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实验二大肠杆菌菌体总蛋白的超声破碎抽提与蛋白质的凝胶过滤纯化[实验原理]利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将蛋白分离纯化出来，供进一步的研究使用。
超声破碎时要产生大量的热，会引起蛋白的变性。
为了避免产生高温，超声时一般使用间隔的脉冲处理，而且应在冰浴中进行。
凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的[仪器、试剂和材料]1、大肠杆菌2、细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0)3、恒温摇床4、小型高速离心机5、超声波组织细胞破碎仪6、玻璃试管，三角瓶7、1.5mL 和5mL 塑料离心管8、“枪”，枪头[实验操作]1、大肠杆菌的培养：从过夜培养的大肠杆菌LB琼脂平板上挑取2-3个菌落，接种5mL LB的玻璃试管中，放恒温摇床中，37℃培养过夜。
2、超声破碎抽提：将培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中，8000转/分离心5分钟，倾去上清液后，在沉淀上面再加培养物，继续离心，将所有的培养物都收集在一起。
每管中加入1.5mL的细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0），用枪吹打，使沉淀悬浮。
将离心管放在小试管架上，将超声波破碎仪的金属头插到离心管中，调整好试管的位置后关上超声破碎仪的门，打开仪器的电源，对每只离心管中的菌体进行超声破碎。
条件：功率80瓦，工作2秒，间隔2秒，每一次处理5个循环。
4次处理后，8000转/分离心5分钟。
取出离心管，在显微镜下观察菌体的破碎情况。
广东省高教厅重点实验室——现代生物技术实验室教材酶工程实验技术华南农业大学广东省教育厅现代生物技术重点实验室酶工程分室2007年11月编者的话华南农业大学现代生物技术实验室酶工程分室是由广东省高教厅和华农大投资建设的教学提高型实验室，面向石牌地区六所高校的高年级本科生及硕士、博士研究生开设《酶工程实验技术》课程。
该课程以实验为主，为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有学生预修―酶工程与蛋白质工程‖。
本课程实验内容分酶源的获取、酶制剂分离纯化及分析鉴定、酶制剂的体外改造、酶制剂的应用和酶基因的重组表达五大部分，具体如下：内容实验序号实验项目名称I、酶源的获取1，5 产淀粉酶菌株的快速筛选、木瓜蛋白酶制剂的制备2 鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离II 、酶制剂的分离纯化及鉴定分析3 纯化鸡蛋清溶菌酶的纯度分析4 纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析5木瓜蛋白酶制剂的制备6 壳聚糖凝胶颗粒固定化木瓜蛋白酶III 、酶制剂的体外改造*实验8 中过氧化物酶在滤纸上固定化的部分亦属此部分内容。
7 酶反应器设计及酪蛋白水解物的制备IV 、酶制剂的应8 消毒液中过氧化氢浓度的酶试纸法测定用9 邻苯二酚双加氧酶基因在大肠杆菌中的高效重组表达V 酶基因的重组表达VI 实验总结及实验总结等。
演示等为满足课程教学的需要，经反复修改，特编写了本实验教材。
本实验指导的编写由王炜军，郭振飞，方颖、刘娥娥老师参加编写，在此一并表示感谢！本实验指导为试用第五版，试用后我们将根据各校修课的情况作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。
2实验一、产淀粉酶菌株的快速筛选一、目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。
二、原理产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV- 淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。
实验一酵母蔗糖酶的提取一、原理酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过超声波破碎细胞、硫酸铵沉淀等步骤，分离纯化酵母蔗糖酶。
二、实验材料、仪器和试剂1.材料活性干酵母2.仪器(1)高速离心机(2)恒温水浴锅(3)超声破碎仪3.试剂(1)1 mol/L醋酸溶液三、操作步骤1.破碎细胞取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30 mL去离子水，研磨30 min，在冰箱中冰冻约10 min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次。
将研磨液转移至大离心管中，12000 r/min离心15 min，弃去沉淀。
2.加热除杂蛋白将上清液转入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50℃的水浴中，保温30 min。
在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。
之后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的转速离心20 min，弃去沉淀。
留0.5 mL上清液为第二组分。
3.乙醇沉淀量出上清液的体积，加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30 min)，于冰浴中温和搅拌20 min。
然后以12000 r/min的转速离心25 min，小心弃去上清液，沉淀沥干。
将沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的转速离心25 min，取出0.5 mL上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步操作。
用尿糖试纸进行半定量测定：在白瓷板每孔中分别滴3滴待测酶液，再加3滴含5％蔗糖的pH 4.6的醋酸缓冲液，搅匀，37℃放置10 min，浸入尿糖试纸，1 s后取出，60 s后比较颜色的深浅，与比色卡对照。
尿糖试纸的原理：尿糖试纸是将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶及无色的化合物固定在纸条上，制成的测试尿糖含量的酶试纸。
溶液（或尿液）中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，形成葡萄糖酸和过氧化氢；过氧化氢在过氧化氢酶的催化作用下形成水和原子氧；原子氧可将某种无色的化合物氧化成有色的化合物。
一、实验目的1. 理解酶工程的基本原理和实验方法。
2. 学习酶的制备、纯化和活性测定等实验技术。
3. 掌握酶的催化特性和应用。
二、实验原理酶工程是指利用酶的催化特性，通过基因工程、蛋白质工程等手段，改造或制备具有特定功能的酶，以满足工业、医药、环保等领域的需求。
本实验通过制备、纯化和活性测定等方法，研究酶的催化特性和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：酶源（如淀粉酶、蛋白酶等）、底物（如淀粉、蛋白质等）、缓冲液、指示剂等。
2. 实验仪器：离心机、电泳仪、紫外分光光度计、酶标仪等。
四、实验步骤1. 酶的制备（1）酶源培养：将酶源接种于培养基中，在适宜条件下培养，使其大量繁殖。
（2）酶提取：将培养好的酶源进行离心分离，收集上清液。
（3）酶浓缩：采用透析、超滤等方法，去除酶液中的杂质，提高酶的浓度。
2. 酶的纯化（1）离子交换层析：根据酶的等电点，选择合适的离子交换树脂，进行酶的吸附和洗脱。
（2）凝胶过滤层析：根据酶的分子量，选择合适的凝胶过滤柱，对酶进行分离和纯化。
3. 酶的活性测定（1）酶活力单位：采用紫外分光光度法测定酶的活性。
（2）酶催化反应速率：测定酶催化底物反应的速率，计算酶的活力。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在不同温度下测定酶的活性，研究温度对酶活性的影响。
（2）pH对酶活性的影响：在不同pH值下测定酶的活性，研究pH对酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶的制备通过酶源培养、酶提取和酶浓缩等步骤，成功制备了酶液，酶浓度达到实验要求。
2. 酶的纯化通过离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化了酶，纯度达到95%以上。
3. 酶的活性测定酶活力单位为：X U/mL；酶催化反应速率为：Y mol/min。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在30℃时，酶活性最高，随着温度升高，酶活性逐渐降低。
（2）pH对酶活性的影响：在pH 7.0时，酶活性最高，随着pH值的变化，酶活性逐渐降低。
酶工程实验报告一一、实验目的本次酶工程实验的主要目的是通过实际操作，深入了解酶的性质、作用机制以及酶的分离纯化和活性测定方法。
同时，培养我们的实验操作技能、观察分析能力和科学思维方法，为今后从事相关领域的研究和工作打下坚实的基础。
二、实验原理酶是一种具有生物催化功能的蛋白质或 RNA 分子。
它们能够在温和的条件下高效地催化各种化学反应，具有高度的特异性和催化效率。
本实验中所涉及的酶主要是蛋白酶和淀粉酶。
蛋白酶能够水解蛋白质中的肽键，将蛋白质分解为小分子肽和氨基酸。
其活性可以通过测定水解产物的生成量或底物的消耗量来进行评估。
淀粉酶能够水解淀粉分子中的α-1,4 糖苷键，将淀粉分解为麦芽糖和葡萄糖等小分子物质。
其活性通常通过测定淀粉的水解程度来确定，常用的方法是碘量法。
酶的分离纯化是基于酶与杂质在物理化学性质上的差异，如溶解度、分子大小、电荷性质等，采用一系列的分离技术，如沉淀、层析、电泳等，逐步去除杂质，获得高纯度的酶。
三、实验材料与设备1、实验材料蛋白酶提取液淀粉酶提取液酪蛋白淀粉溶液福林酚试剂碘液其他化学试剂2、实验设备离心机分光光度计恒温水浴锅移液器电泳仪层析柱四、实验步骤制备酪蛋白底物溶液：称取一定量的酪蛋白，用氢氧化钠溶液溶解，调节 pH 至适宜值，定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的蛋白酶提取液、酪蛋白底物溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入三氯乙酸溶液终止反应。
测定吸光度：离心去除沉淀，取上清液，加入福林酚试剂显色，在分光光度计上测定吸光度。
计算蛋白酶活性：根据标准曲线计算出反应生成的酪氨酸量，从而计算出蛋白酶的活性。
2、淀粉酶活性的测定制备淀粉溶液：称取一定量的淀粉，用缓冲液溶解，加热糊化，冷却后定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的淀粉酶提取液、淀粉溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入碘液终止反应。
