氨试液本液应置橡皮塞瓶中保存6个月硫化氰试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存2个月对二氨基苯甲醛试液6个月三氯化铁试液6个月碘化铋试液6个月氰化钾试液6个月溴化汞试液本液应置玻璃塞瓶内在暗处保存6个月亚铁氰化钾试液本液应临用新制亚硫酸氢钠试液本液应临用新制亚硫酸钠试液本液应临用新制亚硝基铁氰化钠试液本液应临用新制过氧化氢试液6个月次氯酸钠试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存6个月草酸试液6个月草酸铵试液6个月重铬酸钾试液6个月盐酸羟胺试液6个月钼酸铵试液6个月铁氰化钾试液6个月稀铁氰化钾试液6个月浓氨试液3个月高锰酸钾试液6个月硅钨酸试液6个月铬酸钾试液6个月硝酸汞试液本液应置玻璃瓶内,在暗处保存。

6个月硫代乙酰胺试液6个月硫代硫酸钠试液6个月硫氰酸铵试液6个月硫酸亚铁试液本液应临用新制。

硫酸钾试液6个月硫酸铜试液6个月硫酸镁试液6个月稀硫酸镁试液6个月氯化亚锡试液6个月氯化钙试液6个月氯化钡试液6个月氯化钴试液6个月氯化铵试液6个月碘化汞钾试液6个月碘化钾试液6个月碘化钾碘试液6个月溴化钾溴试液6个月碱性枸椽酸铜试液6个月碱性酒石酸铜试液6个月碱酸焦性没食子酸试液6个月碳酸氢钠试液6个月碳酸钠试液6个月碳酸钾试液6个月碳酸铵试液6个月醋酸钠试液6个月醋酸铅试液6个月醋酸铵试液6个月醋酸铜试液6个月靛胭脂试液6个月亚硝基铁氰化钠液6个月标准氯化钠液临用前精密量取贮液10ml,用滤纸过滤时滤纸是含有氯化物;可预先用含有硝酸的水溶液洗净后使用。

储备液6个月结晶紫指示液6个月饱和硫化氢水溶液3个月标准铅液临用前精密量贮备液10ml。

(配制与贮存用的玻璃容器均不得含铅储备液6个月黄色调比色液(1号基础液) 12个月浊度标准贮备液本液置冷处避光保存可在两个月内使用,用前摇匀。

菌种的接种及菌悬液制备操作程序一、菌种的接种：1、菌种的复苏：1.1 把冻干菌种管、灭菌1ml毛细滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或超净工作台。

1.2 将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。

点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使冷而炸裂。

1.3 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取一支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面置35～37℃培养22～24小时。

1.4 取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3代即可应用。

如发现菌形不典型，可进行平板分离单菌落。

2、菌种的接种：2.1 准备需用的培养基，培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。

标签上注明菌名及接种日期。

自冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。

2.2 点燃酒精或其他灯，在左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30分钟，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。

右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拨开棉塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管品移至火焰旁。

堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。

2.3 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。

2.4 将已接种毕的细菌管置35～37℃培养22～24小时，霉菌管一般置24～25℃霉菌培养箱内培养7日。

菌种保藏几种常用的保藏方法：1、传代培养法保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。

可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。

2、载体法使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。

常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。

3、悬液法将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。

溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。

4、冷冻法使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。

包括低温法和液氮法。

此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。

注意控制降温速率及保护剂的使用。

5、真空干燥法这类方法包括冷冻真空干燥法和L－干燥法。

冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。

L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10－20C˚范围内进行真空干燥。

操作方法1、斜面保藏法将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。

保藏时间依微生物的种类而定。

霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。

此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。

2、液体石蜡保藏法将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。

将试管直立，置低温或室温下保存。

此法实用且效果较好。

霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。

3、穿刺保藏法按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4℃冰箱存放。

4、砂土管保藏法（1）河砂处理取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。

倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。

（2）土壤处理取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

常用菌悬液的制备、保存及使用方法摘要: 常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆...常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆形，染色均匀，芽孢椭圆形或圆柱形，位于菌体中央，革兰氏染色阳性，能运动。

培养特性：营养琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，灰黄色，边缘锯齿状，分离时应挑选粗糙形菌落。

普通肉汤培养基：呈少量浑浊并产生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜粘附于试管壁上。

最适宜培养温度30~37℃，生长温度范围：15~35℃，兼性厌氧或需氧。

抵抗力：菌体湿热55℃ 1小时被杀死，芽孢100℃ 3小时或120℃ 40分钟被杀死。

（2）铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10 104]形态与染色：革兰氏阴性杆菌。

菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。

培养特性：本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42℃，最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。

在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等。

在血平板上会有透明溶血环。

（3）白色念珠菌[CMCC(F) 98 001]形态与染色：本菌细胞呈圆形或卵圆形，很象酵母菌，直径3～6μm，比葡萄球菌大5～6倍，革兰阳性，但着色不均匀。

培养特性：本菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，37℃或室温孵育2～3日后，生成灰白乳酪样菌落，涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。

（4）金黄葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄串状，营养琼脂平板培养多呈短链状或双球状，无鞭毛，不能动，不产生芽孢，革兰氏染色阳性。

实验12 常用菌种保存技术返回目录为保持细菌原有的性状和活力，通过人为方法提供一定的条件，使细菌在低温、干燥、缺氧的环境中，生长受到抑制、新陈代谢处于最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保存菌种的目的。

保存菌种的方法有很多，如斜面保存法、液体石蜡法、干燥保存法、液氮法、冷冻真空干燥法等。

这里仅介绍斜面保存法、液体石蜡法、冷冻真空干燥法。

一、斜面保存法【试剂与器材】1．菌种待保存的细菌、霉菌等。

2．培养基培养细菌、霉菌用斜面培养基。

【操作步骤】1．将菌种转接在适宜的固体斜面培养基上，待其充分生长后，用纸将管塞部分包扎好，置4℃冰箱中保藏。

2．保存时间依微生物的种类各异。

霉菌、放线菌及有芽胞的细菌保存2～4个月转种一次，普通细菌最好每月转种一次，假单胞菌两周转种一次，酵母菌两个月转种一次。

【评价】本法操作简单、使用方便、不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。

缺点是保藏时间短、需定期传代，且易被污染，菌种的主要特性容易改变。

二、液体石蜡法【试剂与器材】1．菌种待保存的细菌,霉菌等。

2．培养基培养细菌、霉菌用培养基。

3．溶液或试剂液体石蜡。

4．仪器或其他用具无菌吸管，40℃温箱等。

【操作步骤】1．将液体石蜡分装于试管或三角烧瓶中，塞上棉塞并用牛皮纸包扎好，12l℃灭菌30min，然后放在40℃温箱中使水蒸发后备用。

2．将需要保藏的菌种在最适宜的斜面培养基中培养，直到生长良好。

3．用无菌吸管吸取无菌的液体石蜡，加入已生长良好的菌种斜面上，加入的石蜡高出斜面顶端1cm为宜，使菌种与空气隔绝。

4．将试管直立，置低温或室温下保存(有的微生物在室温下比在冰箱中保存的时间还要长)。

【评价】此法实用而且效果较好。

产孢子的霉菌、放线菌、芽胞菌可保藏2年以上，有些酵母菌可保存1～2年，一般无芽胞细菌也可保存1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎奈瑟菌，在35℃～37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。

常用菌悬液的制备、保存及使用方法摘要：常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征(1)枯草芽抱杆菌［CMCC(B) 63 501］形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆...常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征(1 )枯草芽抱杆菌［CMCC(B) 63 501］形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆形，染色均匀，芽抱椭圆形或圆柱形，位于菌体中央，革兰氏染色阳性，能运动。

培养特性：营养琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，灰黄色，边缘锯齿状，分离时应挑选粗糙形菌落。

普通肉汤培养基：呈少量浑浊并产生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜粘附于试管壁上。

最适宜培养温度30~37 C,生长温度范围：15〜35 C,兼性厌氧或需氧。

抵抗力：菌体湿热55 C 1小时被杀死，芽抱100 C 3小时或120 C 40分钟被杀死。

(2 )铜绿假单胞菌［CMCC(B) 10 104］形态与染色：革兰氏阴性杆菌。

菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。

培养特性：本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42 C,最适生长温度为25~30 C,特别是该菌在4C不生长而在42 C可以生长的特点可用以鉴别。

在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素( pyocynin )与带荧光的水溶性荧光素( pyoverdin )等。

在血平板上会有透明溶血环。

(3) 白色念珠菌［CMCC(F) 98 001］形态与染色：本菌细胞呈圆形或卵圆形，很象酵母菌，直径 3 ~ 6(_im ,比葡萄球菌大5 ~ 6倍，革兰阳性，但着色不均匀。

培养特性：本菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，37 C或室温孵育2〜3日后，生成灰白乳酪样菌落，涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。

(4) 金黄葡萄球菌［CMCC(B) 26 003］形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄串状，营养琼脂平板培养多呈短链状或双球状，无鞭毛，不能动，不产生芽抱，革兰氏染色阳性。

各种溶液有效期标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]溶液、试液、滴定液、标准溶液配制有效期1.固体试剂：未开封时一般为5年，开封后为3年，最长不超过实际有效期(特殊的除外)。

2.液体试剂：未开封时一般为3年，开封后为2年，最长不超过实际有效期（特殊的除外）。

3.普通溶液：一般为6个月，最长不超过1年。

4.试液：一般为3个月，最长不超过6月。

5.滴定液、指示液：一般为3-6个月6.标准溶液：冷藏，一般为3个月7.指示剂：一般为1-3个月注：试液、指示液有效期的确定根据溶质和溶剂的性质，一般试液有效期最长不超过一年，指示液有效期最长不超过三个月，有机溶剂和性质不稳定的溶质有效期都要缩短。

可以根据使用情况适当确定有效期。

有些溶液需临用配制如淀粉、碘化钾、酸性氯化亚锡、亚铁氰化钾、硫化钠等溶液无氨水配制时间一般为一周含有挥发性的溶液配制时间应缩短如氨试液一般可定三个月无机盐可一年我们的规定是一般试液有效期6个月，固体指示剂有效期6个月，液体指示剂有效期3个月，临用配制的按要求。

我们一般是根据药典要求来配制，有些溶液要求临用配制，就24小时，无氨水配制时间一般为一周其他一般都定三个月但是我去过上海市药品检验所，发现他们好多都定1年名称浓度(mol/L)有效期/月名称浓度(mol/L)有效期/月硫酸亚铁溶液1；0.6420天各种酸溶液各种浓度3氢氧化钠溶液各种浓度3硫酸亚铁溶液0.1用前标定氢氧化钾-乙醇溶液0.1；0.51亚硝酸钠溶液0.1；0.252硫代硫酸钠溶液0.05；0.12硝酸银溶液0.13高锰酸钾溶液0.05；0.13硫氰酸钾溶液0.13碘溶液0.02；0.11亚铁氢化钾溶液各种浓度1重铬酸钾溶液0.13EDTA溶液各种浓度3溴酸钾-溴化钾溶液0.13锌盐溶液0.0252氢氧化钡溶液0.051硝酸铅溶液0.0252附件3各种溶液使用期限表一、缓冲液、试液、指示液缓冲液、试液、指示液备注有效期磷酸盐标准缓冲液3个月标准缓冲液3个月醋酸盐缓冲液3个月磷酸盐缓冲液3个月醋酸--醋酸铵缓冲液3个月磷酸盐缓冲液3个月草酸氰钾缓冲液3个月氢氧化钠试液6个月碘试液6个月硝酸银试液6个月硝酸汞试液本液应置棕色瓶内,密闭保存6个月氨试液本液应置橡皮塞瓶中保存6个月硫化氰试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存2个月对二氨基苯甲醛试液6个月三氯化铁试液6个月碘化铋试液6个月氰化钾试液6个月溴化汞试液本液应置玻璃塞瓶内在暗处保存6个月亚铁氰化钾试液本液应临用新制亚硫酸氢钠试液本液应临用新制亚硫酸钠试液本液应临用新制亚硝基铁氰化钠试液本液应临用新制过氧化氢试液6个月次氯酸钠试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存6个月草酸试液6个月草酸铵试液6个月重铬酸钾试液6个月盐酸羟胺试液6个月钼酸铵试液6个月铁氰化钾试液6个月稀铁氰化钾试液6个月浓氨试液3个月高锰酸钾试液6个月硅钨酸试液6个月铬酸钾试液6个月硝酸汞试液本液应置玻璃瓶内,在暗处保存。

各种溶液的存放条件标准溶液保存方法及有效期溶液浓度（mol/L) 保存方法有效期氢氧化钠标准溶液各种浓度存于聚乙烯容器中2个月盐酸标准溶液各种浓度存于玻璃瓶中3个月硫代硫酸钠标准溶液0.1 存于棕色玻璃瓶中2个月EDTA标准溶液0.05 存于聚乙烯容器中3个月碘标液标准溶液0.1 存于棕色玻璃瓶中1个月硫酸各种浓度存于玻璃瓶中3个月硝酸银标准溶液0.1 存于棕色玻璃瓶中3个月溴标准溶液0.1 存于棕色玻璃瓶中3个月重铬酸钾标准溶液0.1 存于棕色玻璃瓶中3个月金属标液（低浓度）QA现用存于聚乙烯瓶中两到三个月GC标液QA现用冰箱中两年氯化锌标准溶液0.02 存于聚乙烯容器中2个月中控分析用试剂溶液保存方法及有效期溶液浓度（mol/L) 保存方法有效期1-10，菲啰啉溶液 2.5g/L 无色溶液，避光保存存放暗处保存2个月纳氏试剂QA现用棕色瓶橡皮塞密封保存存放暗处保存1年氯化亚锡-甘油0.25 g/ml 不能超过六个月PH校正液4.01/6.86/9.18 存于聚乙烯瓶中发现有絮状物时更换七水硫酸镁22.5g/L存在玻璃瓶内，置暗处有生物滋长现象，应重配氯化钙27.5g/L六水氯化铁0.25g/L磷酸盐QA现用1-2-4还原酸2.5g/L 聚乙烯瓶中避光保存两到三周更换一次硫氰酸汞溶液0.5 g/L 使用前配制CO-PT比色标液QA现用一个月更换一次亚硫酸氢钠18.5g/L 现配溶液浓度（mol/L) 保存方法有效期碘化钾溶液100g/L 置于棕色瓶中使用前配制氟化钾溶液500g/L 储于塑料瓶中4-氨基安替比啉溶液2% 置于棕色瓶中，避光保存一周铁氰化钾溶液9% 置于棕色瓶中，避光保存一周钼酸钠-硫酸10 g/L 棕色试剂瓶中保存两个月对二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液30 g/L 棕色瓶保存，存放暗处——0.25%硫代乙酰胺水溶液0.25% 棕色瓶内保存——三乙醇胺水溶液1+1 存于聚乙烯瓶中——镁标液0.2000g/L 存于聚乙烯瓶中——氨基磺酸10% 存于棕色玻璃瓶中——草酸溶液10% 存于聚乙烯瓶中——钼酸铵溶液10% 存于聚乙烯瓶中——酒石酸钾钠50% 存于棕色玻璃瓶中——硝酸铁8g/L(以Fe计) 存于玻璃瓶中——盐酸羟胺100g/L 存于棕色玻璃瓶中——硫酸肼0.15% 存于棕色玻璃瓶中——HCL水溶液1+1 存于玻璃瓶中——HCL水溶液20% 存于玻璃瓶中——HCL水溶液1mol/l 存于玻璃瓶中——Bacl2水溶液100g/l 存于玻璃瓶中——硝酸1+12 存于玻璃瓶中——硫酸1+5 存于玻璃瓶中——H2SO4水溶液0.5mol/l 存于玻璃瓶中——NaOH水溶液2mol/l 存于聚乙烯瓶中——指示剂及其他溶液保存方法及有效期溶液浓度（mol/L) 保存方法有效期可溶性淀粉溶液10 g/L 存于白色滴瓶中有沉淀需重配铬黑T指示液0.5% 存于棕色滴瓶中临用前配制钙指示剂置于磨口瓶中——各种酸碱指示剂溶液QA现用——各种缓冲溶液QA现用——氨水 1.4mol/L 存于存于聚乙烯瓶中——氨水除1.4 mol/L，其它浓度存于棕色玻璃瓶中——。

菌种保藏操作规程目的：规范微生物学标准菌种和野生菌种的保藏。

职责：微生物检验员负责菌种的保藏、确认、传代、使用等。

范围：本规程适用于标准菌种的管理和实验过程中分离纯化的野生菌种。

编制依据：1.实验室生物安全通用要求（GB19489-2008）2.实验室质量控制规范食品微生物检测（GB/T 27405-2008）；3.中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供的菌种保藏方法；4.《微生物学实验（第四版）》沈萍、陈向东主编，高等教育出版社；5.《食品微生物实验技术》，牛天贵主编，中国农业大学出版社；本中心主要采用斜面定期移植法、液体石蜡法、甘油冷冻保藏法、瓷珠保藏法四种方法对各类型标准菌种或野生菌种进行保藏，其详细操作如下：1斜面定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。

是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4-6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

操作步骤如下：1.1试剂、培养基种类a.营养肉汤或BHI培养基适用于所有细菌（除真菌外）的増菌；b.营养琼脂平板适用大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌等的培养；c.沙氏葡萄糖液体培养基适用于酵母、霉菌的增菌。

沙氏葡萄糖琼脂培养基适用于酵母、霉菌的培养。

1.2试剂、培养基制备a.按照说明书要求溶解培养基并调pH值。

b.将配好的培养基趁热分装。

斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4-5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。

c.将试管加硅胶塞，外面包扎一层牛皮纸并注明培养基名称及配制日期。

根据要求将培养基灭菌，高压蒸汽灭菌121℃，15-20min。

d.斜面摆放：灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

e.无菌检查：将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1-3天。

无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

1.3接种a.点接：把菌种点接在斜面中部偏下方处。

标准文件锦州九天药业有限责任公司1.0 目的：建立标准溶液的操作规程，确保检验结果的准确性。

2.0 适用范围：菌悬液配制操作。

3.0 责任：化验员、QC主任对实施本规程负责。

4.0 内容4.1 依据：《中国药典》2005年版（二部）附录。

4.2 菌悬液的种类4.2.1 枯草芽孢杆菌悬液4.2.1.1 试剂与试液：灭菌水4.2.1.2 操作步骤：取枯草芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面营养物,加灭菌水1～2ml将菌苔洗下,制成悬液,用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁营养瓶内,均匀摊布,在35～37℃培养7天.取菌苔少许涂片,革兰氏染色镜检,应有芽孢85%以上,用灭菌水10ml将芽孢洗下,制成芽孢悬液,合并至灭菌大试管内,在65℃水浴中加热30分钟将菌体杀死,待冷后置4℃冷藏箱贮藏.此菌液为浓菌液.日常试验用菌液取上述浓菌液,用灭菌水1:3稀释至灭菌试管中,冷藏箱保存备用.4.2.2 短小芽孢杆菌悬液4.2.2.1 试剂与试液：灭菌水4.2.2.2 操作步骤: 取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面营养物,加灭菌水1～2ml将菌苔洗下,制成悬液,用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁营养瓶内,均匀摊布,在35～37℃培养7天.取菌苔少许涂片,革兰氏染色镜检,应有芽孢85%以上,用灭菌水10ml将芽孢洗下,制成芽孢悬液,合并至灭菌大试管内,在65℃水浴中加热30分钟将菌体杀死,待冷后置4℃冷藏箱贮藏.此菌液为浓菌液.4.2.3 验证菌悬液4.2.3.1 试剂与试液4.2.3.2 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草牙孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中,白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中,培养18～24h;黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基,培养5～7天.用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含500～1000个cfu的菌悬液。

各种溶液有效期 Prepared on 22 November 2020溶液、试液、滴定液、标准溶液配制有效期1.固体试剂：未开封时一般为5年，开封后为3年，最长不超过实际有效期(特殊的除外)。

2.液体试剂：未开封时一般为3年，开封后为2年，最长不超过实际有效期（特殊的除外）。

3.普通溶液：一般为6个月，最长不超过1年。

4.试液：一般为3个月，最长不超过6月。

5.滴定液、指示液：一般为3-6个月6.标准溶液：冷藏，一般为3个月7.指示剂：一般为1-3个月注：试液、指示液有效期的确定根据溶质和溶剂的性质，一般试液有效期最长不超过一年，指示液有效期最长不超过三个月，有机溶剂和性质不稳定的溶质有效期都要缩短。

可以根据使用情况适当确定有效期。

有些溶液需临用配制如淀粉、碘化钾、酸性氯化亚锡、亚铁氰化钾、硫化钠等溶液无氨水配制时间一般为一周含有挥发性的溶液配制时间应缩短如氨试液一般可定三个月无机盐可一年我们的规定是一般试液有效期6个月，固体指示剂有效期6个月，液体指示剂有效期3个月，临用配制的按要求。

我们一般是根据药典要求来配制，有些溶液要求临用配制，就24小时，无氨水配制时间一般为一周其他一般都定三个月但是我去过上海市药品检验所，发现他们好多都定1年名称浓度(mol/L)有效期/月名称浓度(mol/L)有效期/月硫酸亚铁溶液1；天各种酸溶液各种浓度3氢氧化钠溶液各种浓度3硫酸亚铁溶液用前标定氢氧化钾-乙醇溶液；亚硝酸钠溶液；硫代硫酸钠溶液；硝酸银溶液高锰酸钾溶液；硫氰酸钾溶液碘溶液；亚铁氢化钾溶液各种浓度1重铬酸钾溶液溶液各种浓度3溴酸钾-溴化钾溶液锌盐溶液氢氧化钡溶液硝酸铅溶液附件3各种溶液使用期限表一、缓冲液、试液、指示液缓冲液、试液、指示液备注有效期磷酸盐标准缓冲液3个月标准缓冲液3个月醋酸盐缓冲液3个月磷酸盐缓冲液3个月醋酸--醋酸铵缓冲液3个月磷酸盐缓冲液3个月草酸氰钾缓冲液3个月氢氧化钠试液6个月碘试液6个月硝酸银试液6个月硝酸汞试液本液应置棕色瓶内,密闭保存6个月氨试液本液应置橡皮塞瓶中保存6个月硫化氰试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存2个月对二氨基苯甲醛试液6个月三氯化铁试液6个月碘化铋试液6个月氰化钾试液6个月溴化汞试液本液应置玻璃塞瓶内在暗处保存6个月亚铁氰化钾试液本液应临用新制亚硫酸氢钠试液本液应临用新制亚硫酸钠试液本液应临用新制亚硝基铁氰化钠试液本液应临用新制过氧化氢试液6个月次氯酸钠试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存6个月草酸试液6个月草酸铵试液6个月重铬酸钾试液6个月盐酸羟胺试液6个月钼酸铵试液6个月铁氰化钾试液6个月稀铁氰化钾试液6个月浓氨试液3个月高锰酸钾试液6个月硅钨酸试液6个月铬酸钾试液6个月硝酸汞试液本液应置玻璃瓶内,在暗处保存。

甘油冷冻保藏法本方法适合于中、长期菌种保藏,保藏时间一般为2-4年左右。

(1)用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落。

(2)平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱,培养24-48小时,至单菌落的大小为3mm左右。

(3)挑取一个单菌落,接种于一个装50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10-15小时,至菌密度OD600为1.0-1.5。

(4)用火焰灭菌的接种环取少量种子液,涂片后,作革兰氏染色,在显微镜下观察菌体的形态,及是否有杂菌。

(5)按30%甘油:种子液为1:1(V/V)的量加入无菌甘油,混合后分装至事先灭菌的菌种保存管(1-2mL/管),-70℃或液氮保存。

1. 20%甘油保存菌种是指甘油:菌液=20:80,800ul菌液加200u灭菌l甘油后的甘油后,充分混匀后,-70度保藏.(注意甘油要慢慢吸)2. 将一般细菌的菌种纯化后接种于普通肉汤管,4~6h增菌后,加入适量甘油一生理盐水保存液,-20℃冰箱保存;链球菌属和奈瑟氏菌属的菌株纯化后接种于血清肉汤管,在5%~10%CO2中经8~10h增菌后,加入适量保存液,80℃低温冰箱保存;真菌菌种纯化后直接取菌洗入肉汤,不做培养,加入保存液后,-20℃冰箱保存。

结果在连续3年实验期内,各菌种保存效果良好,且其形态结构、染色特性、生化反应等与标准株相符。

结论使用甘油生理盐水保存法来保存菌种,各菌种保存时间长,方法简便,特别是使链球菌、奈瑟氏菌和弧菌等需特殊保存方法保存的菌株在一般实验室得以保存。

3. 常用的是终浓度10-30% 的甘油。

由于纯甘油十分粘稠,很难定量,一般配成终浓度50% 的水溶液,高压灭菌后室温保存即可。

使用时按50% 甘油:菌液= 1:1 混合均匀,然后迅速冻结。

A. 先把甘油稀释成50%,然后灭菌这样20%的终浓度用400微的菌体加600微的50%甘油混合不就可以啦纯的甘油太粘稠啦,用枪不好吸的B 终浓度15%。

磷酸盐标准缓冲液3个月标准缓冲液3个月醋酸盐缓冲液3个月磷酸盐缓冲液3个月醋酸--醋酸铵缓冲液3个月草酸氰钾缓冲液3个月氢氧化钠试液6个月碘试液6个月硝酸银试液6个月硝酸汞试液本液应置棕色瓶内,密闭保存6个月氨试液本液应置橡皮塞瓶中保存6个月硫化氰试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存2个月对二氨基苯甲醛试液6个月三氯化铁试液6个月碘化铋试液6个月氰化钾试液6个月溴化汞试液本液应置玻璃塞瓶内在暗处保存6个月亚铁氰化钾试液本液应临用新制亚硫酸氢钠试液本液应临用新制亚硫酸钠试液本液应临用新制亚硝基铁氰化钠试液本液应临用新制过氧化氢试液6个月次氯酸钠试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存6个月草酸试液6个月草酸铵试液6个月重铬酸钾试液6个月钼酸铵试液6个月铁氰化钾试液6个月稀铁氰化钾试液6个月浓氨试液3个月高锰酸钾试液6个月硅钨酸试液6个月铬酸钾试液6个月硝酸汞试液本液应置玻璃瓶内,在暗处保存。

6个月硫代乙酰胺试液6个月硫代硫酸钠试液6个月硫氰酸铵试液6个月硫酸亚铁试液本液应临用新制。

硫酸钾试液6个月硫酸铜试液6个月硫酸镁试液6个月稀硫酸镁试液6个月氯化亚锡试液6个月氯化钙试液6个月氯化钡试液6个月氯化钴试液6个月氯化铵试液6个月碘化钾试液6个月碘化钾碘试液6个月溴化钾溴试液6个月碱性枸椽酸铜试液6个月碱性酒石酸铜试液6个月碱酸焦性没食子酸试液6个月碳酸氢钠试液6个月碳酸钠试液6个月碳酸钾试液6个月碳酸铵试液6个月醋酸钠试液6个月醋酸铅试液6个月醋酸铵试液6个月醋酸铜试液6个月靛胭脂试液6个月亚硝基铁氰化钠液6个月标准氯化钠液临用前精密量取贮液10ml,用滤纸过滤时滤纸是含有氯化物;可预先用含有硝酸的水溶液洗净后使用。

储备液6个月结晶紫指示液6个月饱和硫化氢水溶液3个月标准铅液临用前精密量贮备液10ml。

(配制与贮存用的玻璃容器均不得含铅储备液6个月黄色调比色液(1号基础液) 12个月浊度标准贮备液本液置冷处避光保存可在两个月内使用,用前摇匀。

菌种保存、传代、使用、销毁管理规程-操作规程菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。

2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。

3、定义➢标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。

➢传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。

➢工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。

➢菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。

4、职责4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。

4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。

5、规程5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。

5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。

5.3菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。

将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。

此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。

保存时间根据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。

资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载菌液的制备及保存地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容1目的菌种保藏使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。

规范菌种原始菌液的制备及长期保存。

2内容2.1定义原始菌液--由冻干菌或冷冻菌直接传代的孢子或生长菌的原始悬浮液。

工作菌液--由原始菌液直接稀释，或根据一般试验需要而等量稀释的特定浓度的孢子或细菌的悬浮液。

2.2 总则微生物室收到实验菌种后应进行活化及纯化，并进行传代（芽孢杆菌除外）。

每一新菌种在适宜的琼脂平板上划线分离，检查是否纯种，观察菌落形态并用革兰氏染色或芽孢染色法进行镜检，如果是芽孢悬浮液，用常规方法测定其存活孢子数。

经检查如果满意，贴上合适的标签，并将贮备菌存放在实验室专用的冰箱里（2 ～8℃）或冷冻室内，以避免与实验室正在使用的其它菌种相混淆，作好菌种传代的记录以便能追踪传代史。

生孢梭菌的孢子悬浮菌应每年制备一次。

原始菌种的传代次数最多传至第五代。

2.3 培养基2.4 冻干菌制备原始菌液2.4.1 由甘油冷冻菌制备原始菌液2.4.1.1 把冻干菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第一代。

2.4.1.2 从冷冻箱内取出冷冻菌，使其在室温下慢慢融化；2.4.1.3 把冷冻菌无菌转移至100ml该菌所适用的液体培养基中；2.4.1.4 根据菌种的类型，将接种后的培养基在适当温度下培养24h或更长一些时间；2.4.1.5 把甘油冷冻菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第二代。

2.4.2 由集菌平板制备原始菌液2.4.2.1 在超净工作台内，把经过24h（或更长时间）培养的菌液摇匀，各取1ml，无菌转移至5只培养基平板上，轻轻转动平板，使菌液均匀分布于平板表面。