叶盘法遗传转化

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。

二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。

共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。

三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。

2.植物幼苗。

（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。

取自无菌试管苗。

取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。

（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。

取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。

从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。

取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。

转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。

1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。

◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。

◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。

◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。

1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。

植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。

原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。

多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。

叶盘法转基因烟草技术实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。

二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。

农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。

土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。

这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。

三. 试剂及设备1.试剂：MS培养基：配方见“植物的组织培养技术”实验指导Kan：卡那霉素Cb：羧苄青霉素NAA：萘乙酸6-BA：细胞分裂素T1培养基：MS培养基T2培养基：MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+Kan100 mg/L+Cb500 mg/LT3培养基：MS培养基+ Kan100 mg/L+Cb500 mg/L（T2：生长培养基；T3：生根培养基）2.仪器：光照培养箱，恒温摇床，超净工作台，接种器械等四.实验步骤：1 农杆菌培养1）从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3 ml YEB 液体培养基中（Str 25 μg/ml、Rif 50 μg/ml、Kan 80 μg/ml）于恒温摇床上27℃，180 rpm 摇培过夜至OD 600 为0.6-0.8。

2）摇培过夜的菌液按1%-2%的比例，转入新配置的无抗生素的YEB 培养基中，在与上述相同的条件下培养6 h左右，OD600 为0.2-0.5 时即可用于转化。

或：将按上述方法培养的OD 600 为0.6-0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，5000 rpm 离心10 min，去掉上清液，菌体用1/2 MS液体（pH 5.4-5.8）培养基重悬，稀释至OD600 为0.2 左右，用于转化。

叶盘法转化烟草的原理叶盘法是一种生物工程技术，用于转化或改造植物基因组以生产特定物质。

在烟草中应用叶盘法可以用于合成表达外源蛋白、开发抗病毒烟草品种以及烟草遗传改良等领域。

叶盘法的基本原理是利用植物的组织再生能力，通过培养植物的叶片组织培养而成的小体，在适当的培养基组合下，通过添加适当的物质和条件，将目标基因组转化至植物细胞中。

叶盘法的实验流程一般可以分为以下几个步骤：1.植物材料的准备：从健康的烟草植株中采集叶片，并将其洗净，并进行无菌处理以确保实验的纯度。

2.建立愈伤组织：将洗净的叶片剪成小碎片，并将其转移到含有激素和培养基中，利用试管内的适宜条件培养愈伤组织。

这一步是为了为后续基因转化做好基础，并培养植物细胞的再生能力。

3.转化基因：将目标基因或转入质粒经过适当的处理和筛选，将其引入培养的烟草细胞中。

目标基因可以是外源蛋白的编码序列，用于生产特定蛋白质。

转入基因的方法包括生物颗粒轰击、体外基因传递和通过细菌介导的转化等多种方法。

4.培养变性细胞：转入基因的组织在适宜的培养条件下进行培养和筛选，以确保它们能够在细胞内稳定表达目标基因。

同时，还可以使用适当的抗生素来抑制未转化细胞的生长。

5.稳定转化的筛选：利用特定的筛选方法，筛选出稳定表达目标基因的转化细胞。

常用的筛选方法是利用抗生素抗性基因或镰刀形细菌素酶基因，通过添加抗生素或镰刀形细菌素酶底物来诱导或检测转过的细胞。

6.进一步培育和鉴定：将经过筛选的转化细胞进行进一步培养，培育出大量具有目标基因的烟草植株。

同时，对植株进行鉴定和检测，确认目标基因的稳定性和表达水平。

通过以上步骤，叶盘法能够有效地将外源基因导入到烟草植株的基因组中，并使其稳定表达。

通过优化培养条件和基因的筛选方法，可以进一步提高转化效率和稳定性。

叶盘法的优点在于操作简单、转化效率高、转基因植株易于培养和大规模扩繁等。

然而，叶盘法也存在一些局限性，如转化效率和稳定性的波动性、可能引发的遗传不稳定性等问题，需要进一步的优化和改进。

癌农杆菌介导的转化方法1.根癌农杆菌介导的植物遗传转化常用的根癌农杆菌介导的植物遗传转化方法有以下三种：（1）叶盘转化法（leaf dish transformation）叶盘转化法是1985 年由Horsch 等发展起来的一种经典的基因转化方法，现在在原来方法的基础上改动较大，主要步骤为：①准备植物受体：用打孔器在消毒或无菌叶片上打孔，将所得圆形叶盘作为农杆菌侵染受体备用。

②侵染菌液制备和侵染：将含有目的基因质粒的农杆菌菌株培养至对数生长期，收集菌液，用1/2MS液体培养基重悬至一定浓度，为侵染菌液。

将准备好的叶盘浸泡在侵染菌液中数分钟，取出侵染过的叶盘，吸干菌液，置于共培养基。

③共培养和选择培养：将侵染过的叶盘在黑暗条件共培养至叶盘周围生长有肉眼可见的菌落时结束共培养，将叶盘转移至含有抑菌剂和选择剂的培养基中进行转化体的选择。

④转化体的获得：对在含有抑菌剂和选择剂的培养基上存活且能生根的植株进行PCR等分子检测，检测的阳性植株为转化体。

叶盘转化法适用于所有能从叶子再生植株的各种植物，改良的叶盘转化法是将侵染的外植体从叶片扩大到茎段、叶柄、胚轴、子叶等。

其优点是重复性高，操作简单，缺点是依赖高效的叶片或其他外植体的再生体系。

采用叶盘转化法时要注意以下技术要点：①由于农杆菌难以侵入叶片或其他外植体的深层部位，所以利用该方法时外植体的创伤部位应该含有大量农杆菌转化敏感的分裂细胞。

如叶脉的功能细胞常常在深层，所以制备叶盘时要避开叶脉，尤其是主脉。

②叶片、胚轴、茎段等外植体在培养过程中会膨大，造成切口边缘上翘或卷曲，使农杆菌侵染过的切面因接触不到培养基而不能生长实现转化，所以接种时要把叶盘等切口边缘轻埋入培养基，同时叶盘以圆形和近圆形为佳。

（2）整体植株接种共感染法该方法是模拟农杆菌天然的感染过程，人为地在植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种或注射到创伤部位或植株体内，从而完成T-DNA 的转移，获得转化体。

植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定金万枚　巩振辉　李桂荣　张桂华(西北农业大学　陕西杨陵　712100)提　要　对现有主要植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定进行了比较分析,并对它们在植物遗传转化中的前景进行了展望。

关键词　植物;遗传转化方法;转基因植株;转基因植株鉴定 人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。

但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。

采用遗传转化技术,将所要求的外源目的基因导入受体植株,并通过对转化植株的鉴定选择,从而创造出人类所需要的新品种或新物种。

植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定是植物遗传转化的重要环节。

关*国家自然科学基金资助,项目编号39770522。

优质小麦品质的决定性因素;其次要有较强的生活力,保证营养生长健壮。

3.3.2　播种　研究表明,适当晚播和增加密度能在稳定产量的基础上提高小麦品质。

根据我省实际,关中优质专用小麦播量应控制在每亩6～8kg,渭北应控制在9kg。

播期可依据实际情况较当地常规适播期推迟2～3d。

提倡机械以精量半精量播种。

3.4　灌水灌水对小麦品质的影响比较复杂,尤以抽穗至成熟期间影响最大,此期灌水会降低蛋白质含量,对沉淀值等加工品质也不利,但如果氮量充足或灌水与施氮结合则蛋白质含量不下降或下降很慢。

因而施肥上的前氮后移也为后期合理灌水提供了条件。

中国农业大学曾研究出一套节水高产栽培技术,小麦春季可只灌一次,并将灌水时期移至孕穗期;若特别干旱,可在拔节期和开花期分别灌水。

这种灌水制度与前氮后移的施肥方法配合起来,有利于优质专用小麦生产。

3.5　地膜覆盖地膜覆盖栽培能使小麦产量大幅度提高,对品质的影响这方面研究还较少。

陕西省农科院小麦中心的初步研究表明,小麦覆膜后籽粒容重有不同程度提高;蛋白质含量与正常露地播种没有差异;覆膜不影响不同生态类型品种的干、湿面筋值和沉淀值;但不同生态类型品种之间籽粒容重、蛋白质含量、干、湿面筋值和沉淀值存在较大差异。

草莓叶盘再生和遗传转化体系的优化柏锡;狄少康;张秀芹;朱延明【期刊名称】《东北农业大学学报》【年(卷),期】2012(000)010【摘要】农杆菌介导的叶盘法是目前草莓遗传转化的主要方法,建立高效稳定的叶盘再生体系是获得转基因草莓的必要条件.文章探讨了影响草莓离体叶片不定芽诱导的主要因素,建立了一个稳定的草莓植株再生体系,确定草莓品种弗吉尼亚不定芽诱导的最佳培养基组分为：MS+TDZ 2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+2,4-D 0.2 mg·L-1,pH 5.8.发现叶盘近轴面向下放置能显著提高再生频率,且叶片幼嫩程度与草莓不定芽分化率呈正相关.并以此体系对草莓叶盘遗传转化进行优化,发现草莓品种弗吉尼亚遗传转化最佳预培养时间为2 d,最佳侵染时间为7 min.同时,利用该体系,将由不同启动子诱导的组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type plasminogen activator, t-PA)基因对草莓进行遗传转化.【总页数】10页(P141-150)【作者】柏锡;狄少康;张秀芹;朱延明【作者单位】东北农业大学生命科学学院,哈尔滨 150030;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨 150030;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨 150030;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨 150030【正文语种】中文【中图分类】Q94-331;S668.4【相关文献】1.无花丹参叶盘组织培养再生体系的优化选择 [J], 夏静;张大海;宋艳波;王玉庆;牛颜冰2.苹果属植物再生体系优化及长富6号遗传转化体系的建立 [J], 杜小丽;陈秀孔;张计育;罗昌国;都贝贝;李春霞;章镇;渠慎春3."红丰"草莓无菌系及叶盘再生系统的建立 [J], 黄文江;潘超;阚显照;张全军4.小对叶植株再生及遗传转化体系构建 [J], 侯雨;吴丽爽;王晓萍5.‘晶瑶’草莓高效再生及遗传转化体系的建立 [J], 向发云;韩永超;曾祥国;张庆华;陈丰滢;顾玉成因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

茶树遗传转化体系研究进展茶树（Camellia sinensis）是一种重要的经济作物，被广泛应用于食品、饮料和药品等领域。

茶叶中含有丰富的各类营养物质，具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、保护心血管等多种保健功效。

为了提高茶树的栽培品质和抗逆能力，研究人员一直致力于茶树的遗传转化体系研究。

本文对茶树遗传转化体系的研究进展进行综述。

茶树遗传转化体系的建立可以通过不同的途径进行，包括植物体外遗传转化和植物体内遗传转化等。

植物体外遗传转化主要通过组织培养和基因枪等技术将外源基因导入茶树细胞，再通过选择、培养和再生等步骤获得转化苗；植物体内遗传转化则是通过农杆菌介导的转化和叶盘法等技术将外源基因导入到茶树体内，再通过选择、培养和再生等步骤获得转化苗。

茶树遗传转化体系的研究主要集中在以下几个方面：基因导入的方法、适宜的基因载体、转基因植株的鉴定、基因的表达及功能分析、与农艺性状相关基因的导入等。

目前，茶树遗传转化主要采用农杆菌介导的转化方法，这是一种广泛应用于植物遗传改良的方法。

在农杆菌介导的转化方法中，农杆菌将外源基因导入到茶树体细胞中，并在茶树体细胞中被整合到茶树基因组中。

通过选择、培养和再生等步骤，可以得到转化苗。

在茶树遗传转化体系的研究中，选择合适的基因载体也是一个关键因素。

常见的基因载体包括农杆菌二元载体和双载体系统等。

农杆菌二元载体是目前应用较为广泛的基因载体，它由两个质粒构成，一个质粒携带外源基因，另一个质粒携带选择标记基因。

通过辅助质粒和真核选择载体之间的复制和互作，可以获得选择标记基因与外源基因共同表达的转基因植株。

茶树遗传转化体系的研究还涉及到转基因植株的鉴定和分析。

通过PCR、南方杂交、Northern印迹等技术，可以确定茶树是否成功地导入了外源基因。

利用RT-PCR、Western印迹、酶活性测定等技术，可以进一步分析转基因植株中外源基因的表达与功能。

茶树遗传转化体系的研究还涉及到提高茶树的品质和抗逆能力。