猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告
摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。
关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度
1 前言
碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。
1.1实验目的
掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。
1.2 实验试剂与仪器
1.2.1 实验仪器
电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机
1.2.2实验试剂及配制
95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠
（1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。
（2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶
液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.5mol/L醋酸镁20mL，混匀后用1%醋酸溶液调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000mL即可。
（3）0.05mol/L硫酸镁
（4）0.5mol/LNaOH
（5）标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成100ug/mL的原液。
（6）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250。溶于50mL90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
1.2.3 其他用品
手术剪；50mL离心管；烧杯；容量瓶；漏斗；量筒；玻璃棒；滤纸；移液枪（1000uL,100uL）等。
1.3实验材料
猪肝，冰柜冷冻储存
2 实验方法
2.1 猪肝中碱性磷酸酶的提取
将10g新鲜猪肝置于冰箱进行预先冷冻处理后取出，置于玻璃匀浆器内，加入0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液30mL，充分研磨至糊状。将匀浆液倒入刻度离心管中，记录其体积V1=45mL，用移液器吸出0.1mL置另一支小试管中，在此试管中加4.9mLTris－醋酸镁缓冲液（pH8.8），即50倍稀释，待测比活性用，为A液。
加10mL正丁醇于匀浆原液中，用玻棒充分搅匀，然后放置冰浴中20min。用滤纸过滤，滤液置于另一支刻度离心管中。滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心（8000r/min）5min，弃去上清液，在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁20mL，用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积V2=24mL。用移液器吸取0.1mL，置于另一支小试管中，并加入4.9mLTris－醋酸镁缓冲液（pH8.8），即50倍稀释，待测比活性用，为B液。
在溶液中缓慢加入冷95%乙醇，使乙醇最终浓度达30%，混匀后离心（8000r/min）5min。将上清液倒入另一支离心管中，弃去沉淀。上清液中加入冷95%乙醇，使乙醇最终浓度达60%，混匀后离心（8000r/min）5min。弃去上
清液，沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁15mL，用玻棒充分搅拌使其溶解，记录体积V3=18mL。用移液器吸取0.1mL置于另一支小试管中，加入4.9mLTris－醋酸镁缓冲液（pH8.8），即50倍稀释，待测比活性用，为C液。
上述溶液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮最终浓度在33%。混匀后离心（2000r/min）5min，弃去沉淀，上清液置于另一支刻度离心管中，缓慢加入冷丙酮，使丙酮最终浓度达50%，混匀后离心（8000r/min）10min，弃去上清液，沉淀即为部分纯化的碱性磷酸酶。在此沉淀中加入5mLTris－醋酸镁缓冲液（pH8.8）使其溶解，并记录体积V4=9mL。吸取0.1mL置于另一支小试管中，加入4.9mLTris－醋酸镁缓冲液（pH8.8），缓冲液即进行5倍稀释，待测比活性用，为D液。A液，B液，C液，D液冷冻保存。
2.2 碱性磷酸酶酶活力测定
采用对硝基苯磷酸二钠为底物的方法进行测定，测定方法按下表。分光光度计用蒸馏水调0，吸光度每变化0.001为一个活力单位。酶活力U = （OD420- OD420（空白））*1000 。
表1 酶活力的测定方法
空白对照管样品管
1 2 3
蒸馏水1mL 样品1mL 1mL 1mL
Tris-HCl 2mL
混合，30℃，5min
0.5mol/L Na2CO3 1mL 1mmol/L PNPP溶液1mL
混匀，30℃恒温反应10min
1mmol/L PNPP溶液1mL 0.5mol/L Na2CO3 1mL
混匀，测OD420
2.3碱性磷酸酶蛋白质含量测定
按紫外分光光度法，采用牛血清白蛋白配制标准蛋白质溶液。再按表1的方法测出数据，绘制出蛋白质浓度的标准曲线。然后按照下面的方法测出蛋白质浓度：取一只试管，准确加入1mL样品提取液，5mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm波长下比色，记录吸光度。根据吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量。
