药物体外抗菌实验反思
药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力。该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。
本次药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制。因此，药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。
药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。本次实验采取的是琼脂扩散法。它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面。抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散、其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内。由于药物的抗菌效应、试验菌不能生长、此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
一、实验目的
本实验旨在通过体外实验方法，筛选具有抗炎活性的天然萜类化合物，并初步探讨其作用机制，为开发新型低毒高效的抗炎药物提供实验依据。
二、实验材料
1. 植物材料：大戟属植物金刚纂（Euphorbia neriifolia L.）、火殃簕（Euphorbia antiquorum）、霸王鞭（Euphorbia royleana）等植物乙酸乙酯萃取相不同馏分。
2. 细胞材料：RAW264.7巨噬细胞。
3. 试剂：脂多糖（LPS）、NO检测试剂盒、甲醇、水等。
4. 仪器：细胞培养箱、酶标仪、离心机、显微镜等。
三、实验方法
1. 细胞培养：将RAW264.7细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2的条件下培养，待细胞生长至对数生长期时用于实验。
2. 脂多糖诱导：将细胞接种于96孔板，培养24小时后，加入不同浓度的脂多糖诱导细胞产生炎症反应。
3. 药物筛选：将不同植物乙酸乙酯萃取相不同馏分按一定浓度梯度加入脂多糖诱导的细胞中，培养24小时后，检测细胞上清液中NO的含量。
4. 活性部位分离纯化：对具有较好抑制活性的植物乙酸乙酯萃取相不同馏分进行分离纯化，得到单体化合物。
5. 作用机制探讨：通过检测细胞内炎症相关因子（如IL-1β、TNF-α等）的表达水平，初步探讨萜类化合物的抗炎作用机制。
四、实验结果
1. 药物筛选：经实验检测，金刚纂、火殃簕、霸王鞭等植物的70%和90%甲醇/水馏分具有较好的抑制活性，其中90%甲醇/水馏分的IC50分别为0.4g/mL、15.0g/mL、6.85g/mL。
2. 活性部位分离纯化：对具有较好抑制活性的植物乙酸乙酯萃取相不同馏分进行分离纯化，得到多个单体化合物。 3. 作用机制探讨：实验结果表明，萜类化合物能够抑制炎症细胞因子IL-1β、TNF-α的表达，提示其可能通过调节炎症信号通路发挥抗炎作用。
五、讨论
本实验通过体外实验方法，筛选出具有抗炎活性的天然萜类化合物，为开发新型抗炎药物提供了实验依据。实验结果表明，金刚纂、火殃簕、霸王鞭等植物的乙酸乙酯萃取相不同馏分具有较好的抗炎活性，且其活性部位分离纯化得到的单体化合物也具有一定的抗炎作用。
微量肉汤稀释法（borth microdilution method）
实验方法：
1. 用无菌蒸馏水在聚丙烯离心管中将抗菌肽和抗生素溶解制成1280 g/L的储备液，然后用等量无菌的0.02%乙酸（含0.4% BSA）稀释，在用0.01%乙酸（含0.2% BSA）溶液对等量稀释后的溶液在进行一系列的双倍稀释，得到质量浓度为640，320，160……1.25 mg/L的共10个梯度的系列稀释液，4 ˚C下保存备用。
2. 将待测细菌在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于灭菌试管中的MH肉汤，37 ˚C，180 r/min过夜培养。将培养后的菌液稀释至2*10^5-7*10^5 CFU/mL，向无菌的96孔平板中的1-11孔各加入100 µL的菌液，12孔不加入菌液而加入100 µLMH肉汤，然后从1～10孔逐一加入相应的待测抗菌肽，11孔作为扫描对照组不加肽。37 ˚C，90 r/min培养18-24 h，这样待测抗菌肽的终质量浓度分别为64，32，16，……0.125 mg/L。（不知道待测抗菌肽添加量是多少，最终抗菌肽的终浓度怎么缩小了10倍）
3. 最小抑菌浓度MIC（mininmal inhibitory concentration）就是能阻止50%以上细菌生长的最小肽浓度。用酶标仪在490 nm下对平板进行扫描，肽的MIC的确定按照比对照孔（11孔）的浑浊程度低50%以上的最小质量浓度计算。
4. 最小杀菌浓度MBC（minimal bactericidal concentration）就是能抑制任何残余菌落生长的肽的最低浓度。从没有细菌生长的平板孔中的内容物中取10 µL涂布到MH琼脂平板上，37 ˚C培养18 h，以此来确定肽的MBC。
参考文献：
【1】汪以真，抗菌肽与抗生素的体外抗菌效果比较[J].中国兽医学报，2004，24（3）：270-273.
抗菌肽的体外抑菌实验（平板法）
１４６ 中国感染与化疗杂志２００８年３月２０日第８卷第２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，Ｍａｒ ２００８，Ｖｏ１．８，Ｎｏ．２
肺炎链球菌对泰利霉素等抗菌药物的体外抗菌活性
杨银梅， 叶惠芬， 钟丽嫦， 何绿茵， 彭娅娅， 陈惠玲 ・实验研究・
摘要： 目的 了解本院分离的肺炎链球菌对泰利霉素等抗菌药物的体外抗菌活性。方法 对本院２００５－－２００７年从各种临
床标本收集的９７株肺炎链球菌，用Ｋ—Ｂ纸片法进行药敏试验，测定这些菌株对泰利霉素等３种新近上市和其他７种临床常用
抗菌药物的耐药性。结果９７株肺炎链球菌对泰利霉素和利奈唑胺的敏感率均为１Ｏ０ ，对喹奴普丁一达福普汀也未发现耐
药菌株，只是有１８．８ 的菌株表现为中介。其他抗菌药物的耐药情况如下：对红霉素、克林霉素、万古霉素、左氧氟沙星、氯霉
素和四环素的耐药率分别为６０．８ 、５８．８ 、０ 、２．１ 、１２．８ 和６４．５ ，对青霉素的敏感率为８５．６ 。结论 本院尚未用
于临床的３种新近上市的抗菌药物泰利霉素、利奈唑胺和喹奴普丁一达福普汀，对本院分离的肺炎链球菌有良好的体外抗菌活
性。而上述细菌对红霉素、林可霉素以及四环素有较高的耐药性。
关键词：泰利霉素；肺炎链球菌； 耐药性
中图分类号：Ｒ３７８．１４ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００９—７７０８（２００５）０２—０１４６—０２
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｅｌｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ｓｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
ＹＡＮＧ Ｙｉｎ—ｍｅｉ，ＹＥ Ｈｕｉ—ｆｅｎ，ＺＨＯＮＧ Ｌｉ—ｃｈａｎｇ，ＨＥ Ｌｉｉ—ｙｉｎ，ＰＥＮＧ ｙｎ—ｙａ，ＣＨＥＮ Ｈｕｉ—ｌｉｎｇ．
（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｆｉｒｓｔ Ｐｅｏｐｌｅ Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０１８０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｅｌｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
实验六、抗菌药物的体外药效试验
（药敏试验）
各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。
［目的要求］
1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。
［实验原理］
常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。
1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。革兰氏阴性球菌如淋球菌等。革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。
