实验一过氧化氢酶米氏常数的测定
一、目的
了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理
H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性
环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km
三、实验器材
1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂
1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）
取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，
2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml
浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加
热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确
浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻
度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释
成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4
五、操作
取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：
表一过氧化氢酶米氏常数的测定
先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加 2.0ml25%硫酸终止反应，充分混匀。用
0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。
六、计算
分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。
[S]=c1V1/10
式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）；
c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；
V1：H2O2体积（ml）；
10：反应的总体积（ml）；
υ：反应速度（m mol/min）；
c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；
V2：KMnO4体积（ml）；
以1/υ对1/[S]作图求出Km。
实验二酶促反应中初速度时间范围测定
一、实验目的
1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；
2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。
二、实验原理
酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
三、实验试剂与器材
1.试剂
（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）
（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）
取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A
在0.6～0.7之间。
405
（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯
精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。
（4）0.3mol/LNaOH溶液
2．器材
恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。
四、操作步骤
1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备
称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d。长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。
2.酶促反应
取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热2min。然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH终止反应。冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP 后保温25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光
值。
度计上测定各管A
405
3.数据处理
值为纵坐标绘制进程曲线。由进程曲线中直线部以反应时间为横坐标，A
405
分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。
表1.1 制作酶促反应进程曲线时各物质加入量
五、实验报告
绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。
实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定
一、目的：
了解酶的纯化方法。
二、原理：
酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化。（请参考相关教材）
三、试剂与仪器
1、试剂与材料：
(1)干酵母
(2)石英砂
(3)1 mol/L醋酸溶液
(4)2 mol/L氢氧化钠溶液
(5)醋酸缓冲液（pH 4.6）
(6)5% 蔗糖溶液
(7)D NS（3,5-二硝基水杨酸）试剂
2、仪器：
电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒、移液管。
四、操作方法
1、破碎细胞
取2 g干酵母于研钵中，加入2 g石英砂，加30 ml去离子水，研磨15 min，放入冰箱冷冻室（-20℃）冰冻约20min（研磨液面上刚出现冰结为宜）。
取出冷冻酵母，再研磨5 min后，在5000 r/min条件下离心12 min，小心
，分别取0.5 ml上清液到试管A、B中，余取出上清液（组分一）并量出体积V
1
者倒入三角瓶。
2、纯化
把三角瓶中的上清液用1 mol/L醋酸溶液调pH 5.0（试纸）。然后迅速放入到55 ℃的水浴中，保温30 min。之后在冰浴中迅速冷却。在5000 r/min条件
，分别取0.5 ml上清液到下离心12 min。取出上清液（组分二）并量出体积V
2
试管C、D中。
3、酶反应
取四支试管，分别按顺序加入反应物：
试管中反应物在55 ℃水浴中反应5 min（秒表计时）后，B、D管立即
．．各加入1 ml氢氧化钠溶液（2 mol/L）终止反应，A、C管中各加入1 ml蒸馏水。
4、酶催化产物检测
取5支试管，分别加入反应物：
试管中反应物在沸．水浴中反应5 min，然后冷却。加入4 ml蒸馏水。将各试管摇匀，用空白管溶液（5号管）调零点，测定它们的吸光度值A540。
五、结果计算
1、酶活力单位的定义：
本实验中，蔗糖酶的活力单位指在55℃条件下，每1 min 催化底物转化为1 mg 还原糖的酶量。 2、酶活计算：
粗酶的计算酶活（组分一）：5
.05.455
45
)(?
??-ABS ABS A B 纯化后酶的计算酶活（组分二）：5.05.455
45
)(?
??-ABS ABS C D
3、总酶活的计算：
总酶活1（组分一，粗酶）：计算酶活×稀释倍数???
??5.01V
总酶活2（组分二，纯化后酶）：计算酶活×稀释倍数???
??5.02V
4、酶活回收率的计算：
酶活回收率 = %1001
2
?总酶活总酶活
附：
还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
实验四蔗糖酶包埋及固定化酶活测定
一、目的：
了解凝胶包埋法及固定化酶活测定方法。
二、原理：
海藻酸钠在遇到Ca2+时成胶，从而把酶包埋在其中。（请参考相关教材）
三、试剂与仪器
1、试剂与材料：
(8)干酵母
(9)海藻酸钠
(10)无水氯化钙
(11)5% 蔗糖溶液
(12)DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂
2、仪器：
电子天平、分光光度计、水浴锅、电炉、烧杯、玻棒、量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针头）、纱布。
四、操作方法
4、配A液
取0.75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馏水中，沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。自然冷却。
5、配B液
取1 g干酵母溶在25 ml蒸馏水中（室温），搅匀。
6、配C液
A液冷却后，将B液倒入其中，搅匀。
4、配CaCl2液
取2.2 g无水CaCl2溶于200 ml蒸馏水中。
5、制备胶珠
用注射器（7号针头）将C 液滴入CaCl2溶液，滴时不断搅拌溶液。静置20 min ，固化胶珠。纱布过滤得到胶珠，用蒸馏水清洗胶珠，称取湿胶珠质量（W1），并记录。 6、催化
取1 g 湿胶珠置于烧杯中，加入20 ml 5%蔗糖溶液，37℃反应10 min ，取出反应液，与胶珠分离，反应终止。 7、酶催化产物检测
将反应液定容至20 ml ，取0.5 ml 稀释至5 ml ，得D 液。 取2支试管，分别加入反应物：
试管中反应物在沸水浴中反应5 min ，然后冷却。加入4 ml 蒸馏水。将各试管摇匀，用空白管溶液调零点，测定它们的吸光度值A540。
五、结果计算
5、酶活力单位的定义：
本实验中，蔗糖酶的活力单位指在37℃条件下，每1 min 催化得到1 mg 还原糖所需酶量。 6、酶活计算：
1 g 固化酶酶活：5
.0205.05105
45
540?
???A
六、思考题
1、海藻酸钙包埋法中钙起什么作用？与豆腐制作中Ca2+的作用有何关系？
2、除了凝胶包埋法，还有哪些包埋方法？其原理是什么？
实验五尼龙固定化木瓜蛋白酶
一、目的：
了解共价交联法固定酶的原理和步骤
二、原理
尼龙是聚酰胺物质，经HCl水解后暴露出游离NH2，NH2与戊二醛反应，尼
龙即成活化载体，可与酶表面NH2反应，把酶连在尼龙上。
三、实验材料、仪器和试剂
1、材料
尼龙布(86或66)，140目，剪成3cm×3cm
2、仪器
(1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱
3、试剂
溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65mol/LHCl溶液
(1)18.6%CaCl
2
(4) 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)
(5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5
(6) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8) (7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液
(8) 0.5mol/L NaCl溶液 (9) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、
1mmol/LEDTA的混合液。
(11)0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。
(12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。
四、操作步骤
1、固定化酶的制备
(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl 2溶液10s ，再浸入18.6%水的甲醇溶液中，轻轻搅拌5min 以上至尼龙发粘。取出后用水洗涤，用滤纸吸干。
(2)将尼龙布用3.65mol/L HCI 溶液在室温下水解45min ，用水洗至pH 值中性（pH 试纸检测）。
(3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min 。
(4)取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH 值7.8)洗涤3次，洗去多余的戊二醛，吸干之后，加入5ml 1mg/mL 的木瓜蛋白酶液，在室温下固定30min 。 (5)从酶液中取出尼龙布，用0.5mol/L NaCl 溶液(用0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH 值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
2、酶活力测定
A ．0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml 激活剂+1ml 酪蛋白液
B ．0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml 激活剂+2ml 10%三氯乙酸+1ml 酪蛋白液
C. 固定化酶一张（剪碎）+2.0ml 激活剂+1ml 酪蛋白液
取三支试管按上述加入反应液，37℃反应15min ，A 、C+2ml 10%三氯乙酸。 三支试管过滤上清液到另三支试管中，以B 管作空白，测试管A 、C 吸光值（280nm ，紫外）
五、结果计算
1.酶活定义：每15min 增加0.001个消光值所需酶量为1个酶活单位。
2.酶活回收=%1002
.0/55
???溶液酶活固定化酶活
六、注意事项
(1)尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。 (2)固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL ，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL 。 (3)酶活性测定的反应时间一定要准确。
实验六、产淀粉酶菌株的快速筛选
一、目的
学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。
二、原理
产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV-淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、简单易行等优点。
图 1 产淀粉酶菌落形成的透明圈
三、材料、试剂和仪器
1、菌的来源
取不同地点的表层土壤。 2、试剂：
RBV-Starch（Sigma）, NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl, 2 mol/L NaOH 无菌水和琼脂粉等。
3、器皿
250mL三角瓶两个、9.0cm培养皿若干、涂布棒、200μL移液枪、200μL枪头若干、牙签若干、指形管若干、10mL具塞刻度试管四支、滴管四支、取样器和塑料直尺等。
4、仪器设备
高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇床、离心机、电子天平等。
四、实验操作步骤
1、器皿的消毒：
培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好，在121℃下灭菌20 min，取出备用。
2、培养基的配制与灭菌
培养基的组成为：RBV-淀粉（1.2 %, w/v），NaNO3(0.2%, w/v), K2HPO4( 0.2 %, w/v) , MgSO4·7H2O （0.1%, w/v）, KCl(0.1%, w/v), 琼脂（2% , w/v）, 调PH至6.0左右。在三角瓶中，121℃灭菌20 min，将灭菌后的培养基倒入培养皿，每皿大约15mL，静置凝固备用。（倒平板之前务必将培养基摇晃均匀，以避免标记的RBV-淀粉在培养基中分布不均匀，影响菌落的观察。）
3、土样的采集及稀释
于校园等不同地点采集土壤样品；取样时，用取样器向下打取1cm左右深度的土样，将从各个地点取得的土样混合；取样点最好选择有机质丰富的地方。
4、富集
称取5.0 g混合土样和0.5 g的淀粉混合，并加入适量的蒸馏水使其湿润，置于培养皿中富集培养24h。
5、菌种的初筛
称取1.0g步骤4所得的土样于灭菌具塞刻度试管中，在超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成），加入无菌水至5mL，振荡后静置，待土壤颗粒沉降后，取上层液1mL转移至另一刻度试管中，加入9mL无菌水，摇匀；从第二支试管中取出1mL转移至第三支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀；再从第三支试管中取出1mL转移至第四支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀。如此重复即得到稀释倍数分别10、100、1000倍的土壤稀释液。
用移液枪分别吸取稀释100和1000倍的样品液50 μL，加入至已凝固的培养基表面，用涂抹棒涂布均匀。将涂过样的培养皿倒置放置，于30℃培养箱里培养，观察菌落透明圈的出现情况。（一般30h后即可出现一些透明圈）。
6、菌株的纯化
于超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成）用接种环挑取长势良好且透明圈直径与菌落直径的比值较大的菌落于平板上划线分离，培养一定时间，进一步分离能形成透明圈的单菌落。并在斜面培养基中保存。
图 2 平板划线分离法示意图
五、结果处理与分析
1、菌落产生透明水解圈的观察
用直尺分别于不同方向测量菌落和水解圈的直径大小，求平均值，并计算透明水解圈直径与菌落直径的比值。
表 1 不同菌落产淀粉酶能力的比较。
菌落编号菌落直径（mm）透明圈直径
(mm) 透明圈直径/菌落
直径
菌落形态特
征
2、侯选菌落的形态观察：
观察并描述分离所得菌株的菌落形态，以大致了解产酶菌株属于那一类菌。
3、你所用的涂布平板法或划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是请分析原因。
六、注意事项
1、进行无菌操作前，将接种所需用具放于台面铁架上，对超净工作台即周围环境进行
75％酒精喷雾，使灰尘沉降，打开紫外灯照射灭菌30min，操作前，用75％酒精喷手杀菌。（在本实验中省去此步）。
2、操作应尽量靠里，在酒精灯的火焰旁工作。
3、实验过程中避免说话、走动。
4、每次涂板后涂布棒均要用火焰灼烧灭菌，冷却后再涂下一块板。
酶工程实验(2010)
实验一植物体内过氧化物酶活性的测定 一、目的 过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。 二、原理 在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片 2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。 3. 试剂及配制： 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。
反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2，充分摇匀）。 四、实验步骤 1. 酶液提取 称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。 2. 酶活性测定 吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。 五、酶活性计算 按下式计算酶的相对活性 △A470 ×酶提取液总量（ml）
酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ------------------- 样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml） 实验二尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法) 原理】 临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清中淀粉酶活力.该法对 淀粉酶活性单位的规定是:在37℃,30分钟,恰好能将0,1%淀粉 溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色)的酶量定为一个活 力单位. 试剂和器材】 1,0.9%氯化钠 2,0.1%淀粉 3,碘化钾-碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中,使 用前稀释10倍)
第一章 习题: 1、根据分子中起催化作用得主要组分得不同,酶可以分为_______与_______两大类别。 2、核酸类酶分子中起催化作用得主要组分就是________,蛋白类酶分子中起催化作用得主要组分就是___________。 3、进行分子内催化得核酸类酶可以分为_______,_______。 4、酶活力就是_____得量度指标;酶得比活力就是__________得量度指标;酶转换数就是________得量度指标。 5、某酶得分类编号就是EC2、2、1、10,其中EC就是指_______。此酶属于_______类型。 6、醇脱氢酶参与得反应表明无氧气参与( ) 7、酶工程就是_____________得技术过程。 8、酶得转换数就是指 A、酶催化底物转化为产物得数量 B、每个酶分子催化底物转化为产物得分子数 C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物得分子数 D、每摩尔酶催化底物转化为产物得分子数 9、酶得改性就是指____________________________、 第二章 1、名词解释 转录、组成型酶、酶得反馈阻遏、分解代谢物阻遏、生长偶联型 2、微生物产酶模式可以分为同步合成型________、中期合成型、________。 3、可以通过添加( )使分解代谢物阻遏作用解除。 A、诱导物 B 激活剂C、cAMP D、ATP 4、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以 A、诱导酶得生物合成 B、阻遏酶得生物合成 C、提高酶活力 D、提高细胞通透性 5、为什么滞后合成型得酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？ 6、操纵子就是由_________、_______与启动基因组成得。 7______________与______就是影响酶生物合成模式得主要因素。 8、RNA前体得加工就是指____________ ?6、从如下实验方法与结果分析酶生物合成得调节作用。 实验方法:将大肠杆菌细胞接种于营养肉汤培养基中,于37°C振荡培养,当OD550为0、3时,经培养液分装到4个小三角瓶中,每瓶17ml培养液。于4个三角瓶分别添加 (A)3ml无菌水 (B)1ml乳糖溶液(0、1mol/L)与2ml无菌水 (C)1ml乳糖溶液(0、1mol/L)、1ml葡萄糖溶液(0、1mol/L)与1ml无菌水 (D) 1ml乳糖溶液(0、1mol/L)、1ml葡萄糖溶液(0、1mol/L)与1mlcAMP钠盐溶液 ?然后在相同得条件下于37°C振荡培养2h,分别取样测定β半乳糖苷酶得活力。 ?实验结果(A)与(C)瓶得β半乳糖苷酶得活力为0,(B)瓶与(D)瓶β半乳糖苷
第一章 1.酶工程：是生物工程的重要组成部分，是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的推广应用，使酶学和工程学相互渗透、结合、发展而成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。 2.化学酶工程：指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用 3.生物酶工程：是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术结合的产物，亦称高级酶工程。 4.酶工程的组成部分？ 答：酶工程主要指自然酶和工程酶（经化学修饰、基因工程、蛋白质工程改造的酶）在国民经济各个领域中的应用。内容包括：酶的产生；酶的分离纯化；酶的改造；生物反应器。5.酶的结构特点？ 答：虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎所有的酶都是蛋白质，因而酶必然具有蛋白质四级结构形式。其中一级结构是指具有一定氨基酸顺序的多肽链的共价骨架；二级结构为在一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等细微结构；三级结构系在二级结构基础上进一步进行分子盘区以形成包括主侧链的专一性三维排列；四级结构是指低聚蛋白中各折叠多肽链在空间的专一性三维排列。具有低聚蛋白结构的酶（寡聚酶）必须具有正确的四级结构才有活性。具有活性的酶都是球蛋白，即被广泛折叠、结构紧密的多肽链，其氨基酸亲水基团在外表，而疏水基团向内。 6.酶活性中心：是酶结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子中相当小的一部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。 7.酶作用机制有哪几种学说？ 答：锁和钥匙模型、诱导契合模型 8.酶催化活力的影响因素？ 答：底物浓度、酶浓度、温度、pH等。 9.酶的分离纯化的初步分离纯化的步骤？ 答：（一）材料的选择和细胞抽提液的制备 1.材料的选择：目的蛋白含量要高，而且容易获得 2.细胞破碎方法及细胞抽提液的制备。为了确保可溶性细胞成分全部抽提出来，应当使用类似于生理条件下的缓冲液。动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪、切碎后放人捣碎机中。完全破碎酵母和细菌细胞。 3.膜蛋白的释放:膜蛋白存在于细胞膜或有关细胞器的膜上。按其所在位置大体可分为外周 蛋白和固有蛋白两种类型 4.胞外酶的分离:胞外酶是在微生物发酵时分泌到发酵液中的。发酵后可通过离心或过滤将菌体从发酵液中分离弃去，所得发酵清液通常要适当浓缩，然后再作进一步纯化。目前常用的浓缩方法是超滤法。 （二）蛋白质的浓缩和脱盐 浓缩方法主要有：沉淀法、吸附法、干胶吸附法、渗透浓缩法、超滤浓缩法
湖北大学 酶工程实验 （0818800193）实验教学大纲 （第2版） 生命科学学院 生化教研室 2014年7月
前言 课程名称：酶工程实验实验学时：16学时 适用专业：生物工程课程性质：必修 一、实验课程简介 酶工程是生物工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。酶工程实验课是生物工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。 二、课程目的 本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。 三、考核方式及成绩评定标准 考核内容包括实验过程中的操作情况，实验记录及结果的准确性，实验报告的书写及结果分析，思考题的回答情况，仪器设备的使用情况及遵守实验室规章制度的情况等，根据这些方面进行成绩评判和记录，综合给出实验总成绩。 四、实验指导书及主要参考书 1．魏群：生物工程技术实验指导，高等教育出版社，2002年8月。 2．禹邦超：酶工程（附实验），华中师范大学出版社，2007年8月 五、实验项目
蛋白质酶工程，课堂提问整理 第一章 1、酶：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。 2、酶工程的研究主要分为三个部分：酶的生产，酶的改性，酶的应用 3、蛋白类酶可以分为六大类，分别是（如图） 4、酶的命名有两种方法：系统名（包括所有底物的名称和反应类型）、 惯用名（只取一个较重要的底物名称和反应类型） 判断： （1）寡聚酶：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个 亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。（√） （2）酶活力指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大， 意味着酶活力越高。（×） （3）青霉素酰化酶不但能催化青霉素侧链的水解作用，而且也能催化逆反应。（√） （4）不同细胞最适PH不同，细胞产酶的最适PH与生长最适PH往往有所不同，同一种细胞，生产不同酶的最适PH不同。（√） 5、酶的必需基团包括：（如图） 6、酶的专一性：指酶对底物及其催化反应的严格选择性。（可分为结 构专一性和立体异构专一性） 7、温度对酶的双重影响：温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低。 8、最适温度：酶促反应速度最快时的环境温度。 9、最适PH:酶催化活性最大时的环境pH。 10、酶促反应速度：在适宜的反应条件下，用单位时间内底物的消耗或产物的生成量来表示。 11、酶活力测定的一般步骤：(P8 )1. 根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。 2. 根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。 3. 在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。 4. 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。 PS:酶的活力的国际单位是IU 12、酶工程：是酶的生产与应用的技术过程，主要任务是通过预先设计，经过人工操作，获得所需的酶，并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。 第二章 1．酶的生产方法：提取分离法，生物合成法，化学合成法 2．遗传密码子的特点：连续性，简并性，普遍性与特殊性 3．酶的生物合成法根据使用的细胞不同分类：微生物发酵产酶，植物细胞培养产酶，动物细胞培养产酶 4．葡萄糖效应的概念：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”，这一现象称葡萄糖效应。 产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。
实验目的：①、了解掌握双酶法制备淀粉糖。 ②、掌握用3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖含量的方法。 目前国内外淀粉糖的生产大都采用双酶法。双酶法生产淀粉糖是以淀粉为原料，先经α-淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成淀粉糖浆。α-淀粉酶又称为液化型淀粉酶，它作用于淀粉时，随机地从淀粉分子内部切开α-1，4葡萄糖苷键，使淀粉水解成糊精和一些还原糖。糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶，它作用于淀粉时，从淀粉分子的非还原端开始逐个地水解α-1，4葡萄糖苷键，生成葡萄糖和一些低聚糖。且糖化酶还有一定的水解α-1，6葡萄糖苷键和α-1，3葡萄糖苷键的能力。 1．仪器：恒温水浴器、烧杯、玻璃棒、天平、量筒及其他常规仪器用具。 2．试剂：生粉、α-淀粉酶、糖化酶、0。1mol/L HCI、无水CaCl2、。碘液、活性炭。1．液化： 取12g生粉，加150mL水配制成淀粉浆，加入0.1gCaCl2，2gα-淀粉酶，在75℃温度下保温45min，使淀粉液化成糊精。液化中可每隔3分钟搅拌一下, 每隔15分钟用碘反应检测，观察颜色变为褐色或棕色的情况，记录观察结果。45min后升温至100℃并保温10min。 2．糖化： 将液化淀粉液冷却至55℃～60℃，用0.1m1/LHCl调pH至4.5～5.0，加入0.5g糖化酶，将水浴槽温度升至60℃，保温糖化过夜，使糊精转变为葡萄糖和低聚糖(淀粉糖浆)。 3．脱色： 淀粉糖浆中加入1g活性炭，在80℃下搅拌15min后，抽滤，得浅黄色透明糖液。 4. 所得糖液中葡萄糖含量的测定。取1 m1滤液，加水稀释到10ml，用3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖含量。
a=(0.406-0.0648)/0.5341=0.64 b=(0.395-0.0648)/0.5341=0.62 实验现象观察 1 6 7 思考题： 1液化时加入0.1gCaCl2的目的是什么？ 答：钙离子有提高热稳定性的作用。 2液化后冷却和调pH的目的是什么? 答：盐酸容易挥发，所以要冷却。 调ph是为了提供酶催化的环境。
猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告 摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。 关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度 1 前言 碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。 1.1实验目的 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。 1.2 实验试剂与仪器 1.2.1 实验仪器 电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机 1.2.2实验试剂及配制 95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠 （1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。 （2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶
酶工程的知识点总结 课题3 探讨加酶洗衣粉的洗剂效果 一、实验原理 1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中，应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。b5E2RGbCAP 2．碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽， 使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。p1EanqFDPw 3．在本课题中，我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题：一是普通洗衣粉和加酶洗衣粉 对衣物污渍的洗涤效果有什么不同；二是在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好，三是添加不同种类的酶的的洗衣粉，其洗剂效果有哪些区别。DXDiTa9E3d 二、实验步骤 1探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤的效果的不同 ①在2个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。②取2块大小相等的白棉布，用滴管在每 块白布上分别滴上等量的墨水，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。③将2个烧杯分别放入同等温度的温水中，保温5分钟。④称取5克加酶洗衣粉和5克普通洗衣粉2份，分别放入2个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。⑤观察并记录2个烧杯中的洗涤效果RTCrpUDGiT 2探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件 ①在3个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。②取3块大小相等的白棉布，用滴管在每 块白布上分别滴上一滴食用油、鸡血、牛奶，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。③将3个烧杯分别放入50摄氏度的热水、沸水和冰块中，保温5分钟。④称取5克加酶洗衣粉3份，分别放入3个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。⑤观察并记录3个烧杯中的洗涤效果。3探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤的效果5PCzVD7HxA 污染物蛋白酶洗衣粉脂肪酶洗衣粉复合酶洗衣粉普通洗衣粉 油渍 汗渍 血渍 观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果。三、注意事项 1．变量的分析和控制 影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量，衣物的质料、大 小及浸泡时间和洗涤的时间等。在这些因素中，水温是我们要研究的对象，而其他因素应在实验中保持不变。选择什么样的水温进行实验需要实验者根据当地一年中的实际气温变化来 确定水温，通常情况下，冬季、春季、秋季和夏季可分别选取 5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃的水温，因为这4个水温是比较符合实际情况的，对现实也有指导意义。jLBHrnAILg 2．洗涤方式和材料的选择。 在洗涤方式中有机洗和手洗两种方式，应考虑其中哪一种比较科学？哪一种更有利于控 制变量？再有，洗衣机又可以分为半自动和全自动两种，相比之下，采用全自动洗衣机比较好，并且应该尽量使用同一型号小容量的洗衣机，其机械搅拌作用相同。关于洗涤材料的选择也有一些讲究。用衣物作实验材料并不理想，这是因为作为实验材料的衣物，其大小、颜 色、洁净程度等应该完全一致，而这并不容易做到；此外，人为地在衣物上增加污物，如血 渍、油渍等，也令人难以接受。因此，选用布料作为实验材料比较可行。在作对照实验时，
1、酶的固定化方法：吸附法、包埋法、共价结合法、热处理法 2、提取酶的有机溶剂有：甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、异丙醇、 3、酶生产的主要方式：固体发酵、液体深层通气发酵、固定化细胞或固定化原生质体发酵 4、酶的抽提剂有：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂等 5、测定酶蛋白含量的方法： 凯氏定氮法、双缩尿法、Folin 酚法、紫外法、色素结合法、BCA法、胶体金测定法 6、影响酶活力的主要因素：温度、PH、底物浓度、酶浓度、抑制剂、激活剂 7、包埋固定化酶的凝胶有：聚丙烯酰胺、聚丙烯醇、光敏树脂、琼脂、明胶、海藻酸钙 8、酶的回收率：是指直接测定的固定化酶的活力占固定化之前的活力的百分比。 9、纯化倍数：就是经过纯化后得到的比活力与纯化前比活力之间的比值。 10、盐析的原理：蛋白质溶液在一定浓度范围内，加入无机盐，随着盐浓度增大，蛋白质的溶解度增大，但当盐浓度增到一定限度后，蛋白质将从溶液中析出。 11、在酶的反应过程中如何确保酶的最适反应温度和最适pH值。 保证最适温度的方法：通过发酵罐的热交换设施，控制冷源或热源流量；通过曲室的通风和加热设备控制。保证最适pH的方法：加酸或加碱，加碳源或氮源物质。 12、在发酵产酶过程中的准备工作： 收集筛选菌种，菌种保藏，细胞活化，扩大培养，培养基的配置，对发酵条件的控制。 13、为什么在测酶活实验中要连续不断的测酶活和酶蛋白含量 因为酶的活性会受温度和PH值的影响 14、终止酶反应的方法： 1、迅速升高温度； 2、加入强酸、强碱、尿素、乙醇等变性剂； 3、加入酶抑制剂； 4、调节反应液pH值。 15、固定化的优点： 1、可反复使用，稳定性高； 2、易与底物和产物分开，便于分离纯化； 3、可实现连续生产，提高效率。 16、培养基的成分：碳源、氮源、无机盐、生长因素、水。 17、菌种保藏方法： 1、斜面低温保藏法 2、液体石蜡油保藏法 3、砂土管保藏法 4、真空冷冻干燥法 5、液氮超低温保藏法。 18、发酵产酶的操作过程：配置培养基、分装、灭菌（112℃—115℃，20min）、孢子悬液（将无菌水加入斜面培养基）、接种、培养（32℃，180r/min，培养72h） 19、测定酶活的方法： 1、在一定时间内，让适量的底物与酶在最适合条件下； 2、加入酶抑制剂或升高温度等方法快速终止酶反应； 3、加一定量的显色剂与底物反应，测定液体的吸光度； 4、根据吸光度值计算出酶活 20、壳聚糖酶如何筛选：采用透明圈法，透明圈法直观、方便、根据壳聚糖不溶于水，以壳聚糖为唯一碳源，培养基浑浊。如果有该酶存在，即可降解壳聚糖为壳寡糖，壳寡糖容易被分解吸收，所以形成透明圈，从而可筛选出产生壳聚糖酶的菌株21、产壳聚糖酶初筛平板有什么现象，为什么 会出现透明圈，其原因是根据壳聚糖不溶于水，以壳聚糖为唯一碳源，培养基浑浊。如果有该酶存在，即可降解壳聚糖为壳寡糖，壳寡糖容易被分解吸收，所以形成透明圈 22、酶反应器： 分批式搅拌罐反应器、连续流搅拌罐反应器、填充床反应器、流化床反应器、模型反应器、鼓泡塔反应器 23、对产酶的菌种的要求是： 1、产酶量高；2、繁殖快，发酵周期短；3、产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；4、能够利用廉价的原料，容易培养和管理；5、安全可靠，非致病菌。 24、在使用离心机时应注意事项 25、尿酶提取过程中为什么要在冰浴中进行 在冰浴中进行可以使尿酶处于低温条件下，低温能降低酶的活性，但不破坏酶的活性，在适合的温度下可恢复酶的活力 26、填充床的制备及应用的要点 装柱——平衡——应用——检测 装柱：均匀、无裂缝、无气泡、平整；平衡：1—2倍柱床体积缓冲液；应用：3%尿素溶液； 检测：定性：纳氏试剂（黄色或棕红色沉淀）——定量：取20ml流出液，用0.05mol/L标准HCL滴定（加2—3滴混合指示剂）
《酶工程》复习 一、名词解释…………………………………………… 1 酶工程：又称酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术，包括化学酶工程和生物酶工程。 2酶的诱导：由于加进某种物质，使酶的生物合成开始或者加速进行，称为酶的生物合成的诱导作用。 3 微滤：以压力差为推动力，截留水中粒径在0.02~ 10m之间的颗粒物的膜分离技术。 4固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶固定在载体上，能使酶发挥催化作用的酶。 5酶的非水相催化：通过改变反应介质，影响酶的表面结构和活性中心，从而改变酶的催化特性。 6 原生质体：脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。 7超滤：超滤是采用中空纤维过滤新技术，配合三级预处理过滤清除自来水中杂质；超滤微孔小于0.01微米，能彻底滤除水中的细菌、铁锈、胶体等有害物质，保留水中原有的微量元素和矿物质。 8 固体发酵：固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水下溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。 二、填空题………………………………………………. 1酶的分类（氧化还原酶）、（转移酶）、（水解酶）、（裂合酶）、（异构酶）、（合成酶）。 2酶活力是（酶催化速度）的量度指标，酶的比活力是（酶纯度）的量度指标，酶转换数是（酶催化效率）的量度指标。 3微生物产酶模式可以分为同步合成型，（延续合成型），中期合成型，（滞后合成型）四种。 4动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、单克隆抗体、多肽因子、酶等（功能性蛋白质）。 5细胞破碎的主要方法有机械破碎法、物理破碎法、（化学破碎法）、（酶促破碎法）。 6有机溶剂的极性系数lgP越小，表明其极性（越强），对酶活性的影响（越大）。 7通常酶的固定化方法有：吸附法、包埋法、结合法、交联法、热处理法。
第一章绪论 问题：试述木瓜蛋白酶的生产方法？ 答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程菌发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行 生产。 (1)提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。 (2)发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，在通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。 (3)植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，在通过植物细胞培养获得 木瓜蛋白酶。 第二章微生物发酵产酶 1、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏(产物阻遏)、分解代谢物阻遏。诱导物的种类？ 答：酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程； 酶的诱导：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用； 产物阻遏（反馈阻遏）：指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成 受到阻遏的现象。 分解代谢物阻遏（营养源阻遏）：是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合 成的现象。 诱导物的种类：诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物，有的也是反应产物。 2、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？ 答：（1）同步合成型特点： a.发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。 b.生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。 （2）延续合成型特点： a.该类酶一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。 b.该酶对应的mRNA是相当稳定的。 （3）中期合成型特点： a.该类酶的合成受分解代谢物阻遏和终产物阻遏。 b.该酶对应的mRNA不稳定。 （4）滞后合成型特点： a.该类酶受分解代谢物阻遏和终产物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。 b.该酶对应的mRNA稳定性高。 选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。 3、可以添加什么解除分解代谢物阻遏？表面活性剂的作用？ 答：（1）一些酶的发酵生产时要控制容易降解物质的量或添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。 （2）表面活性剂的作用：增溶、乳化作用、润湿作用、助悬作用、起泡和消泡作用、消毒和杀菌剂。 4、根据微生物培养方式不同，酶的发酵生产有几种类型？哪种是目前酶发酵生产的 主要方式？按酶生物合成的速度把细胞中的酶分几类？酶的生物合成在转录水平的调 节主要有哪三种模式？微生物细胞生长过程一般分为几个阶段？
酶工程实验指导 实验一从植物材料中提取制备过氧化物酶 一．实验目的 学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法，了解纯化酶的一些基本步骤。比较不同植物材料过氧化物酶的含量与活性，掌握酶纯化的相关计算方法。 二．实验原理 过氧化物酶（EC 1. 11. 1. 7）是一类以铁卟啉为辅基的氧化酶，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，在工业上也广泛被应用。过氧化物酶可溶于水，溶解度约为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明。此酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而在0.62饱和度以上则不溶。该酶能催化愈创木酚反应产生有色物质： 以此可进行酶活性的测定。 许多植物如辣根、柑桔叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化，得出较纯的制品。
三．主要仪器与试剂 仪器：组织捣碎机，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，紫外-可见分光光度计等。 试剂：愈创木酚，丙酮，过氧化氢，硫酸铵等。 四．实验步骤 （尽量在冰浴中进行）鲜植物样品约70克，剪碎或捣烂，加少许水研磨成浆（可用捣碎机），转移到500ml的烧杯中，加水至约200ml，于冰箱中浸提约2小时（中间多次搅动）。多层纱布挤压过滤后离心（4000rpm），10ml上清液用来测酶活力，其余上清液按226克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置1小时以上，离心(4000rpm)去沉淀。上清液再按258克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置4小时以上。离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测酶活。其余酶液用作精制样品。 在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷(-15℃)的丙酮于酶液中，混匀，静置10分钟，低温离心(8000rpm, 4℃) 去沉淀。按上清液与丙酮之比为1比0.8再次加入预冷丙酮，静置10分钟后离心(8000rpm, 4℃) 收集沉淀，溶于少量水中，透析去丙酮。测酶液的酶活，冷冻干燥酶液得较纯的酶制品。 五．过氧化物酶活力测定 按下表于试管中加入试剂（ml） 管号0.2M磷 酸缓冲液 pH6.0 0.05% 愈创木酚 酶液0.04% 过氧化氢 水 1 2 3 1 1 1 1 1 1 1 1 在37℃保温10分钟。管1 作为对照在时间扫描470nm调好零点，混合管2
乙酸乙酯和苯甲醛的气相色谱图 # Time Area Height Width Area% Symmetry 1 2.748 5.3 2.5 0.0286 0.000 2.626 2 2.78 12.2 12.4 0.0154 0.000 0.95 3 2.827 4048.6 4776. 4 0.0139 0.074 0.844 4 2.859 5468212. 5 435181.4 0.2094 99.722 4.14E-2 5 3.673 332.1 96.2 0.0553 0.00 6 0.776 6 3.751 1864.5 282.5 0.099 0.034 0.339 7 4.295 195.5 26.4 0.1032 0.004 0.716 8 8.949 8753.3 1661.1 0.0715 0.160 0.193 9 13.198 23.7 81.1 0.0124 0.000 1.885
1 2.75 3.5 1.7 0.028 0.000 3.109 2 2.782 9.4 10.6 0.0144 0.000 1 3 2.831 3927.9 4558.8 0.0131 0.072 0.835 4 2.866 5380649 428421.7 0.2093 98.701 4.37E-2 5 3.675 314. 6 91. 7 0.052 0.006 0.781 6 3.752 1847.5 271.8 0.0993 0.034 0.333 7 4.298 178.7 22.3 0.1055 0.003 0.73 8 6.39 371.6 31.1 0.1585 0.007 0.386 9 11.325 460.8 31.7 0.1805 0.008 2.274 10 11.764 63716.1 10800.7 0.0798 1.169 0.248
第一章 习题： 1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_______和_______两大类别。 2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是________，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是___________。 3、进行分子内催化的核酸类酶可以分为_______，_______。 4、酶活力是_____的量度指标；酶的比活力是__________的量度指标；酶转换数是________的量度指标。 5、某酶的分类编号是EC2.2.1.10，其中EC是指_______。此酶属于_______类型。 6、醇脱氢酶参与的反应表明无氧气参与（） 7、酶工程是_____________的技术过程。 8、酶的转换数是指（） A、酶催化底物转化为产物的数量 B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数 C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数 D、每摩尔酶催化底物转化为产物的分子数 9、酶的改性是指____________________________. 第二章 1、名词解释 转录、组成型酶、酶的反馈阻遏、分解代谢物阻遏、生长偶联型
2、微生物产酶模式可以分为同步合成型________、中期合成型、________。 3、可以通过添加（）使分解代谢物阻遏作用解除。 A、诱导物 B 激活剂 C、cAMP D、ATP 4、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以 A、诱导酶的生物合成 B、阻遏酶的生物合成 C、提高酶活力 D、提高细胞通透性 5、为什么滞后合成型的酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？ 6、操纵子是由_________、_______和启动基因组成的。 7______________和______是影响酶生物合成模式的主要因素。 8、RNA前体的加工是指____________ 6、从如下实验方法和结果分析酶生物合成的调节作用。 实验方法：将大肠杆菌细胞接种于营养肉汤培养基中，于37°C振荡培养，当OD550为0.3时，经培养液分装到4个小三角瓶中，每瓶17ml培养液。于4个三角瓶分别添加 （A）3ml无菌水 （B）1ml乳糖溶液（0.1mol/L）和2ml无菌水 （C）1ml乳糖溶液（0.1mol/L）、1ml葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1ml无菌水 （D） 1ml乳糖溶液（0.1mol/L）、1ml葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1mlcAMP 钠盐溶液 然后在相同的条件下于37°C振荡培养2h，分别取样测定β-
1、酶的催化作用特点：具有专一性，催化效率高和反应条件温和等显著特点。 2、酶研究的两个方向：理论研究方向和应用研究方向。理论研究方向：酶的理化性质、催化性质、催化机制等。应用研究：促进了酶工程的形成。 3、酶工程的定义：利用酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器，借助于酶的催化作用，通过工程学手段生产产品或提供社会服务的科学体系。 4、酶工程的应用范围：①对生物资源中天然酶的开发和生产②自然酶的分离纯化与鉴定技术③酶的固定化技术④酶反应器的研制与应用⑤与其它生物技术领域的交叉与渗透。 5、酶工程的组成：①酶的发酵生产②酶的分离纯化③酶分子修饰④酶和细胞固定化⑤酶反应器和酶的应用等方面。 6、酶工程的主要任务：通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其最大的催化功能。 8、酶的分类：第1类，氧化还原酶；第2类，转移酶；第3类，水解酶；第4类，裂合酶；第5类，异构酶；第6类，合成酶；第7类，核酸类酶。 9、酶的作用机制：酶的催化机理可能与几种因素有关：酶与底物结合时，两者构象的改变使它们互相契合，底物分子适当地向酶分子活性中心靠近，并且趋向于酶的催化部位，使活性中心这一局部地区额底物浓度大大增高，并使底物分子发生扭曲，易于断裂。在另一些情况中，可能还有一些其他的因素使酶反应速度稍有一些提高，如酶与底物形成有一定稳定度的过渡态中间物——共价的ES中间物，这种ES中间物又可迅速地分解成产物，又如酶活性中心的质子供体和质子受体对底物分子进行了广义的酸碱催化等。 10、酶的催化能力：酶仅能改变化学反应的速度，并不不能改变化学反应的平衡点。酶本身在反应前后也不发生变化例如肽键遇水自发地进行水解的反应极为缓慢，当有蛋白酶存在时，这个反应则进行得十分迅速，可降低反应的活化能。在一个化学反应体系中，反应开始时，反应物(S)分子的平均能量水平较低为“初态”，在反应的任何一瞬间反应物中都有一部分分子具有了比初态更高一些的能量，高出的这一部分能量称为活化能，使这些分子进入“过渡态”，这时就能形成或打破一些化学键，形成新的物质——产物（P）。即S变为P。这些具有较高能量，处于活化态的分子称为活化分子，反应物中这种活化分子愈多，反应速率就越快。活化能的定义是在一定温度下一摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能，单位是焦耳/摩尔。 11、酶的专一性：酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型的反应。如果没有酶的专一性，在细胞中有秩序的物质代谢将不复存在，而且酶的应用将如同其他非酶催化剂那样受到局限。酶的专一性可以分为两类：①绝对专一性：一种酶只能催化一种物质进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的物质进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。 12、酶的专一性确定过程：首先要选择一种该酶可催化的物质作为该酶的作用底物，通过实验确定其最适PH、温度等反应条件，其次是实验底物浓度对反应速度的影响，确定其米氏常数K m，然后用其他有可能是该酶作用底物的物质，在相同条件下逐个进行实验，有时要在不同条件下逐个试验，观察是否有催化反应发生，从而确定该酶是属于绝对专一性还是相对专一性，可作用于一类物质，可以选择几种有代表性的底物，求出各自的值，在某些情况下，不同底物有不同的最适PH值，而PH对K m有一定的影响，此时必须作出不同底物各自的PH曲线。然后再在各自的最适PH值条件下进行试验，以确定各底物相对应的K m值，在进行酶的专一性试验时，所使用的酶和各种底物都要尽可能地纯。对于有对称碳原子的物质，应分别对不同的光学异构进行试验。 13、酶活力是酶的数量的量度指标，酶的比活力是酶纯度的量度指标，酶转换数是酶催化效率的量度指标，而酶结合效率是酶被固定比例的量度指标。
标志酶:通常可以将只分布于细胞内某个特定组分的酶称为标志酶,可以将1 它作为细胞组分鉴别的依据,甚至可以判别组织或器官是否发生病变. 2 必需水:在有机介质中,酶分子需要一层水化层以维持其完整的空间构象,一3 般将维持酶分子完整空间构象所必须的最低水含量称为必需水 4 沉淀分离:是通过改变某些条件或添加某些物质,使酶的溶解度降低,从溶液5 中沉淀析出与其他溶质分离的技术过程 6 超滤:需要增加流体的静压力,改变天然过程的方向,才可能发生含有低分子7 量化合物的溶剂流通过膜,此时的推动力是流体静压力与渗透压的压差 8 差速离心:是指采用不同的离心速度和离心时间,使不同沉降速度的颗粒分9 批分离的方法 10 非竞争性抑制:抑制剂与底物分别于酶分子上的不同点结合而引起酶活性降11 低的抑制作用 12 反竞争性抑制:在底物与酶分子结合生成中间复合物后,抑制剂在于中间复13 合物结合而引起的抑制作用 14 反渗透:是一种以压力差为推动力,从溶液中分离出溶剂的膜分离操作,孔径15 范围在< 20?;(由于分离的溶剂分子往往很小,不能忽略渗透压的作用,故而成为16 反渗透) 17 反胶束：当体系中水浓度低于有机溶剂时,形成胶束的表面活性剂的极性端18 朝向胶束的中部,而非极性端则朝向胶束的外侧,水就被包在了胶束的内部,此时19 的胶束就叫反胶束 20 固定化酶:与水不溶性载体结合,在一定的空间范围内起催化作用的酶.优点: 21 纯化简单,提高产物质量,应用范围广,多次使用,可以装塔连续反应.缺点:首次22
投入成本高大分子底物较困难.方法:吸附法.包埋法(凝胶/半透膜包埋法).结合23 法(离子键/共价键结合法)交联法.热处理法。影响固定化酶性质的因素:酶本身24 的变化.载体的影响.固定化方法的影响。固定化酶活性损失的原因:酶本身的失25 活.酶从载体上脱落.载体的破碎或溶解。固定化酶的性质:固定化对酶活性的影26 响.固定化对酶稳定性的影响.最适pH的变化.最适温度变化.底物特异性与游离27 酶不同.米氏常数Km的变化 28 共阻遏物:酶催化作用的产物或代谢物途径的末端产物使该酶的生物合成受29 阻.引起反馈阻遏的物质,称为共阻遏物 30 竞争性抑制:指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起带的抑制作用,它与31 酶作用底物的结构相似,与酶分子结合以后,底物分子就不能与酶分子结合,从而32 对酶的催化到抑制作用 33 金属离子置换修饰:把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的催34 化特性发生改变的修饰方法 35 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法36 PAGE应用广泛,可用于蛋白质.酶.核酸等生物分子的分离.定性.定量及少量的37 制备,还可测定分子量.等电点等 38 酶工程:酶的生产.改性与应用技术过程 39 酶活力:酶的催化能力,以酶促反应速度来衡量.测定条件:适宜的特定的反40 应条件,样品的适当处理,底物浓度足够大 41 酶活力单位:指酶促反应在单位时间(s,min,h)内生成一定量(mg,μg,μmol) 42 的产物或只记的分支结构可能消耗一定量的底物所需的酶量.酶活力测定方法如43 化学测定法,光学测定法,气体测定法等 44 酶的抑制剂:能够使酶的催化活性降低或者丧失的物质,在抑制剂作用下,酶45
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定 一、目的 了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。 二、实验原理 H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性 环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。 本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km 三、实验器材 1.锥形瓶100～150ml（×6）。 2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。 3.温度计（0～100℃）。 4.微量滴定管5ml（×1）。 5.容量瓶1000ml（×1）。 四、实验试剂 1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0） 取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。 2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。 3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min， 2d后过滤，棕色瓶保存。 4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml 浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加 热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确 浓度稀释成0.004mol/L即可。 5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻
度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释 成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色）。 6、25% H2SO4 五、操作 取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂： 表一过氧化氢酶米氏常数的测定 先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加 2.0ml25%硫酸终止反应，充分混匀。用 0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。 六、计算 分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。 [S]=c1V1/10 式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）； c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）； V1：H2O2体积（ml）； 10：反应的总体积（ml）； υ：反应速度（m mol/min）； c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）； V2：KMnO4体积（ml）； 以1/υ对1/[S]作图求出Km。