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UPLC_MRM法测定饲料中的三聚氰胺

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饲料中三聚氰胺地检测方法

饲料中三聚氰胺地检测方法

饲料中三聚氰胺的检测方法三聚氰胺(melamine)简称三胺，学名三氨三嗪，是一种重要的氮杂环有机化工原料，在饲料工业中作为粘合剂使用。

目前国际上通常采用凯氏定氮法测定饲料中粗蛋白质的含量。

即求出氮的含量，再乘以一定的换算系数(通常用6．25系数计算)得出蛋白质含量。

由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，每个三聚氰胺分子中都含有6个氮原子，而在原料的粗蛋白检测过程中，用浓硫酸消化过程可以将三聚氰胺分解掉．但在最后的计算中，三聚氰胺中的氮原子即可提高粗蛋白的比率，造成蛋白含量虚假增高。

因此只要在饲料中添加一些含氮量高的化学物质，就可在检测中造成蛋白质含量达标的假象。

饲料中非法添加化工原料．可以提高蛋白质检测数值，而用全氮测定法测饲料和食品中的蛋白质含量时根本不能区分这种伪蛋白氮。

在饲料中少量添加三聚氰胺即可大大提高蛋白含量。

l三聚氰胺的性质1．1物理性质分子式C3N6H6或C3N3(NH2)3，分子量126．12,为纯白色单斜棱晶体，无味，低毒，密度1．573 g ／cm3〔16℃〕。

常压熔点354℃(分解)；快速加热升华，升华温度300℃。

溶于热水，微溶于冷水，极易溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。

在一般情况下较稳定，但在高温下可能会分解放出氰化物。

1．2化学性质三聚氰胺的水溶液呈弱碱性(pKb=8)，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。

在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性环境中(pH值5．5-6．5)与羟甲基的衍生物进展缩聚反响而生成树脂产物。

在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。

三聚氰胺与醛类反响生成加成化合物，其中三聚氰胺与甲醛水溶液的反响是最重要的反响。

2饲料中三聚氰胺的检测方法2．1试剂盒检测法fELISAl利用萃取液通过均质与震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进展免疫测定。

饲料及食品添加剂中三聚氰胺的高效液相色谱-质谱法检测

饲料及食品添加剂中三聚氰胺的高效液相色谱-质谱法检测

普通蛋白质含氮量只有16%，但三聚氰胺含氮量可达66.7%，为提高饲料中蛋白质的含氮量，部分非法分子将三聚氰胺添加到饲料和食品中。

动物长期摄入含三聚氰胺的饲料，会产生很大的毒性作用。

动物会不仅出现肾衰竭而死亡，而且会危害人体健康。

我国明令禁止在任何饲料中添加以三聚氰胺等为原料的“蛋白精”。

检测三聚氰酸的常用方法有GC-MS/MS 法、LC-MS/MS法、HPLC法等。

目前只有农业行业有对饲料中三聚氰胺残留的标准，国家标准尚没有。

GC-MS法、HPLC法是农业行业标准中的规定方法。

GC-MS 法的前处理比较繁琐，需衍生化。

饲料及食品添加剂中有复杂的基质成分，存在许多干扰因素，影响检测结果。

本文优化质谱条件，应用高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS），为从源头控制饲料及食品安全提供保障。

1　材料与方法1.1　仪器与试剂　三聚氰胺分析纯，不低于99.5%的纯度。

称取10 mg三聚氰胺，使用10 mL容量瓶，设置三聚氰胺标准溶液，作为标准储备液，用流动相定容。

分析纯为甲酸、乙醇。

使用仪器为安捷伦1100LC-Trap-XCT系统。

1.2　处理样品　在批发市场购买饲料与食品样品。

粉碎样品，将5 g样品放入具塞锥形瓶中。

加入20 mL体积比1∶1的水-乙醇溶液，含体积分数0.1%的甲酸。

10 min超声波振荡，然后过滤，使用20 mL上述提取液再次提取残渣。

过滤，合并滤液。

定容至 5 mL。

使用氮吹仪上浓缩，使用滤膜0.45μm过滤。

1.3　检测条件　质谱条件：扫描范围为m/ z44-150。

4.0×105Pa的雾化器压力，97.4 V的毛细管出口电压，3909 V的毛细管电压，正离子化模式的电喷雾电离，9 L/min的干燥气流量，0.5 V的碎裂电压，350℃的干燥气温度。

色谱条件：体积比5∶95，流动相为乙腈-0.1%甲酸。

色谱柱Kromasil-C18柱，5μm，4.6 mm×250 mm，进样量5μL，0.4 mL/min的流速。

饲料中三聚氰胺测定不确定度的评定

饲料中三聚氰胺测定不确定度的评定

饲料中三聚氰胺测定(高效液相色谱法)的不确定度分析评价人审核人#############检测中心20##-##-##饲料中三聚氰胺的测定(高效液相色谱法)的不确定度分析1 实验部分1.1 实验方法：按NY/T 1372—2007《饲料中三聚氰胺的测定》方法进行。

1.2 三聚氰胺标准溶液制备1.2.2 标准储备液：称取三聚氰胺标准品（BW 3831）50mg（精确到0.01mg），用甲醇溶液（20%的甲醇水溶液，甲醇为色谱级，水为一级水）溶解并定容于100mL 容量瓶中，该溶液浓度为500μg/mL。

1.2.3 标准中间液：吸取标准储备液10mL，于100mL容量瓶内，用甲醇溶液（同上）定容至100mL，该溶液三聚氰胺浓度为50μg/mL。

1.2.4 标准工作液：用移液管分别移取标准中间液1mL、5 mL、10 mL、25 mL 和50 mL于5个50 mL容量瓶内，用甲醇溶液（同上）定容，该溶液三聚氰胺浓度为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、25μg/mL和50μg/mL。

1.3 样品测定方法称取5g试样（精确至0.01g），准确加入50mL三氯乙酸溶液（10g/L），加入2mL乙酸铅溶液（22g/L）。

摇匀，超声提取20min。

静止2min，取上层提取液约30mL转入离心管，在10000r/min离心机上离心5min。

分别用3mL甲醇，3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，准确移取10mL离心液分次上柱，控制过柱速度在1mL/min以内再用3mL水和3mL甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽近干后用氨水甲醇溶液（氨水：甲醇=5：100）3mL洗脱。

洗脱液50℃氮气吹干，准确加入甲醇溶液（同上），涡旋振荡1min，过0.45μm滤膜，上机测定。

液相色谱条件为：色谱柱：C8柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒度5μm；或性能相当的色谱柱。

柱温：室温。

流动相流速：1.0 mL/min 。

测定食品中三聚氰胺的标准操作程序

测定食品中三聚氰胺的标准操作程序

测定食品中三聚氰胺的标准操作程序1、范围规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三种测定方法，即高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱联用法[包括气相色谱-质谱法（GC-MS），气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS）]。

适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定；液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱（包括气相色谱-质谱/质谱）法同时适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定性确证。

方法高效液相色谱法的定量限为2 mg/kg，液相色谱-质谱/质谱法的定量限为0.01 mg/kg，气相色谱-质谱法的定量限为0.05 mg/kg（气相色谱-质谱/质谱法的定量限为0.005 mg/kg）。

2、第一法高效液相色谱法（HPLC）2.1 原理试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。

2.2 试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

2.2.1 甲醇：色谱纯。

2.2.2 乙腈：色谱纯。

2.2.3 氨水：含量为25％～28％。

2.2.4 三氯乙酸。

2.2.5 柠檬酸。

2.2.6 辛烷磺酸钠：色谱纯。

2.2.7 甲醇水溶液：准确量取50 mL 甲醇和50 mL 水，混匀后备用。

2.2.8 三氯乙酸溶液（1％）：准确称取10 g 三氯乙酸于1 L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

2.2.9 氨化甲醇溶液（5％）：准确量取5 mL 氨水和95 mL 甲醇，混匀后备用。

2.2.10 离子对试剂缓冲液：准确称取2.10 g 柠檬酸和2.16 g 辛烷磺酸钠，加入约980 mL 水溶解，调节pH 至3.0 后，定容至1L 备用。

2.2.11 三聚氰胺标准品：CAS 108-78-01，纯度大于99.0%。

2.2.12 三聚氰胺标准储备液：准确称取100 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（3.2.7）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL 的标准储备液，于4℃避光保存。

(新)浅谈三聚氰胺的毒性及其在饲料中的检测方法

(新)浅谈三聚氰胺的毒性及其在饲料中的检测方法

白含量。因为每个三聚氰胺分子中都含有６个氮
原子，而在原料的粗蛋白检测过程中，用浓硫酸消 化这一过程可以将三聚氰胺分解掉，这样在最后 的计算中，三聚氰胺中的氮原子即可提高粗蛋白 的比率，造成蛋白含量虚假增高［１】。它也常被不法 商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白 质含量指标，因此三聚氰胺也称为“蛋白精”［ｚ］。 １．３三聚氰胺的应用 三聚氰胺常用于生产塑
０００
ｍｇ／ｋｇ）组给药后９ ｈ，小鼠开始
出现不安，呼吸急促，随后在几十分钟内死亡。其他 剂量组小鼠仅见精神不振，反应迟钝，闭眼伏卧，不 食等症状，随后在２４～４８ ｈ出现个别死亡。灌胃死 亡的小鼠输尿管中均有大量晶体蓄积，部分小鼠肾 脏被膜有一层晶体。其他脏器未见明显的变化。 ２．３三聚氰胺的亚慢性毒性试验 当猫的饲料中 添加三聚氰胺后，血清尿素氮（ＢＵＮ）和肌酐（ＣＲＥ） 逐渐升高，２３ ｄ这两项指标超过正常范围（ＢＵＮ：
３．１
方法适用于动物食品中三聚氰胺类有机物含量的 常规检测。
３．３
固相萃取一液相色谱一串联质谱法刘梅剐等
采用该法对食品中三聚氰胺的含量进行测定。样品 经均质，１９钲三氯乙酸溶液提取，用０ＡＳＩＳＭＣＸ固相萃 取小柱净化，减压浓缩后以甲醇溶解定容，用ｗａ—
ｔｅｒｓ
ＢＥＨ—Ｃ８柱分离，乙腈和水为流动相，经液相
浅谈三聚氰胺的毒性及其在饲料中的检测方法
田树清，范艳平 （扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州２２５００９）
摘要：检测哟蛋白”三聚氰胺，对保证饲料的质量安全、维护人们的身体健康和促进对外贸易 具有重要意义。而传统的‘凯氏定氮法”检测蛋白质含量时，不能够区分这种啡蛋白氮”，致使一些
不法厂商，在产品中添加三聚氰胺粉以提高蛋白质含量．本文就三聚氰胺的毒性及其在饲料中的几种检 测方法进行了综述。

三聚氰胺的检测技术一

三聚氰胺的检测技术一
标准曲线及定量限
● 以目标物测定浓度为横坐标，目标物与对应同位素内标峰面积比为纵坐标，绘制三聚氰胺标准曲 线，在2.5～100.0 ng/mL线性关系良好，回归方程为y=0.998 266x+0.041 23，相关系数r为 0.999 3，符合检验对标准曲线的要求。
回收率实验
● 分别向空白样本中添加标准工作液、同位素内标工作液，按照1.3.1步骤处理并检测。添加水平为 0.01 mg/kg、0.03 mg/kg、0.10 mg/kg 3个水平，每个浓度6份平行样本，检测结果见表2。方 法回收率为82.8%～102.3%，相对标准偏差为3.2%～5.6%，回收率和精密度良好，符合检测方 法要求，适合液体乳中三聚氰胺的检测
● 检出限测定以空白牛奶样品为基质，一个阳性添加浓度C(10.0µg/g)，按照上述优化过的方法来 前处理和上机，所得信噪比S/N=19.49，可计算检出限为0.001 5µg/g。计算公式如下
● 检出限(method detection limit,MDL)(μg/g)=3C/(S/N)
● 回收率和精密度的确定以空白牛奶作为基质，进行相应的加标回收试验，加标浓度为 10µg/kg、 5 0 µg / k g 、 2 0 0 µg / k g 。 每 个 加 标 浓 度 分 别 做 6 个 相 同 浓 度 的 平 行 试 样
结论
● 本研究探索优化了一种基于高效液相色谱-串联质谱法的内标法测定液态奶 中三聚氰胺的分析方法。该方法通过用含10%二乙胺的乙腈水溶液充分提 取，取上清液进行氮吹浓缩后，定容上机测定，最后，该方法的检出限达 到了0.001 5μg/g，能灵敏的检测低含量基质，同时，液态奶试样在按 10μg/kg、50μg/kg、200μg/kg 3个浓度添加情况下根据该试验方法进行 前处理和仪器检测，结果回收率为87.79%～104.54%，相对标准偏差为 2.39%～5.07%。该方法具有前处理简单便捷、检出结果精密度高定量结 果准确且重复测试较为稳定等特点，大大提高了液态奶中三聚氰胺的检测 效率，方便对此类药物的监督管控对有效的倒逼生产养殖端按规定使用该 类药物起到积极推动作用

超高效液相色谱_串联质谱法测定原料乳和奶粉中三聚氰胺的含量


需要选择合适的色谱柱。 该试验在研究过程中， 考察了 Waters 公司的 ACQUITY UPLCTM BEH HILIC 柱（2.1 mm× 50 mm i.d.，1.7 μm）和日本资生堂的 CAPCELL PAK CR1∶4 柱（2.0 mm×100 mm i.d.，5 μm）。 Waters 公司的 HILIC 柱采 用乙腈和纯水作为流动相标准溶液能够获得较好的色谱 峰，信噪比较高，而流动相中加入甲酸、乙酸、乙酸铵都会使 响应值降低，这与文献 ［4］报道一致，但是用于样品分析时， 离子抑制很严重， 这可能是由于三聚氰胺在HILIC 柱几乎 无保留，与杂质同时流出，离子受到抑制有关。 日本资生堂 的 CAPCELL PAK CR 1∶4 柱的填料是 C18 填料和阳离子交 换填料按照 1∶4 混合而成，由于三聚氰胺是强极性化合物， 在该柱上的保留主要与阳离子交换填料有关，因此，流动相 的酸碱度跟三聚氰胺在该柱上的保留时间密切相关。 该研 究过程中， 使用 CAPCELL PAK CR 1∶4 柱， 用乙腈和 0.01 mol/L 乙酸铵溶液（等体积混合）作为流动相，流速为 0.3 ml/ min，调整流动相的酸碱度，得到三聚氰胺的保留时间与 pH 值的关系（见表 3）。 由于加大流动相中有机相的比例会加 速三聚氰胺的洗脱， 该研究最终选择了 pH 值=4.4 乙酸铵 溶液和乙腈进行梯度洗脱 （见表 1），即保证了目标峰不受 杂质峰的干扰，而且能够出峰较快、节约分析时间。
0.01 mol/L 乙 酸 铵 溶 液 （pH 值=4.4），梯 度 洗 脱 ，洗 脱 程 序 用。
见表 1。 柱温 30℃，进样量 10 μl。
1.4.2 奶粉的提取方法 准确称取 2 g 奶粉于 50 ml 圆底
表 1 梯度洗脱程序

FDA公布了HPLC-UV和GC-MS检测三聚氰胺的方法

2007年4月，FDA公布了HPLC-UV和GC-MS检测三聚氰胺的方法。

2007年5月，FDA官员对三聚氰胺可能交叉污染人用食品表示担忧。

Updated FCC Developmental Melamine Quantitation (HPLC-UV)Sample Preparation/Extraction:Wheat gluten: Ground in a Retsch ZM 100 centrifugal rotor mill (ring sieve 0.5 mm).Moist pet food: Moist chunks and gravy were blended to the consistency of a gritty pudding prior to sampling.Samples weighed into glass scintillation vials. Extract using 50:50 acetonitrile:water.Procedure: Add indicated volume of extraction solvent (see note below) 1. Cap and vortex thoroughly, get aggressive with this step (critical due to slow dissolution rate of melamine). Sonicate 30 minutes. Filter portion of extract through 2-stage GMF-nylon (0.45 m m) filters. Dilute filtered extract 250 ml extract + 750 ml solvent 2 to maintain solubility of matrix components.1 Wheat gluten: Extract in proportion 0.1 g to 10 ml. For melamine contents above 2% w/w, extract in proportion 0.05 g to 15 ml.1 Moist pet food: Extract in proportion 2.0 – 2.5 g to 10 ml.2 Solvent for final dilution may be water or 0.1 N HCl. Final dilution is necessary for compatibility withion-pairing chromatography. We have observed some differences in behavior between the wheat gluten and pet food samples with respect to maintaining solubility during final dilution (these are most likely matrix components which fall out). 0.1 N HCl seems to help maintain solubility for final dilution of the wheat glutens.HPLC-UV Operating Parameters:Column: Zorbax Rx C8 (retention is too high on C18 column)Buffer: 10 mM citric acid, 10 mM sodium octane sulfonate, adjusted to pH 3.0Mobile phase: 85:15 buffer:acetonitrileFlow rate: 1.0 ml/min.Injection volume: 10 mlColumn thermostat: 40 oC (column thermostatting is necessary for ion-pair separations)Detection wavelength: 240 nmSpectral collection: 200 – 400 nm (look for lmax near 236 nm)Retention time: 4.2 - 4.3 min.Run time: 10 min.Standard Preparation:Stock standard was prepared in 76:24 acetonitrile: water. A check stock standard was prepared in 60:40 acetonitrile: water. Dilutions were made in either water or 0.1N HCl giving equivalent calibration curves.Figures of Merit:Linear range: established from 1.0 – 400 mg/ml; calibration range 1.0 – 200 mg/ml used for most of workReproducibility: duplicate preparations agree within 0.1 - 5% relative basisSpike/recovery (based on spiking solid melamine powder into test matrix prior to extraction): 90 -110%.。

UPLC—MS／MS法测定奶粉中三聚氰胺的测量不确定度评定

试 验 与检 测
Ｕ Ｐ Ｌ Ｃ — ＭＳ ／ ＭＳ法测定奶粉中三聚氰胺的测量不确定度评定
陈永菊 石 声鑫
广 东省 汕头 市质 量计 量监督检测所 广东 汕头 ５ １ ５ ０ ４ １
摘要： 按Ｇ Ｂ ／ Ｔ ２ ２ ３ ８ ８ － ２ ０ ０ ８ 《 原料 乳与乳制 品中三聚 氰胺检测方 法》对奶 粉中三聚氰胺含 量进行分析 ，通过建 立数 学模型 ， 对测量结果 中带来 的各个 不确定度进行分析并评定量化 ，求得 当三聚氰胺含量为 １ ０ ０ ｇ ／ ｋ ｇ时，其合成 不确定度 为 ０ ． ０ ２ ３ ６ ｇ ／ ｋ ｇ ，扩展不确定为 ４ ． ７ ２ Ｉ ｔ ， ｇ ／ ｋ ｇ 。 关键词 ：不确定度 奶粉 三聚氰胺 Ｕ Ｐ Ｌ Ｃ — Ｍ Ｓ
Hale Waihona Puke 谱／ 质谱 （ Ｌ Ｃ — Ｍ Ｓ ／ Ｍ Ｓ ）方 法 。 １ ． ３ 数 学 模 型
。 ｌ ＝ Ｏ ． Ｏ ０ ３ ３ ３ ｍ ｇ ／ １ ０ ０ ｍ ｇ ＝ ３ ． ３ ３ ｘ １ ０ 一 。
用外标法 计算奶粉 中三聚氰胺 的含量 ， 其数学模型：
三聚 氰胺 （ ｍ ｅ ｌ ａ ｍ ｉ ｎ ｅ ）又称 三氨三嗪 ， 是 一 种 重 要 的 氮 杂环 有 机 化 工 原 料 。三 聚 氰 胺分子 中含有大量氮 元素 ，普通 的 “ 凯 氏定 氮法 ”测 蛋 白质含量 时不能排 除这类伪蛋 白 氮 的干扰 ，因而 一些不法厂 商为了 降低 成本 而添加 这种化 工原料， 以提 高产品 中蛋 白质 含量 。因此 ，对 奶粉中三聚 氰胺 的监测 是一 项重要的常规监测项 目。 测量 不确 定度是 表征合 理地 赋予被测 量 之值 的分散性 ，与测量结果相 联系 的参数 。 本实验 参考 《 测量 不确定度评 定与表示 》和 《 量化 分析测量 不确 定度指 南》中规定 的方 法和要求 ， 结 合 日常 的检 测 ， 进行 Ｕ Ｐ Ｌ Ｃ — Ｍ Ｓ ／ Ｍ Ｓ 测 定 原 料 乳 与 乳 制 品 中 三 聚 氰 胺 （ Ｇ Ｂ ／ Ｔ ２ ２ ３ ８ ８ — ２ ０ ０ ８ ） ，分析测量结果不确定度 分量 的主要来源 ，建立 的数 学模型 ，进行 逐 项分析 与评定 ，为方法 的优 化、改进和评 定 测 量 结 果 质 量 提 供 了科 学 依 据 。

三聚氰胺的检测方法

三聚氰胺检测方法文献综述摘要：2008年9月，中国发生了震惊世界的“三鹿牌婴幼儿奶粉重大食品安全事故”。

事故的原因就是奶粉中加入过量的三聚氰胺，三聚氰胺进入人体后，发生取代反应(水解)，生成三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的网状结构，造成结石。

本文将对三聚氰胺的性质、危害及检测做进一步了解，探究。

关键词：三聚氰胺，性质，危害，检测技术Melamine nature, hazards and detection methodsAbstract：September 2008，China has shocked the world because of the Sanlu brand Infant milk powder of major food safety accidents. Cause of the accident is the excessive amount of melamine added to milk powder, Melamine entered the human body occurs to replace the reaction (hydrolysis), generates cyanuric acid, cyanuric acid and melamine to form a large network structure, resulting in stone. This artical will introduce the nature of melamine, harm and detection of further understanding, explore.Keywords：Melamine, nature, hazards, detection technology, research progress三聚氰胺的性质及危害：三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，学名三氨三嗪，被用作化工原料。

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收稿日期 : 2008 09 25; 修订日期 : 2008 12 14 作者简介 : 赵玉 娟 ( 1967- ) , 女 , 高级实验师 ; E mail: zhaoyj@ caf. ac. cn
∀
119 ∀
第 28 卷第 8 期 2009 年 8 月
分析试验室 Chinese Journal of Analysis Laboratory
Determination of melamine residues in feed by UPLC MRM with HPLC ZHAO Yu juan , LI Ru hua , ZHOU Wen f ang and YU Jian guo ( 1. Research Institute of Forestry Environment and Protection, CAF; Key Laboratory of Forestry Ecology and Environment , State Forestry Administration, Beijing 100091; 2. Minstry of Agriculture Milk and Dairy Quality Supvision and Inspection Evaluation Center, Beijing 100094) , Fenxi Shiyanshi, 2009, 28( 8) : 119~ 122 Abstract : A UPLC MRM method is presented for the quantitative determinat ion and confirmation of melamine residues in feed. Feed was extracted with 10 g L trifluoroacetic acid. Protein was precipitated by 22 g L lead acetate and cleaned up using oasis MCX solid phase extraction cartridges. Extracts were analyzed by UPLC MRM in positive ion mode. The parent ion for melamine is m z 126. 9. Two daughter ions were monitored at m z 84. 2 and 67. 5 for quan tif icat ion and confirmation. The recovery of melamine from fortified samples ( n = 6) was 85% with a RSD of 6. 5% . The detection limit was 0. 01 g L. Keywords: Melamine; UPLC MRM; Feed
中图分类号 : O657. 7 文献标识码 : A 文章编号 : 1000 0720( 2009) 08 119 04
目前, 婴幼儿奶粉中三聚氰胺给我国婴幼儿 肾脏造成了严重伤害, 如何从源头上堵住三聚氰 胺的掺入, 已成为国人关注的焦点。早在 2007 年 3 月 , 美国也发生宠物因食用含有毒物质食品而导 致死亡的事件。美国食品药物管理 局 ( FDA) 调查 显示 , 在回收的宠物食品、死亡动物的尿液结晶 和肾脏细胞中都发现有三聚氰胺。FDA 认为宠物 是因食用 假蛋白 三聚氰胺的饲料致死的。 三聚氰胺 ( melamine) 学名三 氨三嗪 , 别名蜜 胺、氰尿酰胺、三聚酰胺, 分子式 : C3 N3 ( NH2 ) 3 , 分子量: 126. 12, 结构式:
Vol. 28. No. 8 2009- 8
图 2 鱼粉样品 UPLC MS 图 Fig. 2 The melamine UPLC chromatogram and mass spectrum of fish meal ( a) 色谱图 ; ( b) 质谱图
图 3 鱼粉样品添加三聚氰胺后的 UPLC MS 图 Fig. 3 UPLC chromatogram and mass spectrum of fish meal added with melamine standard ( a) 色谱图 ; ( b) 质谱图
Vol. 28. No . 8 2009- 8
1. 3
实验方法 样 品的提取 称取 5. 00~ 10. 00 g 磨细
2 结果与讨论 2. 1 干扰 据报道, 我国宠物食 物中不含三聚氰 胺, 但 是本实验测定狗粮中含微量三聚氰胺 ( 9. 2 ng g ) 。 方法需考虑两个问题 , 一是方法本身有足够的灵 敏度可检出 ng g 级痕量的三聚氰胺, 二是方法的 分离效果是否能消除干扰。 用 HPLC PAD 测定鱼粉、豆粕等饲 料中的三 聚氰胺 时发 现有 干扰 峰存 在。在三 聚氰 胺标 准 HPLC PAD 谱图中 只有 RT = 10. 8 目 标峰和 PAD 236 nm 吸收峰。鱼粉样品 HPLC PAD 谱图 , 仅 有 RT = 10. 6 min 一杂峰, PAD 中 236. 0 nm 没有吸收 峰, 说明鱼粉中不含三聚氰胺。鱼粉样品添加三 聚氰胺标准, 结果在 RT= 10. 8 min 和 10. 6 min 处 均有峰 , 并且很难将其分开。对于豆粕样品也有 类似情况 , 只是杂质峰更多 , 更难分开。 为确证 干扰 的存 在, 本 实验 用 UPLC MS MS 进行测定。图 1 为三聚氰 胺标准 UPLC MS 谱图 , 仅在 RT = 4 82 min 出现 目标 峰和 母 离子 126 9 ( m z) , 子离子 84 9( m z) 的离子峰。图 2 为鱼粉 样品 UPLC MS 谱图 , 在 RT= 4 82 min 附近有若干 干扰峰 , 但在 MS 选择性离子 中没有出现母 离子
碰撞能量 eV 25 15
1. 3. 1
( < 0 38 mm) 或经匀质的样品于 50 mL 离心管中 , 加入 48 mL ( 10 g L) 三氯乙酸溶液 , 加入 2 mL 饱 和醋酸铅溶液。摇匀 , 超 声提取 20 min 。于 5 ! 10000 r min 离心机上离心 10 min。 如果动物组织样品含有脂肪 , 需用索氏提取 器乙醚脱除脂肪。将脱脂残渣按上述方法处理。 1. 3. 2 纯化 依 次用 5 mL 甲醇和 5 mL 水活化 MCX 柱 , 准 确移取 10 mL 离心上清 液分次上柱。 再用 5 mL 水和 5 mL 甲醇洗涤 MCX 柱, 抽干后用 氨化甲醇 ( 1+ 19) 溶液 5 mL 洗脱。洗脱液于氮吹 仪 50 ! 氮 吹 干, 用 甲 醇 ( 1 + 4) 溶 解 定容 , 过 0. 45 m滤膜, 滤液用于液相色谱测定。 1. 3. 3 测定 条 件 UPLC 色谱 柱 : Atlantis Hilic Silica : 保留窗口开始: 0 min, 结束 : 8 min。离子化方式: ES , MRM 多离子方式使用 条件见表 1。
表 1 ES 下 MRM 条件表 Tab. 1 MRM conditions of ES+ 母离子 ( m z) 126. 90 126. 90 子离子 ( m z) 67. 5 84. 6 循环时间 s 0. 150 0. 150 锥孔电压 V 35 35
+
+
126 9( m z) 和子离子 84 9( m z) 。图 3 为鱼粉添加 标准后的 UPLC MS 谱 图中母 离子 126 9( m z) 出 现, 并在母离子 126 9( m z) 附近有许多杂质峰。 以上说明 , 仅用 HPLC PAD 分析 饲料中三 聚 氰胺 , 如鱼粉、豆粕等样品, 一方面由于有干扰杂 质难以分开, 另一方面灵敏度较低, 难以测定 g L 级的三聚氰胺。可用质谱选择性离子进行确认和 定量 , 消除干扰, 而且灵敏度明显改善。
用仪测定饲料和动物组织中痕量三聚氰胺的方法 , 检出限为 0 01 g L。 1 实验部分 1. 1 仪器 Waters 公司 HPLC PAD 和 UPLC MS MS: MRM 离子化方式 ES+ ; 均质机和旋风磨; 涡流混合器 ; 离心机: 冷冻 ( < 5 ! ) , 转速 > 10000 r min; 离心 管: 50 mL; 混合型固相 萃取柱: Oasis MCX 6 mL 150 mg; 容量瓶 : 100 mL 棕色; 移液管 : 10 mL。 1. 2 试剂与标准 除特殊注明外 , 本方法所用试剂均为分析纯。 水为去离子水 , 符合 GB T 6682 1992 中用一 级水 规定。甲醇、乙 腈: 色谱级 ; 氨水: 25% ~ 28% ; 甲醇溶液 ( 1+ 4) ; 三氯乙酸 ( 10 g L) ; 氨化甲醇 ( 1 + 19) ; 乙酸铅溶液( 22 g L ) ; 20 mmol L 甲酸胺溶 液; 三聚氰胺标准品( 99% ) 。 三聚氰胺标准储备液( 1 0 mg mL) : 准确称取 10. 0 mg 三聚氰胺( melamine, 99. 0% , sigma 公司) , 用甲醇 ( 1+ 4) 溶液溶解并定容至 100 mL, 即 1 0 mg mL 三聚氰胺储备液。 标准工作液: 用甲醇 ( 1+ 4) 溶液稀释配制 10 ~ 100 g L 三聚氰胺标准工作液。
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Toth J P, Bardalaye P G. J Chromatogr. 1987, 408: 335 NY T1372 2007 饲料中三聚氰胺的测定 Wendy C Andersen et al . Laboratory information Bulletin, NO4396, May2007
图 1 三聚氰胺标准 UPLC MS 图 Fig . 1 UPLC chromatogram and mass spectrum of melamine standard ( a) 色谱图 ; ( b) 质谱图