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摘要:为了研究不同发酵时间对益生菌发酵饲料营养成分、体外消化率及饲料品质的影响，试验按照27.5%豆粕、50%酒糟粉、15%菜籽粕和7.5%血粉将饲料原料混合均匀，接种5%益生菌发酵液和35%水分，30℃密封发酵，测定在不同发酵时间时发酵饲料的营养成分、体外消化率、干物质回收率、乳酸菌数量、乳酸含量和pH值。
结果表明:随着发酵时间的延长，饲料中粗蛋白(CP)含量持续显著升高(P＜0.05)，发酵第10天与发酵第15天比较差异不显著(P＞0.05);发酵第15天真蛋白率显著低于发酵第30分钟(P＜0.05);铵态氮(NH3－N)含量和CP体外消化率均随着发酵时间延长极显著增加(P＜0.01);与发酵第30分钟相比，各时间点干物质回收率均显著降低(P＜0.05);饲料中乳酸菌数量随着发酵时间的延长先上升后下降，发酵第10天乳酸菌数量最高;乳酸含量随着发酵时间延长持续极显著升高(P＜0.01);pH值随着发酵时间延长持续极显著降低(P＜0.01)。
说明在此次发酵条件下，最佳发酵时间为6d，饲料营养成分含量、体外消化率、乳酸含量和乳酸菌数量均处于较好水平，干物质回收率较高。
益生菌发酵饲料是一种利用有益微生物对饲料原料进行固态发酵处理，获得含活性益生菌、酶、矿物质和多种未知促生长因子等活性组分的高品质生物饲料，并且发酵饲料中含有低分子质量多肽、寡糖、有机酸(丁酸)等活性物质，发酵处理可降解饲料原料中的抗营养成分，提高其消化率，从而显著提高其营养品质。
研究发现，发酵可提高饲料粗蛋白(CP)含量，如徐文俊等以稻草、玉米芯、麦秆为主料，经金凤菇菌种发酵后其CP含量分别由4.1%提高到10.7%、1.1%提高到21.1%、2.7%提高到10.3%;同样以稻草、玉米芯、麦秆为主料，经凤尾菇菌种发酵后其CP含量分别由4.10%提高到6.74%、1.10%提高到5.52%、2.70%提高到5.67%。
蔡兴旺等研究发现，用秸秆发酵处理玉米秸，发酵后玉米秸中CP含量由4.91%提高到6.09%。
一、乳酸菌检测方法植物乳杆菌的检验1原理植物乳杆菌能在相应的厌氧培养条件下，于MRS培养基表面生长成白色、细密、圆形光滑突起的菌落，根据长出的菌落数和稀释倍数，计算出活菌数。
2仪器与试药2.1 仪器超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱、电冰箱、恒温培养箱（60℃±1℃）、恒温水浴锅、显微镜（10x—100x）、架盘天平（0—500g，精确至0.5g）、250ml锥形瓶、250ml 盐水瓶、灭菌吸管：1ml(具0.01ml刻度）、10ml(具0.1ml刻度）、灭菌平皿（直径90mm）、灭菌试管（15mm×160mm）、灭菌L型玻璃棒等。
2.2 试药酪蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、琼脂等均为生化试剂；无水乙酸钠、柠檬酸三胺、硫酸镁、硫酸锰、葡萄糖、磷酸氢二钾、碳酸钙、吐温-80、氯化钠等均为分析纯；水为双蒸馏水，其他化学试剂均为分析纯。
2.3 MRS琼脂培养基的组成与制备2.3.1培养基的组成酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺3g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.2g、磷酸氢二钾2.0g、碳酸钙20g、吐温-801ml、琼脂15g、蒸馏水1000ml。
2.3.2培养基制备将上述的各组分在80～90℃加热使溶解，校正pH6.2，加蒸馏水至1000ml中，摇匀，分装于盐水瓶，每瓶100ml。
在121℃高压灭菌20分钟，冷却后备用。
2.4营养琼脂平板的制备取冷至45℃左右的MCA琼脂培养基，在无菌的条件下倒入无菌的培养皿中，每平皿各约15ml，待冷却凝固后，备用。
2.5无菌生理盐水的制备称取氯化钠9.0g，用蒸馏水溶解并定容于1000ml量瓶中，摇匀，分装于250ml三角瓶中，每瓶装90ml. 在121℃高压灭菌20分钟，冷却后备用。
3供试品溶液的制备以无菌操作法取检品10.0g，加入盛有90ml无菌生理盐的三角瓶中，充分振荡10分钟，制成1﹕10样品悬液。
发酵饲料用乳酸菌培养条件及保藏工艺研究乳酸菌是一类常见的微生物，广泛应用于食品和饲料加工行业。
其中，发酵饲料中的乳酸菌可以起到促进消化、提高动物免疫力和改善饲料质量等作用。
因此，研究乳酸菌的培养条件及保藏工艺对于发酵饲料的生产具有重要意义。
首先，培养乳酸菌的基本条件包括温度、pH值、氧气供应和营养成分，这些条件对于乳酸菌的生长和代谢均具有直接影响。
温度是很重要的一个因素，一般来说，乳酸菌的适宜温度范围为30-40°C，过高或过低的温度会抑制乳酸菌的生长。
pH值在发酵饲料中也是一个关键参数，一般来说，乳酸菌的适宜pH范围在4-6之间，过高或过低的pH值会导致乳酸菌无法正常繁殖。
其次，氧气供应对乳酸菌的生长也非常重要。
乳酸菌属于厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，在乳酸菌培养过程中要避免氧气的进入。
可以通过选择适当的培养容器和发酵设备以及控制好发酵饲料的水分含量来保证乳酸菌的厌氧条件生长。
最后，营养成分是乳酸菌培养的重要组成部分。
乳酸菌需要碳源、氮源、无机盐和一些必需因子来完成其生长与代谢。
常见的碳源包括葡萄糖、麦芽糖等，氮源则可以选择酵母提取物、氨基酸等。
含有适量的盐类和微量元素的培养基也是必要的。
对于乳酸菌的保藏工艺，可以采取冷冻、干燥和低温保存等方法。
冷冻保存是将培养好的乳酸菌菌种在-80°C的低温环境下保存，可以保持乳酸菌的活力。
干燥保存可以将乳酸菌菌液通过喷雾干燥等方式将菌体转化为粉末状，然后密封保存于冷暗处，可以长时间保存。
低温保存是将乳酸菌菌种保存在-20°C 左右的低温环境下，通过优化保存液的组成和pH值等条件，延长乳酸菌的存活时间。
综上所述，乳酸菌在发酵饲料中的应用非常广泛，研究其培养条件和保藏工艺能够提高其生产效率和质量，对于发酵饲料的生产具有重要作用。
通过适宜的温度、pH值和营养成分，以及采取适当的保藏方法，可以有效地培养和保存乳酸菌，提高其应用效果。
乳酸菌的培养条件和保藏工艺是乳酸菌研究中的关键环节，对于保持其活力、增加其产量以及提高乳酸菌发酵饲料的品质至关重要。
碱处理对玉米芯发酵生产乳酸的影响研究玉米芯是由玉米颗粒去掉后产生的副产品，其含有较高的淀粉和纤维素，是一种非常重要的粮食资源，也是动物饲料和工业产品的主要原料之一。
由于淀粉是一种易于被微生物分解的碳水化合物，因此玉米芯经过发酵处理可以转化为有用的生物产品，例如乳酸。
乳酸是一种重要的有机酸，在医药、化妆品、食品和工业等领域都有广泛的应用。
因此，发酵玉米芯生产乳酸是一种比较有前途的生产技术。
但是，玉米芯在发酵前需要进行碱处理，以改善其发酵性能并提高乳酸产率。
本文将介绍碱处理对玉米芯发酵生产乳酸的影响研究。
一、碱处理原理碱处理是将玉米芯用碱性溶液进行处理，以达到改善其发酵性能和提高乳酸产率的目的。
其主要原理是通过改变玉米芯结构，使玉米芯中的淀粉和纤维素更易于被微生物分解为发酵产物，同时减少杂质等不利于微生物生长的成分，以提高发酵效率。
碱处理一般包括碳酸钠、氢氧化钠和氨水等处理方法。
其中碳酸钠处理是一种优选的处理方法，因为它能够在高温条件下进行处理而不会对玉米芯造成严重的负面影响。
二、碱处理对玉米芯微观结构和化学成分的影响碱处理对玉米芯的微观结构和化学成分有着显著的影响。
一方面，碱处理可以使玉米芯中的淀粉和纤维素更容易被微生物分解，产生乳酸等发酵产物；另一方面，碱处理可以减少玉米芯中杂质和其他不利于微生物生长的成分，以提高发酵效率。
具体来说，碱处理会导致玉米芯微观结构的变化和化学成分的转化，主要表现为以下几个方面：1. 改变微观结构碱处理会导致玉米芯中的纤维素水解，使其成为单糖和二糖等易于消化的低分子化合物。
同时，碱处理会破坏细胞壁结构，使得细胞内的淀粉更加容易被微生物分解，从而提高发酵效率。
2. 降低pH值碱性溶液的加入会使溶液的pH值变成碱性，碱处理后的玉米芯溶解液pH值减小，这对于后续发酵过程有着重要的作用。
3. 提高可溶性糖含量碱处理可以使部分玉米芯中的淀粉水解为可溶性糖，如葡萄糖、果糖等，这些糖对微生物生长有着较好的促进作用。
育肥猪发酵饲料用乳酸菌的培养基及培养条件优化杨胜;张利平;范寰;乔家运;王文杰【摘要】通过正交试验和响应面试验对用于育肥猪发酵饲料的乳酸菌培养基及培养条件进行了优化.结果表明:优化后的培养基配方为酵母粉10 g/L,蛋白胨15 g/L,葡萄糖6 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,MnSO4 0.05 g/L,K2HPO40.2 g/L;优化后的培养条件为培养基初始pH值7.25,培养温度36℃,转速165 r/min.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2013(048)004【总页数】5页(P11-14,19)【关键词】乳酸菌;发酵饲料;育肥牛;培养基;响应面试验【作者】杨胜;张利平;范寰;乔家运;王文杰【作者单位】甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州 730070;天津市畜牧兽医研究所,天津300112;甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州 730070;天津市畜牧兽医研究所,天津300112;天津市畜牧兽医研究所,天津300112;天津市畜牧兽医研究所,天津300112【正文语种】中文【中图分类】Q93-335乳酸菌作为一种益生菌，具有调节机体胃肠道正常菌群、保持其微生态平衡、提高饲料消化率的功能[1].乳酸菌在发酵饲料的过程中能产生乳酸菌素和乳酸等有机酸，形成厌氧环境，可以抑制大肠杆菌等致病菌的增值，降低发病率[2－3].代永刚等报道，乳酸菌可分解食物中的蛋白质和糖类，对脂肪也有微弱的分解能力，能促进食物的消化吸收，产生对风味起决定性作用的芳香类物质，提高饲料的适口性[4].巩德球等研究发现，乳酸菌发酵饲料可以提高饲料消化率，降低料肉比和药物使用量，从而增加效益，生产出更优质安全的产品[5].本研究拟通过正交试验优化乳酸菌培养基，响应面试验优化乳酸菌培养条件，以期为发酵饲料用乳酸菌的大规模生产提供一定的科学参考.1 材料与方法1.1 种子培养基酵母粉10g／L，蛋白胨10g／L，MnSO4 0.05g／L，K2HPO40.2g／L，MgSO4·7H2O 1g／L，葡萄糖6g／L，pH 7.0，121℃灭菌15min.1.2 菌种活化将保存于斜面的菌种接一菌环到种子培养基，40℃、140r／min，培养24h，置于4℃冰箱保存，备用.1.3 种子液制备取40mL种子培养基于100mL三角瓶中，灭菌后接入10%活化的菌种，40℃、140r／min培养24h.1.4 菌体浓度测定菌体浓度的测定用分光光度法[6].1.5 活菌总数计数活菌总数用平板计数法测定[7].1.6 培养基优化正交试验设计试验设计为4因素3水平L9（34）的正交试验[8]，试验因素有酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和MgSO4·7H2O（表1）.1.7 培养条件优化响应面试验设计根据Design Expert 8软件中的Box－Behnken中心组合设计原理，在单因素试验的基础上，以pH、温度和转速3个因素为自变量，益生菌的生物量为响应值，做3因素3水平的响应面分析试验[9].共17个试验点，每个试验3个重复（表2）.表1 L9（34）正交试验因素水平Tab.1 Factors and levels of L9（34）orthogoral experiment （g·L－1）水平 A酵母粉B蛋白胨C葡萄糖D MgSO4·7H2O 1 10 10 5 0.2 2 15 15 6 0.5 3 20 20 20 1.0表2 响应面试验因素水平表Tab.2 Factors and levels of response surface designx2温度／℃x3转速／（r·min－1）水平 x1 pH值－1 6.5 20 140 0 7.0 30 170 1 7.5 40 2002 结果与分析2.1 正交试验结果培养基成分正交分析试验设计结果见表3，从极差（R）可以看出，4种成分对D600的影响次序依次为：酵母粉＞MgSO4·7H2O＞葡萄糖＞蛋白胨，最优组合A1B2C2D1，即酵母粉 10g／L，蛋白胨15g／L，葡萄糖6g／L，MgSO4·7H2O 0.2g／L.表3 培养基成分正交试验结果Tab.3 The results of orthogonal experiment试验号 A B C D D600 1 1 1 1 1 1.939 2 1 2 2 2 1.906 3 1 3 3 3 1.808 4 2 1 2 3 1.885 5 2 2 3 1 1.933 6 2 3 1 2 1.817 7 3 1 3 2 1.676 8 3 2 1 3 1.713 9 3 3 2 1 1.783 k1 5.653 5.5 5.469 5.655 k2 5.635 5.552 5.574 5.399 k3 5.172 5.408 5.417 5.406 k1 1.884 1.833 0.823 1.885 k2 1.878 1.851 1.858 1.800 k3 1.7241.803 1.807 1.802 R 0.160 0.048 0.052 0.085 32.2 验证试验结果在以上优化培养基配方下进行3次验证试验，平均值为1.964.培养4h后乳酸菌进入生长对数期，18h后达到最大生物量，此后培养时间内生物量基本维持稳定.2.3 响应面试验结果2.3.1 响应面实验设计及结果培养基成分优化后，为了得到最佳培养条件，对温度、转速和pH值3个因素进行了响应面设计试验，以培养18hD600为生物量响应值，试验结果见表4.表4 培养条件相应面试验设计及结果Tab.4 Response surface design and its results of culture conditions试验号 x1 pH值x2转速量x3温度生物量1 0 1 1 1.718 2 0 －1 1 1.980 3 0 0 0 2.105 4 －1 0 1 0.316 5 1 0 －1 2.027 6 1 1 0 1.766 7 －1 1 0 0.424 8 0 －1 －1 1.919 9 0 0 0 2.193 10 1 －1 0 1.912 11 －1 －1 0 0.244 12 1 0 1 1.957 13 0 1 －1 1.916 14 0 0 0 2.129 15 －1 0 10.781对表4数据进行二次回归拟合，以生物量（y）为因变量，pH 值（x1）、转速（x2）和温度（x3）为自变量建立回归方程如下：在利用响应面图分析因素对响应值的影响时，如果响应曲面坡度比较平缓，则表明因素变化对响应值影响不大；如果坡度非常陡，则说明因素变化对响应值影响显著[10].从图1～3可以看出，各因素交互作用对响应值对D600的影响，pH值和温度对D600的交互效应最为显著.从表5可知，x1、x12、x22影响是极显著的.F值的大小可以判断各因素对18hD600影响的强弱.F值越大，影响作用越强[11－12].因此各因素影响程度依次是pH值、温度和转速.模型P值＜＜0.01影响是很显著的，失拟项P＝0.115 4＞＞0.05，说明回归方程具有较好的拟合程度，模型选择合适.通过回归模型和图1分析得y极大值是在：x1＝0.506，x2＝－0.179，x3＝0.617，即 pH 值、转速和温度分别在7.25、164.62r／min和36.17 ℃时D600存在最大值，为2.278.考虑到实际操作的可行性，将最优条件在回归方程得到的理论值基础上修正为：pH 7.3，转速165r／min，温度36℃.2.3.2 模型验证在以上优化条件下进行3次验证试验，平均值为2.129，与预测值较为接近，表明预测值与试验值有较好的拟合性，证明响应面分析法得到该乳酸菌培养条件是真实可靠的.表5 响应面方差分析表Tab.5 Variance analysis table of response surface design来源平方和自由度均方 F Pr＞F Model 7.15 9 0.79 75.47 ＜0.000 1 x1 4.35 1 4.35 413.25 ＜0.000 1 x2 6.632E－003 1 6.632E－003 0.63 0.463 2 x3 8.256E－003 1 8.256E－003 0.78 0.416 2 x1x2 0.027 1 0.027 2.55 0.171 4x1x3 0.072 1 0.072 6.81 0.047 7 x2x3 0.017 1 0.017 1.59 0.262 4 x21 2.57 1 2.57 244.38 ＜ 0.000 1 x22 0.18 1 0.18 17.20 0.008 9 x23 5.289E－003 1 5.289E－003 0.50 0.510 0残差 0.053 5 0.011失拟项 0.048 3 0.016 7.82 0.115 4纯误差 4.130E－003 2 2.065E－003所有项7.20 14图1 转速和温度交互作用响应面Fig.1 Effect of ratational speed and temperature on response surface图2 温度和pH值交互作用响应面Fig.2 Effect of temperature and pH on response surface图3 转速和pH值交互作用响应面图Fig.3 Effect of rotatinal speed and pH on response surface2.3.3 生长曲线菌种在接种后前4h生长较为缓慢，为生长迟滞期（0.4×108cfu／mL），4～14h为生长对数期（1.2×108cfu／mL），30h达到最大吸光度，即最大菌体浓度（2.2×108cfu／mL），此后菌体浓度相对稳定（图4）.图4 试验菌种生长曲线Fig.4 The growth curve of strains3 结论采用正交试验和响应面试验对该乳酸菌的培养基成分和培养条件进行了优化，通过分光光度法在波长600nm处测定培养18h的菌体浓度作为评价指标，得到最优培养基配方为酵母粉10g／L，蛋白胨15g／L，葡萄糖6g／L，MgSO4·7H2O 0.2g／L，MnSO40.05g／L，K2HPO40.2g／L.在最优培养基配方基础上，通过响应面试验，确定该乳酸菌最佳培养条件为pH值7.25，转速165r／min，温度36℃.参考文献[1] 姜旭德，游进，王春华.乳酸菌在畜牧业的应用[J].畜牧兽医科技信息，2007（8）：28－29[2] 杨雪海，赵娜，魏金涛，等.植物乳杆菌对致病性大肠杆菌的抑制效果研究[J].饲料研究，2011（1）：27－28[3] 谷巍，郭洪新，杨长庚.微生态发酵饲料在断奶仔猪初步应用的研究[J].饲料博览，2007（23）：37－40[4] 代永刚，田志刚，南喜平.乳酸菌及其生理功能研究进展[J].农产品加工·学刊，2009（7）：24－27[5] 巩德球，关玮，陆逵，等.热带地区乳酸菌发酵饲料对育肥猪生产性能的影响[J].饲料工业，2012，33（15）：26－28[6] 陈金春.微生物学实验指导[M].北京：清华大学出版社，2005：63－65[7] 中华人民共和国卫生部.GB 4789.2－2010食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：标准出版社，2010：1－5[8] 中国科学院教学研究所数理统计组.正交试验法[M].北京：人民教育出版社，1975[9] 李玉珍，肖怀秋，杨涛，等.响应面优化低值豆粕液态制备多肽工艺[J].大豆科学，2012，31（4）：654－654[10] Yin G H，Dang Y L.Optimization of extraction technology of the Lycium barbarum polysaccharides by 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1 实验一、二青贮饲料的加工调制与质量鉴定（一）实验目的青贮饲料是一种保存青绿饲料的简单而又安全的方法，通过学习，掌握调制青贮饲料的基本方法。
（二）实验原理青贮是将新鲜的青饲料切碎，装入青贮窖或青贮塔内，通过封埋措施，造成缺氧条件。
利用乳酸菌的发酵产生乳酸，使其积累到青贮物中的PH值下降到3.8-4.0时，青贮物中的微生物被抑制，从而达到了长时间保存青绿饲料的营养价值的目的。
（三）原料及器材新鲜或经凋萎1-2天的青绿饲料，麸皮，刀，大玻璃罐，塑料膜，细绳，搪瓷盘。
（四）鉴定用仪器及试剂1、滴瓶、烧杯、吸管、玻棒、粗试管、滤纸、白瓷比色盘。
2、甲基红指示剂称取0.1克甲基红溶于60毫升95%的乙醇中，用蒸馏水稀释至250 毫升。
3、澳甲酚绿指示剂称取0.1克澳甲酚绿溶于7.15毫升0.02N氢氧化钠溶液中，用蒸馏水稀释至250毫升。
4、混合指示剂按容量的比例，取甲基红指示剂溶液1份，与澳甲酚绿指示剂溶液1.5份，配成混合指示剂。
5、盐酸、酒精、乙醚混合液比重1.19的盐酸，95%的酒精，分析纯乙醚，按1?3?1 比例混合。
6、硝酸3%硝酸银、盐酸（1?3）、10%氯化钡。
（五）操作步骤：1.切碎：将原料切成1-1.5cm长的小段，在搪瓷盘内用麸皮拌好，混匀。
2.装填：将拌好的原料装入玻璃罐内，一层一层的依次装填，直到凸出玻璃罐为止。
边装边压实，先压周边，后压中间，以防原料中有空气，影响青贮。
3.密封：在装满压实的大玻璃罐上，用塑料膜盖住，并用细绳扎紧。
4.管护：将装好的饲料编号保存，青贮40-60天即可。
（六）青贮饲料的品质鉴定可分为感官鉴定与实验室鉴定1.感官鉴定法根据气味、颜色、质地三方面来评定。
（1）气味品质上等的青贮饲料具有方向味、弱酸味和面包味（4分）。
品质中等的香味淡，具有强烈的醋酸味（3分）。
品质低劣的有腐烂味、浓丁酸味、臭味（1-2分）。
（2）颜色品质良好的青贮饲料呈青绿色（3分）。
发酵饲料中乳酸含量的测定方法微生物发酵饲料的生产菌种主要有乳酸菌、酵母菌和芽孢菌，其中乳酸菌包括发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌3种。
乳酸菌是发酵的主角，其在厌氧条件下大量繁殖占支配地位时产生大量的乳酸，抑制其他不良微生物的生长繁殖，从而制成了优质的微生物发酵饲料。
豆粕中加入乳酸菌后，产品不仅小肽含量高，而且具有乳香味，诱食性极佳。
因此，发酵饲料中乳酸含量的高低是判断微生物发酵饲料品质优劣的一个重要指标。
1原则乳酸在铜离子的催化下，与浓硫酸作用生成乙醛，乙醛能与对羟基联苯作用生成在565nm处有特征吸收的紫色物质。
在一定浓度范围内，乳酸含量与565nm处吸光度呈线性关系，因此可以通过测定565nm处的吸光度来测定乳酸的含量。
2材料、试剂和仪器无水乳酸锂、对羟基联苯、钨酸钠、硫酸铜、氢氧化钙、浓硫酸均为分析纯试剂。
钨酸溶液：0.667mol/l硫酸及10%(w/v)钨酸钠溶液等体积混合，使用前配制；20%(w/v)硫酸铜溶液：称取硫酸铜20g，加蒸馏水定容至100ml；对羟基联苯溶液：称取对羟基联苯1.5g溶于100ml的0.125mol/l氢氧化钠溶液中(配制时加热助溶，溶解后为澄清液体)，贮存于棕色瓶中，保存于4℃冰箱；乳酸标准储存液(0.5mg/ml)：精确称取无水乳酸锂53.25mg，溶于50ml蒸馏水中，加0.5mol/l硫酸10ml，后加蒸馏水定容至100ml，混匀后保存于4℃冰箱。
紫外可见分光光度计、离心机、恒温水浴锅、带塞试管。
3样品预处理1g发酵饲料溶于100ml蒸馏水中，以4000rpm离心10min，以去除细菌和碳酸钙沉淀。
吸收0.5ml上清液，并将其置于干净的离心管中。
加入1mol/L等体积硫酸，静置，10000r/m离心10min，除去硫酸钙（发酵过程中如未加入碳酸钙，则将发酵液离心取上清液）。
取上清液适当稀释，吸取2.00ml稀释剂于干净的离心管中，加入2.00ml钨酸溶液，搅拌均匀，室温静置，直至溶液中出现明显絮状物，10000r/m离心10min，取上清液置于10ml干净的离心管中，将其置于60℃的水浴中约30分钟，冷却后使用。
ICS 65.120B46团体标准T/NAIA 0002—2020发酵饲料中乳酸含量的测定高效液相色谱法（征求意见稿）2020-XX-XX发布 2020-XX-XX实施宁夏化学分析测试协会发布前言本标准的编写格式符合 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分标准的结构和编写》规定编写。
本标准由宁夏化学分析测试协会提出并归口。
本标准由宁夏大学、宁夏饲料工程技术研究中心、宁夏兽药饲料监察所、宁夏饲料工作站、宁夏农林科学院、宁夏昊标检测服务研究院、宁夏化学分析测试协会起草。
本标准主要起草人：辛国省、刘辉、卜姣姣、燕翀、杨仪、丁园、高巧仙、王建林、武晓宏、谢荣国、张小飞、张艳、王京、佐婷婷。
本标准于2020年XX月XX日首次发布。
发酵饲料中乳酸含量的测定高效液相色谱法1 范围本标准规定了发酵饲料中乳酸含量高效液相色谱法。
本标准适用于发酵饲料中乳酸含量的测定。
本方法定量限：800mg/kg。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过在本标准中的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 601 化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T 14699.1 饲料采样3 原理利用乳酸易溶于水的特点，乳酸加水超声提取后，稀释至适当的浓度，试液过滤膜进高效液相色谱仪经C18色谱柱分离，在210nm波长下紫外检测器（或性能相当的检测器）检测，外标法计算乳酸的含量。
4 试剂与材料除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。
4.1 乙腈（色谱纯）。
4.2 磷酸（色谱纯）。
4.3 0.1%磷酸溶液：准确吸取1.0ml磷酸（4.2）溶于水中，定容至1 000 mL。
微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析摘要：通过比较分析羟基联苯比色法、EDTA定钙法、乳酸脱氢酶法3种检测方法的准确性、简便性、经济性，找到适合于测定微生物发酵饲料中乳酸含量的方法。
试验结果表明，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好、迅速，但成本高；EDTA 定钙法检测虽然简便、迅速，但准确性最差；羟基联苯比色法检测效果居中，较为准确和方便。
因此，乳酸脱氢酶法适合于高精度、高效率的检测；EDTA定钙法适合于迅速简便、精度要求不高的检测；羟基联苯比色法可作为企业或科研单位精度要求不高的常规检测。
关键词：发酵饲料；乳酸；羟基联苯比色法；EDTA定钙法；乳酸脱氢酶法Comparative Analysis of Analytical Methods of Lactic AcidContent in Microbial Fermentation FeedsAbstract:To find a method that was used to measure the lactic acid content in microbial fermentation feeds,the accuracy, convenient and economy of hydroxybiphenol colorimetry method, EDTA titration method and lactic ac⁃id dehydrogenase method were contrasted in this study. The results showed that the accuracy of the test result wasbest and rapid using the lactic acid dehydrogenase method, but the cost was higher. The test of EDTA titration meth⁃od was simple and rapid, but the accuracy was worst. The test results of hydroxybiphenol colorimetry method waspreferably, the methods had good specificity and convenient. Consequently, lactic acid dehydrogenase method wasfit for the tests require high precision and high efficiency. The EDTA titration method was fit for the tests requiresimple and rapid, but the accuracy didn t ask for much. The hydroxybiphenol colorimetry method was used for rou⁃tine undemanding accuracy test result in enterprise or institutes of scientific research.Key words:microbialfermentationfeeds;lacticacid;hydroxybiphenolcolorimetrymetho d;EDTAtitrationmeth⁃od;lacticaciddehydrogenasemethod收稿日期：2012-03-22基金项目：龙岩市科技计划重点项目（2011LY18）作者简介：罗建（1962—），男，福建龙岩人，硕士，研究方向为饲料的研发、生产与应用。
*通讯作者：教授，硕士生导师，E-mail：Lyyxy1988@。
′37饲料博览 2012年第5期检测分析微生物发酵饲料的生产与应用是近年来饲料工业和养殖业最热门的话题之一。
随着人民生活水平的不断提高和环境资源的日益恶化，利用农副产品和轻工副产物生产高质量、无污染的微生物发酵饲料已成为缓解饲料资源短缺、提高畜禽产品品质、减少畜产品药物抗生素残留的重要手段[ 1 ]。
微生物发酵饲料的生产菌种主要有乳酸菌、酵母菌和芽孢菌，其中乳酸菌包括发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌3种[ 2 ]。
乳酸菌是发酵的主角，其在厌氧条件下大量繁殖占支配地位时产生大量的乳酸，抑制其他不良微生物的生长繁殖，从而制成了优质的微生物发酵饲料[ 3 ]。
因此，发酵饲料中乳酸含量的高低是判断微生物发酵饲料品质优劣的一个重要指标。
目前，乳酸含量的测定方法主要有羟基联苯比色法、EDTA定钙法、高效液相色谱法（HPLC）、酶法等，均有各自的适用范围和优缺点[ 4-7 ]。
本文通过比较分析微生物发酵饲料中不同乳酸测定方法，以期得到适合于中小型饲料厂或科研单位快速、简便检测产品乳酸含量的方法。
1 材料与方法1.1 试验材料微生物发酵饲料由福建省龙岩市金和动物饲料有限公司提供。
在规定的发酵时间内发酵完成后取样品1g，测定其乳酸含量。
1.2 乳酸测定方法1.2.1羟基联苯比色法标准曲线的绘制：分别配置乳酸标准液1、2、3、4、5、6 μg·mL-1，在比色管中分别加入乳酸标准液1 mL、4.0%硫酸铜溶液0.05 mL，再加入6 mL，反应5 min，冷却至20 ℃以下后，再分别于各比色管中加入1%碱溶性羟基联苯溶液0.05 mL，混合均匀，在室温下放置6~8 h，过夜，在570 nm下进行比色测定，绘制出标准曲线[ 8 ]。
样品测定：1 g发酵饲料溶解于100 mL蒸馏水中，4 000 rpm离心10 min，取上清液，按标准曲线测定样品中乳酸含量（%）。
1.2.2 EDTA定钙法称取样品1 g（准确至0.0002 g）于100 mL杯中，加水80 mL，在电炉上加热至近沸，继续加热5 min（溶液不要溢出），冷却，定容至100 mL，待溶液澄清后（或过滤），吸取上清液（滤液）10 mL于锥形瓶中，加三乙醇胺10 mL、蒸馏水50 mL、200 g·L氢氧化钠溶液10 mL、盐酸羟胺0.5 g摇匀后，再加钙混合指示剂少许，立即用EDTA标准溶液0.05 moL·L-1滴定，溶液呈现纯蓝色为滴定终点。
乳酸的测定结果计算公式见式（1）。
乳酸浓度（g·L-1）= 90.08×C×V（1）式中，V为滴定所消耗EDTA溶液体积（）；C为EDTA浓度（moL·L-1）；90.08为乳酸的摩尔质量。
为便于与其他方法测定结果比较，乳酸的测定结果最终转换成每克饲料乳酸含量（%）。
1.2.3乳酸脱氢酶法酶法测定乳酸含量操作步骤见表1。
酶法乳酸检测试剂盒购自南京建成生物工程有限公司，按照其使用说明，预先配置好酶工作液和反应显色剂（标准液和终止液试剂盒中已配好，直接使用）。
取饲料样品1g溶解于50 mL蒸馏水中，4 000 rpm10 min，取上清液待测，蒸馏水调零，测定波长为530 nm。
测定结果计算公式见式（2）。
式中，C为样品浓度mmoL·L-1；50为样品稀释倍数。
同理，乳酸的测定结果最终转换成每克饲料乳酸含量（%）。
2 结果与分析2.13种方法测定发酵饲料乳酸含量分别采用羟基联苯比色法、EDTA定钙法、乳酸脱氢酶法测3种方法对同一发酵批次的微生物发酵饲料进行测定，取样3批、每批重复3次，进行统计学分析，结果见表2。
试剂蒸馏水3 mmoL·L-1标准液样本酶工作液显色剂混匀，37 ℃水浴准确反应10 min终止液加样管空白管0.02－－10.22标准管－0.02－10.22测定管－－0.0210.22表1 酶法测定乳酸含量操作步骤mL乳酸浓度（mmoL·L-1）=（2）382012年第5期饲料博览检测分析2可知，同一批次间和不同批次间检测，平均误差最小的方法是乳酸脱氢酶法，最差的是EDTA定钙法；对于同一批次检测结果，羟基联苯比色法和乳酸脱氢酶法检测结果差异不显著（P >0.05），而与EDTA定钙法差异显著（P<0.05）。
2.23种方法测定发酵饲料乳酸含量应用性分析3种方法测定发酵饲料乳酸含量应用分析结果见表3。
由表3可知，3种方法中，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好，操作也最为简便，且检测时间也最短，但成本较为昂贵；定钙法虽然操作简便，检测时间也不太长，但检测准确性最差，误差较大，结果较不可靠；羟基联苯比色法检测效果处于另外两个方法之间，检测较为准确和方便。
3 讨论发酵饲料中乳酸含量的高低是判断其产品品质优劣的一个非常重要指标，但目前我国对饲料中乳酸含量的测定方法报道较少。
本文探讨了3种检测发酵饲料中乳酸含量的方法，结果表明，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好、迅速，但成本较高，该方法适用于某特定时期抽检样品，需迅速得到准确结果的场合；EDTA定钙法检测的准确性最差，但操作简便、迅速，只适用于只需得到检测样品乳酸含量大概数值的场合；羟基联苯比色法检测效果居中，可作为企业或科研单位精度要求不高的常规检测发酵饲料样品中乳酸含量的一种方法。
发酵液中乳酸含量的测定方法还有HPLC法、生物传感器法等。
这两种方法检测结果可靠、快捷迅速、专业性强，并可同时检测产品中其他物质（如有机酸、葡萄糖等）的含量。
樊永红试验结果表明，在同一发酵批次的乳酸含量测试中，EDTA钙法与HPLC法、生物传感仪法有显著差异（P<0.05），而HPLC法与生物传感仪法无显著性差异（P>0.05）；EDTA定钙法简便快速，但重复性差；HPLC法准确、灵敏；生物传感仪测定法比较准确和方便[ 9 ]。
如发酵饲料生产企业有财力购置相关的设备，此方法也可作为微生物发酵饲料中乳酸含量的检测方法，检测结果可能更为真实可靠。
[ 参考文献 ][ 1 ]陆文清.发酵饲料生产与应用技术[M].北京:中国轻工业出版社, 2011.[ 2 ]林标声,罗建,戴爱玲,等.微生物发酵饲料对断奶仔猪生长性能的影响[J].安徽农业科学, 2010, 38（5）: 2 378-2 380.[ 3 ]余伯良.发酵饲料生产与应用新技术[M].北京:中国农业出版社, 1999.[ 4 ]高庆,印建和,穆华容,等.对羟基联苯法测定啤酒中乳酸[J].酿酒, 2005（6）: 93-95.[ 5 ]郑志,姜绍通,潘丽军. EDTA定钙法测定发酵液中乳酸含量的探讨[J]., 2003, 24（3）: 102-105.[ 6 ]白冬梅,班睿,赵学明,等.反相高效液相色谱法测定米根霉乳酸发酵液中的乳酸[J].色谱, 2000, 18（6）: 527-528.[ 7 ]柳畅先,度浔,.酶法测定乳酸[J].分析试验室, 2005, 24（9）: 75-77.[ 8 ]梁琼,鲁明波,卢正东,等.对羟基联苯法定量测定发酵液中的乳酸[J].食品科学, 2008, 29（6）: 357-360.[ 9 ],王丽,柳丹,等.米根霉发酵液中乳酸含量的测定方法研究[J].生物技术, 2007, 17（1）: 54-55.注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P <0.05），肩标不同大写字母者表示差异极显著（P<0.01），肩标相同写字母或不标注者表示差异不显著（P>0.05）。
