一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法

专利名称：一种利用超声波提高农杆菌介导的苹果属植物转化效率的方法
专利类型：发明专利
发明人：渠慎春,章镇,蔡斌华,丛郁,高志红,杨梦悦
申请号：CN200610085396.X
申请日：20060613
公开号：CN1952161A
公开日：
20070425
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明“一种利用超声波提高农杆菌介导的苹果属植物转化效率的方法”属于生物工程育种领域。

将苹果属八棱海棠叶片切成小块在OD为0.6且含有s的农杆菌悬浮液中浸泡2分钟后，用功率为100w的超声波处理后，转移到再生培养基上进行抗性筛选，转化八棱海棠叶片，得到抗性愈伤组织和抗性苗，转化率为2.2％。

本发明首次将超声波技术应用在苹果属植物的遗传转化上，大大提高了苹果属植物转基因的效率。

应用超声波辅助农杆菌介导法转导rolC基因转化苹果砧木八棱海棠，分别获得了2.2％的转化效率，均大大高于普通农杆菌介导法0.1～0.8％的转化效率。

申请人：南京农业大学
地址：210095 江苏省南京市卫岗1号南京农业大学科技处钱宝英
国籍：CN
代理机构：南京经纬专利商标代理有限公司
代理人：楼高潮
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农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。

其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。

本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。

一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。

它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。

因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。

农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。

其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。

二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。

例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。

在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。

其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。

此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。

为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。

一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。

超声波辅助农杆菌介导CP基因转化番小瓜(Carioca papayaL.)的有效方法姜玲;MAOKA Tetsuo;KOMORI Sadao;FUKAMACHI Hiroshi;KATO Hidenori;OGAWA Kazunori【期刊名称】《实验生物学报》【年(卷),期】2004(37)3【摘要】本研究探索了通过农杆菌介导,超声波辅助处理,转化番木瓜胚性愈伤组织,获得转基因植株的有效方法。

分别将含有日本PLDMV 外壳蛋白基因(PTi-Epj-TL-PLDMV)和含有台湾PRSV 菌株、美国夏威夷PRSV 菌株、泰国PRSV 菌株及日本PLDMV 菌株的多元外壳蛋白基因编码序列(PTi-NP-YKT)插入双元载体质粒pGA482G,借助于农杆菌系LBA4404将双元载体上的外壳蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)转移到番木瓜品种Sunset 的胚性愈伤组织中,从而获得抗卡那霉素的转化再生植株。

试验着重在转化方法上进行探索。

结果表明,农杆菌过夜培养后,用高渗透压培养液(1/2 MS+6%蔗糖+1%葡萄糖,pH 5.7)调整至光密度OD_(600(?)m)=0.15-0.20,然后用该菌液感染材料30min,其间辅以超声波处理,可以大大提高转化效率。

用15ml 无菌离心管装载胚性愈伤材料进行15s 的超声波处理,在80块被转化的胚性愈伤中获得21个CP 基因G 转化系(26.3%),而在对照处理64块胚性愈伤中仅获得1个转化系(1.6%);在经过15s 的超声波处理48块被转化的胚性愈伤中获得8个CP 基因B 转化系(16.7%),而在对照处理25块胚性愈伤中未出现转化系。

上述操作方法用在两种CP 基因转化上均表现出相似的效果。

试验还表明:120mg/L 是卡那霉素抗性筛选的最佳浓度。

抗性筛选9个月后,在421块胚性愈伤组织中产生了42个抗卡那霉素的转化系。

所获得的转基因植株分别用PCR 和Southern 印迹杂交进行了鉴定。

(10)申请公布号 CN 102212553 A(43)申请公布日 2011.10.12C N 102212553 A*CN102212553A*(21)申请号 201110095852.X(22)申请日 2011.04.15C12N 15/84(2006.01)A01H 5/00(2006.01)A01H 1/02(2006.01)(71)申请人山西省农业科学院生物技术研究中心地址030031 山西省太原市坞城南路59号(72)发明人孙毅 杨丽艳 杜建中 郝曜山王亦学 张丽君 王铭 于纪珍张婷婷(74)专利代理机构太原市科瑞达专利代理有限公司 14101代理人李富元(54)发明名称超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法(57)摘要一种超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其目的是直接以植物萌发种子作为农杆菌侵染受体，不需进行组织培养和植株再生过程。

本发明以植物萌发种子为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti 质粒为基因载体，在种子萌发过程中对受体植物萌发种子生长点部位进行划伤和超声波处理后与农杆菌共培养；将外源基因转移到受体基因组中，并通过对种子或幼苗的直接筛选，对植株叶片DNA 进行PCR 扩增和Southern 杂交，进一步确定转化株。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页1.一种超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是以植物萌发种子为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在种子萌发过程中与农杆菌共培养，将外源基因转移到受体基因组中，并通过对种子或幼苗的直接筛选，对植株叶片DNA 进行PCR扩增和Southern杂交，进一步确定转化株。

2.根据权利要求1所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是对受体植物萌发种子生长点部位进行划伤和超声波处理后与农杆菌共培养；划伤深度随作物种与品种不同而略有差异，一般的划伤深度约为2-3mm；所用超声波的功率100-900W，频率10秒/次，处理次数为1-10次。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110141212.1(22)申请日 2021.02.02(71)申请人 河北农业大学地址 071001 河北省保定市莲池区乐凯南大街2596号(72)发明人 刘立峰　杨艳雯　李秀坤　崔顺立　侯名语　杨鑫雷　刘盈茹　赵楠楠　邓洪涛　(74)专利代理机构 北京东方盛凡知识产权代理事务所(普通合伙) 11562代理人 王颖(51)Int.Cl.C12N 15/84(2006.01)C12N 1/20(2006.01)A01H 5/00(2018.01)A01H 6/54(2018.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法(57)摘要本发明公开了一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法，属于花生转基因技术领域。

本发明建立了一套农杆菌介导花生半粒种子遗传转化技术的优化体系，以花生半粒种子为外植体，通过在侵染时加入乙酰丁香酮、共培养时加入二硫苏糖醇以及在培养过程所使用的各个培养基中添加200mg/L天冬酰胺和200mg/L谷氨酰胺，使得遗传转化过程能够在5周之内完成，大大缩短了离体培养时间，提高了转化效率。

本发明提供的花生快速遗传转化方法能够更快获得转基因植株，为进一步利用基因工程培育转基因花生品种奠定了基础。

权利要求书1页 说明书10页序列表1页 附图2页CN 112708634 A 2021.04.27C N 112708634A1.一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以花生半粒种子为外植体，使用含乙酰丁香酮的农杆菌侵染液体侵染；2)侵染后的半粒种子在含有二硫苏糖醇的共培养基上暗培养3天；所述共培养基为添加乙酰丁香酮的MS基本培养基；3)转入丛生芽筛选培养基中培养1周；所述的丛生芽筛选培养基为添加赤霉素、6‑苄基嘌呤、头孢噻肟、棒酸羧噻吩青霉素和选择标记抗生素的MS基本培养基；4)转入生根培养基中培养至根系长度＞5cm，提取叶片DNA进行PCR检测；所述生根培养基为添加头孢噻肟、棒酸羧噻吩青霉素、萘乙酸和乙哚丁酸的MS基本培养基；所述的共培养基、丛生芽筛选培养基和生根培养基中均添加天冬酰胺和谷氨酰胺。

专利名称：一种农杆菌介导外植体遗传转化方法
专利类型：发明专利
发明人：丁莉萍,魏建华,王宏芝,陈亚娟,张杰伟,李瑞芬申请号：CN201510805221.0
申请日：20151120
公开号：CN105238813A
公开日：
20160113
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明为一种农杆菌介导外植体遗传转化方法，包括：农杆菌的活化、农杆菌侵染外植体、农杆菌与外植体共培养、外植体的诱导和筛选分化，其中共培养步骤的操作为：在固体共培养基上放置灭菌滤纸，将农杆菌侵染后的外植体表面菌液吸净后放置在所述灭菌滤纸上培养3~4天。

固体共培养基的制备方法为：蒸馏水加入0.7%（W/V）的琼脂粉，高压灭菌后加入200uM乙酰丁香酮。

本发明使遗传转化过程中农杆菌与外植体共培养时农杆菌能够充分接触外植体而不过度生长，提高转化效率，且简化培养基能够减少污染几率。

申请人：北京农业生物技术研究中心
地址：100097 北京市海淀区曙光花园中路9号市农林科学院生物中心
国籍：CN
代理机构：北京国林贸知识产权代理有限公司
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超声波辅助农杆菌转化OT百合‘罗宾娜’的研究王岚;刘雅莉;娄倩;田菲菲【摘要】[目的]通过超声波处理辅助农杆菌转化OT百合小鳞片,提高农杆菌介导法转化百合的效率.[方法]以OT百合‘罗宾娜’(Lilium tenui oliumoriental×tumpet‘ Robina’)的再生小鳞片为外植体,分别以80 W功率的超声波处理1,2,3,4,5 min,通过超声波处理辅助根癌农杆菌进行外源基因的转化,同时以未进行超声波处理为对照；利用GUS组织化学法,分别检测转化脱菌后筛选培养7d的外植体和筛选培养60 d后形成的潮霉素抗性再生植株叶片、小鳞片、根系的GUS瞬时表达和稳定表达,提取潮霉素抗性植株基因组DNA进行GUS和HPT 基因的PCR扩增分析.[结果]超声波处理的农杆菌介导转化的百合外植体经GUS组织化学染色,多数可见蓝色斑点,且以3min超声波处理的蓝色最深；3 min超声波处理的外植体对潮霉素的抗性率最高达48.85％,未经超声波处理的仅为15.56％,二者差异达显著水平.从53个潮霉素抗性再生植株的DNA样品中扩增得到了GUS基因和HPT基因的扩增片段,其中超声波处理3 min的PCR阳性植株转化率最高,为28.30％,而未进行超声波处理的PCR阳性植株转化率仅为5.66％,初步证明外源基因可能整合到百合基因组中.[结论]20℃条件下80 W功率超声波处理3 min,可以有效提高农杆菌介导法转化OT百合的效率.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(041)006【总页数】6页(P161-166)【关键词】超声波;百合;农杆菌;转基因【作者】王岚;刘雅莉;娄倩;田菲菲【作者单位】西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S682.2+65.032;Q785百合为百合科草本植物，公元4世纪时已为人们食用和药用。