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酶工程实验指导实验一从植物材料中提取制备过氧化物酶一．实验目的学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法，了解纯化酶的一些基本步骤。
比较不同植物材料过氧化物酶的含量与活性，掌握酶纯化的相关计算方法。
二．实验原理过氧化物酶（EC 1. 11. 1. 7）是一类以铁卟啉为辅基的氧化酶，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，在工业上也广泛被应用。
过氧化物酶可溶于水，溶解度约为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明。
此酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而在0.62饱和度以上则不溶。
该酶能催化愈创木酚反应产生有色物质：以此可进行酶活性的测定。
许多植物如辣根、柑桔叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化，得出较纯的制品。
三．主要仪器与试剂仪器：组织捣碎机，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，紫外-可见分光光度计等。
试剂：愈创木酚，丙酮，过氧化氢，硫酸铵等。
四．实验步骤（尽量在冰浴中进行）鲜植物样品约70克，剪碎或捣烂，加少许水研磨成浆（可用捣碎机），转移到500ml的烧杯中，加水至约200ml，于冰箱中浸提约2小时（中间多次搅动）。
多层纱布挤压过滤后离心（4000rpm），10ml上清液用来测酶活力，其余上清液按226克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置1小时以上，离心(4000rpm)去沉淀。
上清液再按258克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置4小时以上。
离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测酶活。
其余酶液用作精制样品。
在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷(-15℃)的丙酮于酶液中，混匀，静置10分钟，低温离心(8000rpm, 4℃) 去沉淀。
按上清液与丙酮之比为1比0.8再次加入预冷丙酮，静置10分钟后离心(8000rpm, 4℃) 收集沉淀，溶于少量水中，透析去丙酮。
猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。
本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。
根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。
关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度1 前言碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。
1.1实验目的掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。
1.2 实验试剂与仪器1.2.1 实验仪器电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机1.2.2实验试剂及配制95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠（1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。
（2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.5mol/L醋酸镁20mL，混匀后用1%醋酸溶液调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000mL即可。
酶工程实验报告册实验目的本次实验旨在通过酶工程技术，利用已知的酶催化反应，研究酶的可控性和催化效率，以此为基础进一步探讨酶工程在生物技术领域中的应用。
实验材料* 酶底物：葡萄糖溶液* 酶：葡萄糖酶* 实验器材：试管、显微镜、荧光分析仪实验步骤1. 准备实验器材和试剂，保证实验环境的洁净。
2. 将葡萄糖底物溶液放入试管中，分为十组，每组添加不同浓度的葡萄糖底物。
3. 将葡萄糖酶加入到每个试管中，调整酶的浓度。
4. 将试管放入恒温水浴中，使反应温度稳定在适宜的酶活性温度。
5. 设置实验时间，每隔一定时间取出一组试管进行荧光分析，记录反应速率。
实验结果根据实验数据得到以下结果：* 反应速率与底物浓度呈正相关关系，随着底物浓度的增加，反应速率也增加。
* 酶活性随着温度的增加呈增加趋势，但超过酶的适宜温度范围后，酶活性会急剧下降。
结果分析本实验结果表明葡萄糖酶催化反应具有高度的可控性和催化效率。
随着底物浓度的增加，酶催化反应速率增加，这可以为工业生产中的底物转化提供重要参考。
而温度对酶活性的影响也表明了酶工程中合适的条件选取的重要性，过高或过低的温度都会影响酶的活性，从而降低反应效率。
实验结论通过本次实验，我们验证了酶工程技术在酶催化反应中的重要作用。
酶工程技术不仅可以提高反应效率，还可以调控酶的活性和特异性，从而对底物进行选择性催化。
这对于工业生产和医药研发有着重要的意义。
实验心得通过本次实验，我深刻认识到酶工程技术在生物技术领域的重要性。
酶工程技术可以帮助我们解决传统催化反应过程中的瓶颈问题，提高反应的效率和选择性。
同时，酶工程技术还为制定合适的反应条件提供了理论依据，进一步推动了生物技术的发展。
总之，酶工程技术的应用前景广阔，未来可以在医药、食品、环境等多个领域中发挥重要作用。
酶工程实验指导西南农业大学农学与生物科技学院2009年3月实验一产蛋白酶菌株的分离一、实验目的学习胞外生产微生物菌种的分离选择，熟悉分离菌种的基本操作。
二、实验原理工业上常用的生产酶的微生物有许多，重要的有枯草杆菌和真菌中的曲霉等等，它们都能产生耐热的芽孢或分生孢子，分离这类菌种时可采取先进行一定的热处理杀灭其它营养细胞，提高该菌株的相对数目。
根据胞外酶能分泌到培养基的特点，采用一定的方法在培养基上形成单菌落分泌的酶形成的“水解透明圈”，可对产酶的微生物的产酶能力（活力）进行初步估计、分离高产酶的微生物。
三、试剂、仪器高压灭菌锅，天平，无菌超净工作台，培养皿（8套/组）、试管（2支/组）、三角瓶、烧杯、酵母膏，蛋白胨，NaCl、琼脂粉，奶粉三、操作步骤1、带菌土壤的热处理称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。
2、分离选择培养基的配制，各组按下列比例配制120ml培养基：奶粉2g ，自来水50ml，装入50ml三角瓶琼脂1.8g ，NaCl 0.5g，自来水70ml，装入100ml三角瓶自来水50ml，装入50ml三角瓶取50ml烧杯一个，放入5支带帽5ml离心管，灭菌备用。
分别封口，常规灭菌（121℃、20min）,灭菌后待冷却至不太烫手时混合上述液体，按无菌操作要领迅速倒平板8个，其中4个加有0.2ml不同稀释倍数（操作5）的样品液（菌悬液），迅速混合冷却形成平板，余4个平板冷却后用于涂布筛选。
3、稀释制备菌液，取5支灭菌带帽5ml离心管，各加入无菌水3.6ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水10ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入0.4ml微生物悬液，混合均匀后再取0.4ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取0.4ml到第三支试管中，以此类推。
4、斜面培养基配制：配制100ml LB培养基，加入1.5g琼脂粉、蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、NaCl、1.0g加水到100ml，调节pH=7,加热融化后，各组倒斜面培养基2 支，灭菌备用。
一、实验目的1. 理解酶工程的基本原理和实验方法。
2. 学习酶的制备、纯化和活性测定等实验技术。
3. 掌握酶的催化特性和应用。
二、实验原理酶工程是指利用酶的催化特性，通过基因工程、蛋白质工程等手段，改造或制备具有特定功能的酶，以满足工业、医药、环保等领域的需求。
本实验通过制备、纯化和活性测定等方法，研究酶的催化特性和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：酶源（如淀粉酶、蛋白酶等）、底物（如淀粉、蛋白质等）、缓冲液、指示剂等。
2. 实验仪器：离心机、电泳仪、紫外分光光度计、酶标仪等。
四、实验步骤1. 酶的制备（1）酶源培养：将酶源接种于培养基中，在适宜条件下培养，使其大量繁殖。
（2）酶提取：将培养好的酶源进行离心分离，收集上清液。
（3）酶浓缩：采用透析、超滤等方法，去除酶液中的杂质，提高酶的浓度。
2. 酶的纯化（1）离子交换层析：根据酶的等电点，选择合适的离子交换树脂，进行酶的吸附和洗脱。
（2）凝胶过滤层析：根据酶的分子量，选择合适的凝胶过滤柱，对酶进行分离和纯化。
3. 酶的活性测定（1）酶活力单位：采用紫外分光光度法测定酶的活性。
（2）酶催化反应速率：测定酶催化底物反应的速率，计算酶的活力。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在不同温度下测定酶的活性，研究温度对酶活性的影响。
（2）pH对酶活性的影响：在不同pH值下测定酶的活性，研究pH对酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶的制备通过酶源培养、酶提取和酶浓缩等步骤，成功制备了酶液，酶浓度达到实验要求。
2. 酶的纯化通过离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化了酶，纯度达到95%以上。
3. 酶的活性测定酶活力单位为：X U/mL；酶催化反应速率为：Y mol/min。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在30℃时，酶活性最高，随着温度升高，酶活性逐渐降低。
（2）pH对酶活性的影响：在pH 7.0时，酶活性最高，随着pH值的变化，酶活性逐渐降低。
实验1、大蒜细胞SOD的提取和分离一、原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。
大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。
由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
二、材料和试剂1、新鲜蒜瓣2、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）3、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:54、丙酮：用前需预冷至4-10℃5、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）6、0.1mol/L EDTA溶液7、2mmol/L肾上腺素溶液三、步骤1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。
2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。
3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。
4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15 min，得到SOD酶液。
5、SOD活力测定将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。
试剂空白管对照管样品管碳酸缓冲液 5.0 5.0 5.0EDTA溶液0.5 0.5 0.5蒸馏水0.5 0.5 -样品液- - 0.5混合均匀，在30℃水浴中预热5min肾上腺素溶液- 0.5 0.5加入肾上腺素后，继续保温2min，然后立即在480nm处测定光密度。
对照管和样品管的光密度值分别为A和B。
在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。
酶工程实验方案一、实验目的通过本实验，学生将学会利用酶工程实验技术，熟悉酶的生产、纯化和应用过程，培养学生实验操作技能和科学研究能力，为学生今后的科研工作打下良好的基础。
二、实验原理酶工程是利用生物工程学原理和技术手段，对酶进行筛选、改造和工程应用。
酶在生产中扮演着极其重要的角色，它广泛应用于食品、医药、环保、能源、材料等领域。
酶工程实验的关键是酶的生产和纯化技术。
典型的酶工程包括：酶源的筛选、酶基因的克隆与表达、酶的纯化和酶的应用等。
三、实验内容本实验将包括以下内容：1. 酶源的筛选：选择一种具有较高酶活性的微生物菌株，进行培养、鉴定，筛选出所需酶。
2. 酶基因的克隆与表达：通过PCR技术扩增酶基因，将其克隆至适当的表达载体中，然后将其转化至表达宿主中，表达目的蛋白。
3. 酶的纯化：采用离心、柱层析、过滤等方法对表达蛋白进行酶的分离和纯化。
4. 酶的应用：将纯化的酶用于特定的生产或研究中，评价酶的性能。
四、实验步骤1. 酶源的筛选（1）选择合适的微生物菌株，进行培养并获得菌液样品。
（2）采集菌液样品，进行酶活性测试，筛选出具有较高酶活性的菌株。
2. 酶基因的克隆与表达（1）利用PCR技术扩增酶基因。
（2）将扩增出的酶基因克隆至表达载体中。
（3）转化表达载体至适当的表达宿主中，进行表达。
3. 酶的纯化（1）收集表达蛋白，进行细胞破碎，得到目的蛋白混合物。
（2）通过离心、柱层析、过滤等方法对蛋白混合物进行纯化。
4. 酶的应用（1）评价纯化酶的性能。
（2）将纯化的酶用于特定的生产或研究中。
五、实验材料和仪器1. 微生物菌株：待定2. 实验宿主：大肠杆菌等3. 载体：pET等4. 酶活性测试试剂盒5. PCR试剂盒6. 离心机、柱层析仪、过滤器等实验仪器七、实验结果1. 酶源的筛选结果：取得具有较高酶活性的微生物菌株。
2. 酶基因的克隆与表达结果：成功将酶基因克隆至表达载体中，并通过转化实现表达。
3. 酶的纯化结果：得到较纯的酶样品。
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。
各瓶时间达5min时立即加 2.0ml25%硫酸终止反应，充分混匀。
用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。
六、计算分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。
[S]=c1V1/10式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）；c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；V1：H2O2体积（ml）；10：反应的总体积（ml）；υ：反应速度（m mol/min）；c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；V2：KMnO4体积（ml）；以1/υ对1/[S]作图求出Km。
实验二酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。
二、实验原理酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。
以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。
在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。
而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。
进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A在0.6～0.7之间。
405（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。
（4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。
四、操作步骤1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d。
长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。
然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。
将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。
2.酶促反应取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。
各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热2min。
然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。
立即摇匀并开始计时。
按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。
待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH终止反应。
冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP 后保温25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光值。
度计上测定各管A4053.数据处理值为纵坐标绘制进程曲线。
由进程曲线中直线部以反应时间为横坐标，A405分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。
表1.1 制作酶促反应进程曲线时各物质加入量五、实验报告绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。
实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定一、目的：了解酶的纯化方法。
二、原理：酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化。
（请参考相关教材）三、试剂与仪器1、试剂与材料：(1)干酵母(2)石英砂(3)1 mol/L醋酸溶液(4)2 mol/L氢氧化钠溶液(5)醋酸缓冲液（pH 4.6）(6)5% 蔗糖溶液(7)D NS（3,5-二硝基水杨酸）试剂2、仪器：电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒、移液管。
四、操作方法1、破碎细胞取2 g干酵母于研钵中，加入2 g石英砂，加30 ml去离子水，研磨15 min，放入冰箱冷冻室（-20℃）冰冻约20min（研磨液面上刚出现冰结为宜）。
取出冷冻酵母，再研磨5 min后，在5000 r/min条件下离心12 min，小心，分别取0.5 ml上清液到试管A、B中，余取出上清液（组分一）并量出体积V1者倒入三角瓶。
2、纯化把三角瓶中的上清液用1 mol/L醋酸溶液调pH 5.0（试纸）。
然后迅速放入到55 ℃的水浴中，保温30 min。
之后在冰浴中迅速冷却。
在5000 r/min条件，分别取0.5 ml上清液到下离心12 min。
取出上清液（组分二）并量出体积V2试管C、D中。
3、酶反应取四支试管，分别按顺序加入反应物：试管中反应物在55 ℃水浴中反应5 min（秒表计时）后，B、D管立即．．各加入1 ml氢氧化钠溶液（2 mol/L）终止反应，A、C管中各加入1 ml蒸馏水。
4、酶催化产物检测取5支试管，分别加入反应物：试管中反应物在沸．水浴中反应5 min，然后冷却。
加入4 ml蒸馏水。
将各试管摇匀，用空白管溶液（5号管）调零点，测定它们的吸光度值A540。
五、结果计算1、酶活力单位的定义：本实验中，蔗糖酶的活力单位指在55℃条件下，每1 min 催化底物转化为1 mg 还原糖的酶量。
2、酶活计算：粗酶的计算酶活（组分一）：5.05.45545)(⨯⨯⨯-ABS ABS A B 纯化后酶的计算酶活（组分二）：5.05.45545)(⨯⨯⨯-ABS ABS C D3、总酶活的计算：总酶活1（组分一，粗酶）：计算酶活×稀释倍数⎪⎭⎫⎝⎛5.01V总酶活2（组分二，纯化后酶）：计算酶活×稀释倍数⎪⎭⎫⎝⎛5.02V4、酶活回收率的计算：酶活回收率 = %10012⨯总酶活总酶活附：还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
实验四蔗糖酶包埋及固定化酶活测定一、目的：了解凝胶包埋法及固定化酶活测定方法。
二、原理：海藻酸钠在遇到Ca2+时成胶，从而把酶包埋在其中。
（请参考相关教材）三、试剂与仪器1、试剂与材料：(8)干酵母(9)海藻酸钠(10)无水氯化钙(11)5% 蔗糖溶液(12)DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂2、仪器：电子天平、分光光度计、水浴锅、电炉、烧杯、玻棒、量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针头）、纱布。
四、操作方法4、配A液取0.75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馏水中，沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。
自然冷却。
5、配B液取1 g干酵母溶在25 ml蒸馏水中（室温），搅匀。
6、配C液A液冷却后，将B液倒入其中，搅匀。
4、配CaCl2液取2.2 g无水CaCl2溶于200 ml蒸馏水中。
5、制备胶珠用注射器（7号针头）将C 液滴入CaCl2溶液，滴时不断搅拌溶液。
