饲料中粗蛋白质的测定
一、目的
掌握饲料中粗蛋白质的测定方法，并测定饲料中粗蛋白质的含量。
二、原理
饲料中纯蛋白质和非蛋白氮总称粗蛋白质。凯氏法的基本原理是用浓H2SO4在还原性催化剂(CuSO4、K2SO4、Na2SO4等)的催化作用下消化饲料样本，使其中的蛋白质和非蛋白氮都变为NH４＋，NH４＋立即被浓H2SO4吸收成为(NH4)2SO4，(NH4)2SO4在浓碱作用下放出NH3，通过蒸馏，氨气随水蒸汽沿冷凝管流入硼酸吸收液被硼酸吸收并与之结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿混合指示剂作指示剂，用标准HCL溶液滴定，求出氮含量，根据不同饲料再乘以一定的换算系数(通常用6.25计算)，即为粗蛋白质的含量。
上述原理的主要化学反应如下：
2.(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3↑+2H2O+Na2SO4
3.H3BO３+NH3→NH4H2BO3
4.NH4H2BO3+HCL→NH4CL+H3BO3
三、仪器设备
1.实验室用样品粉碎机：40目网筛。
2.分析天平：感量0.0001。
3.电子天平: 感量0.001。
4. 六联电炉: 6×1000W。
5.改良式半微量凯氏定氮仪(图1)。
6.酸式滴定管:25ml。
7.凯氏烧瓶:100ml。
8.烧杯:250ml。
9.三角瓶:150ml。
10.容量瓶:100ml。
11.移液管:10ml。
12.量筒: 10ml 。
13.量筒:25ml。
四、试剂
1.浓H2SO4：化学纯,含量为98%，无氮。
2.混合催化剂：CuSO4:Na2SO4=1:10 化学纯。
3.甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：0.1%甲基红酒精溶液与0.5%溴甲酚绿酒精溶液等体积混合，阴凉处保存期不超过三个月。此混合指示剂在碱性溶液中呈蓝色，中性溶液中呈灰色，强酸性溶液中呈红色。在硼酸吸收液中呈暗紫色，在吸收氨的硼酸溶液中呈兰色。
4.2%硼酸吸收液：溶2g化学纯硼酸于100ml蒸馏水中，加甲基红—溴甲酚绿混合批示剂0.4ml。
5.40%饱和NaOH溶液：溶40克氢氧化钠（化学纯）于100ml蒸馏水中。
6.0.05mol/l的HCL标准液：取分析纯浓HCL(比重1.19)4.2ml，加蒸馏水稀释至1000ml，用基准物质标定。将基准无水碳酸钠（分析纯）于270-300℃灼烧40分钟称重，至恒重，准确称取0.013-0.015克，溶于50ml 蒸馏水中，加2滴甲基红—溴甲酚绿混合指示剂，用欲配的0.05mol/lHCL滴定至暗紫红色，记录HCL用量
五、测定步骤
1.样本的消化：
精确称取饲料样本0.5-1g，以硫酸纸卷无损的移入消化管中，再加入5氺硫酸铜0.4克，无水硫酸钾或硫酸钠6克，加10ml浓硫酸后将凯氏烧瓶放于通风橱的电炉子上消化(为防止消化时液体溅失，可再加两粒玻璃珠)。
注意：先低温加热(100-200℃)，注意防止泡沫浮起，待泡沫消失后，提高加热温度(约360-410℃)
至沸腾。消化时要经常转动凯氏烧瓶，如果有黑色炭粒不能全部消化，待烧瓶冷却后，补加少量浓硫酸后继续消化至溶液澄明无黑点并呈蓝绿色为止，移出电炉，放于凯氏消化架上冷却。
2.转移：将冷却的消化液加少许蒸馏水约20ml，摇匀后无损移入100ml容量瓶，再用蒸馏水反复冲洗烧瓶数次，直至消化液全部转入容量瓶中，冷却至室温后以蒸馏水定容至刻度。即为试样分解液。
3.空白实验：另取凯氏烧瓶一个，加入混合催化剂（同前），浓硫酸10ml，同样消化至澄清，冷却后按上述方法转移至容量瓶中，定容至刻度备用。
4.蒸馏：取35ml 2%硼酸溶液于锥形瓶中，加混合指示剂2滴，将冷凝管的末端浸入硼酸液面下，准确移取试样分解液10-20ml，注入蒸馏反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加400g/L 氢氧化钠溶液10ml，小心的拉起玻璃塞使之进入反应室，将玻璃塞好，入口处加水封好，防止漏气，蒸馏4分钟，式冷凝管离开液面，在蒸馏1分钟，然后停止蒸馏。
（说明：就蒸馏方法来看，商业部门多用半微量法，农业部门多用常量法，本书主要介绍半微量凯氏定氮法。）１－蒸馏瓶反应室
５.滴定：先将酸式滴定管准备妥当，装入0.02mol/l（0.1mol/l）的HCL标准液，然后将吸收液用HCL滴定，至瓶中溶液由蓝绿色变成灰红色为止，记录HCL用量(ml)。
空白消化液的测定与上述方法相同。
六、测定结果的计算
式中：V1—样品滴定时HCL的用量(ml) 。
V0—空白滴定时HCL的用量(ml)。
V2—样品消化后定容的体积(ml)。
V3—蒸馏时，吸收样品消化液的体积(ml)。
C—标准盐酸溶液的浓度(mol/L)。
W—样品重(克)。
6.25—氮换算成蛋白质的平均系数。
0.0140—每ml吸收HCL相当于0.0140克氮。
七、注意事项
1.消化时开始时一定要用小火，当泡沫停止产生后才能加大火力。
2.消化时间一般为4小时左右即可，时间过长会引起氮的损失，但若样品中赖氨酸或组氨酸较多时，时间需延长1-2倍。因为此二种氨基酸中的氮短时间内不易消化完全。
3.样本含脂肪或糖较多时，消化时间要延长，同时应避免产生气泡而溢出瓶外，一旦产生大量泡沫，可摇动烧瓶并减少火焰，必要时停止加热一段时间。
4.蒸馏过程中，要严防仪器接头处漏气现象。
5.重复性：每个试样取两个平行样进行测定，结果取其平均值。
７.精密度要求：粗蛋白含量在25%以上者允许相对误差1%；粗蛋白含量在10-25%者允许相对误差2%；粗蛋白含量在10%以下者允许相对误差3%。
