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通海地处滇中，周年露地种植蔬菜。
因复种指数高，田间小气候复杂，病虫发生种类及数量居高不下；受市场需求影响，部分菜农为追求短期经济效益，药剂防治相对频繁。
秉承“病虫防治，预测先行”的前提，为保证农产品质量安全，促进蔬菜生产可持续发展，建议采取科学合理的措施进行病虫害综合防治，以确保蔬菜生产的高质稳产。
一、露地蔬菜病害的发生与防治1、苗期病害的发生与防治蔬菜苗期病害主要有猝倒病、立枯病、沤根等，除沤根是由于苗床低温、高湿和光照不足引起的一种生理病害外，其它几种病害都是由病原菌侵染所致。
防治方法：需进行苗床消毒，加强苗床管理，在苗床开始出现少数病株时，早期见病株立即拔除并对病区及其周围幼苗撒适量配比的福美双、多菌灵药土，或喷洒百菌清防止病害扩展。
同时注意通风降湿。
2、蔬菜根（腐）肿病的发生与防治蔬菜根（腐）肿病是当前蔬菜生产的主要毁灭性病害。
十字花科作物连作，种苗带菌，土壤偏碱，大水大肥的田间管理是其发生蔓延的主要原因。
防治方法：选用适销对路的抗病品种，与菜用玉米、芹菜、青蒜苗、韭葱等非十字花科作物轮作，作物移栽后至开盘前轮换选用生物农药如枯草芽孢杆菌、抗生素溶杆菌、氰霜唑等灌根2-3次，可有效防控根腐（肿）病。
此外，幼苗期使用福啶胺滴注根部防效也好。
3、蔬菜菌核病的发生与防治蔬菜菌核病具有侵染力强、传播途径多、危害损失大等特点，带菌的种子、秧苗、土壤、病株残体、农事操作和工具等均可传病，高温低湿是菌核病发病的有利条件。
防治方法：深耕田块，开深沟起高墒，注意田间排水，避免大水漫灌；合理密植，增加植株通透性；多施有机肥（腐熟农家肥）做基肥，避免偏施氮肥，增施磷、钾肥，防止植株陡长；发病前或发病初期选用扑海因、百菌清、腐霉利、乙烯菌核利等每隔7-10天喷1次，连续防治3-4次。
4、蔬菜霜霉病、白粉病、炭疽病、葱蒜类锈病、白菜白锈病的发生与防治植株栽植过密、田间湿度大时，霜霉病、锈病、炭疽病易蔓延危害，而湿度偏低时豆类白粉病危害又会加重。
游离亚硝酸（FNA）对氨氧化细菌（AOB）的抑制作用及微生物多样性研究游离亚硝酸（FNA）对氨氧化细菌（AOB）的抑制作用及微生物多样性研究引言：氨氧化细菌（AOB）在自然界中被广泛分布，并在氮循环中起着重要的作用。
然而，一些环境因素可以抑制AOB的生长和活性，其中包括游离亚硝酸（FNA）。
FNA是一种常见的氮氧化物，其存在可以导致土壤中氮流失，影响氮素的利用效率。
本文旨在探究FNA对AOB的抑制作用以及该抑制作用对土壤微生物多样性的影响。
方法：实验采用田间调查和室内实验相结合的方法来研究FNA在不同土壤类型中对AOB的抑制效果和对微生物多样性的影响。
首先，收集不同类型（酸性、中性、碱性）的土壤样品，并通过测定土壤的理化性质和微生物基本特征来确定样品的特点。
其次，采集不同处理的土壤样品，包括添加不同浓度的FNA，以及对照组，通过PCR-DGGE技术分析土壤中AOB的多样性和丰度。
最后，利用统计学方法对结果进行分析。
结果与讨论：在研究过程中，发现FNA的添加对AOB的丰度和多样性产生了显著影响。
首先，FNA对AOB的抑制效果与土壤pH密切相关，酸性土壤中FNA的抑制效果最强，碱性土壤中最弱。
这与氨氧化细菌对酸性环境的敏感性有关。
其次，FNA的浓度也对AOB的抑制效果产生了明显影响，浓度越高，抑制效果越明显。
此外，通过PCR-DGGE技术发现，在实验的不同处理组中，AOB的多样性也有显著差异。
FNA的添加显著降低了AOB的多样性，同时导致非AOB细菌的相对丰度增加。
这表明FNA的存在可能对AOB产生了选择压力，促使其他微生物种群的增加。
结论：本研究结果表明，游离亚硝酸（FNA）具有显著的抑制效果，可以抑制土壤中氨氧化细菌（AOB）的活性和多样性。
然而，该抑制作用受土壤pH和FNA的浓度等因素的影响。
此外，该抑制作用还可能导致AOB群落的变化，促使其他微生物种群的增加。
这些结果对于理解FNA对土壤氮循环和氮素利用效率的影响具有重要意义。
氨氧化菌对氮素转化的影响与调控机制氮素是植物生长所必需的元素之一，但少量的氮素会导致污染和浪费。
因此，如何有效地利用氮素资源成为了人类面临的重要问题。
氨氧化菌(AMO)在氮素转化中扮演着重要的角色。
本文将从AMO的特点、对氮素转化的影响以及调控机制三方面深入探讨这一问题。
一、AMO的特点AMO是一种细菌，主要生长在水环境中。
它能够将氨氮转化为硝氮。
具体来说，它将氨氮(氨气/铵离子)氧化成亚硝酸(或亚硝酸盐)，再进一步氧化成硝酸。
整个过程是一个两步反应，分别由亚硝化菌和硝化菌完成。
AMO是亚硝化菌。
AMO的基因结构比较特殊。
它的核心基因是amoA，它负责编码所谓“AMO 酶”。
AMO酶是了解这种微生物作用的关键，它可以参与氮素的转化。
AMO对氮素转化的影响AMO能够促进氮素转化，它的作用主要包括：1. 增强硝化作用：硝化作用是将氨硝化为硝酸，这是氮循环中最重要的过程之一。
而根据研究，AMO不仅能显著促进硝化作用，还能够抑制副作用，如硝酸还原。
2. 降低氨气释放：在水环境中，氨气的释放是容易的。
而当AMO参与氮素转化时，它会将氨氮转化成氧化态氮，完成氮素资源的高效利用，进而减少氨气的释放。
因此，AMO是氮循环中至关重要的微生物，它不仅能够促进氮素转化，还能够保护生态环境，降低氮素污染的危害。
三、AMO的调控机制AMO的调控机制涉及到多种因素。
其中一些被归类为内在调控因素，另一些则是外部调控因素。
1. 内在调控因素内在调控因素指的是AMO自身的特点。
一些主要的内在调控因素包括:(1) 同域竞争：同域中的细菌通常无法共存，编码amoA基因的AMO (AOM_A)和AOM_B构建的AMO在同一环境中竞争时，只有一个亚群能够存活下来。
(2) 调节效应器：AMO的amoC基因编码一种不同的基因产物，通过编码ammonia monooxygenase (AMO)活性和稳定性受到调节。
(3) 编码酶的变异：编码AMO酶的基因(amoA)在AMO之间是可变的并且突变频繁的。
土地利用类型对土壤氨氧化微生物丰度和群落结构的影响作者：朱飞李文波田磊沈洪伟季敬敬魏元甲王芸王欣丽来源：《山东农业科学》2023年第09期關键词：土地利用类型；氨氧化古菌；氨氧化细菌；amoA基因；群落结构硝化作用是土壤氮转化的一个重要步骤，它不仅关系到矿化释放的铵态氮或外源铵态氮在土壤氮循环中的转化，还与土壤氮的损失有关：所涉及的过程关联着土壤酸化、水体富营养化以及温室气体N2O排放等环境问题。
因此，硝化作用一直是氮转化过程中一个备受关注的环节。
氨氧化是硝化作用的第一步也是限速步骤，氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）被认为是氨氧化作用的主要执行者。
由于AOA、AOB等功能群体对环境因子（如氧气和底物等）具有不同的响应特征，因此不同的土壤类型和土地利用类型下不同功能群的生态位会发生变化。
AOA和AOB在生理和代谢途径上存在很大差异，包括其对土壤pH值、土壤有机质含量和氨浓度等的适应，导致土壤中氨氧化微生物不同的群落结构和功能。
研究表明土壤pH值影响硝化作用底物的化学形态和生物可利用性，在AOA和AOB的生态位分异中起着重要作用。
与AOB相比，AOA对底物NH3有更高的亲和力，高氮土壤更利于AOB的增长。
有机质含量也是影响AOA和AOB相对竞争优势的重要因素。
土壤有机质一方面会刺激具有混合营养能力的AOA，另一方面其矿化释放的氨会促进AOA丰度的增加。
不同的土地利用和管理模式对土壤的属性和环境可产生剧烈影响，导致土壤理化性质和微生物活性发生改变。
天然土地转化成农业用地后利用强度提高，尤以设施蔬菜地土壤的利用程度最高，具有无机和有机肥料投入量高、种植强度大等特点。
不同利用方式土壤在pH值、氮素状况等方面的差异必然影响AOB、AOA的丰度和群落组成。
前人研究多数针对酸性土壤，关于原碱性土壤不同干扰程度下的土地利用氨氧化微生物是如何响应的研究很少。
本研究选取褐土林地、农田和设施蔬菜地3种中国北方常见土地利用类型的土壤，代表不同的干扰程度（林地<农田<设施蔬菜地），采用荧光定量PCR和IlluminaMiSeq高通量测序技术，研究不同土地利用类型土壤AOA和AOB的丰度、多样性和群落结构的变化，探讨土壤理化性质变化对氨氧化微生物群落组成的影响以及氨氧化微生物对环境的长期适应性，以期为土壤肥力提升和土地的合理利用提供依据。
不同施氮量对稻田土壤中氨氧化细菌群落结构的影响的开
题报告
1. 研究背景：
氨氮是稻田土壤中的重要氮源，但过量的氨氮会导致氮素的浪费，还可能对土壤和水环境造成污染。
因此，在稻田种植中需要对氮素的施用量进行科学合理的控制。
而氨氧化细菌是稻田土壤中的一种重要微生物，它们可以将氨氮转化为硝酸盐，为植物提供有效的氮素营养。
不同施氮量对氨氧化细菌在稻田土壤中的群落结构和丰度有什么影响，是当前稻田土壤微生物研究的热点和难点之一。
2. 研究内容：
本研究旨在探究不同施氮量对稻田土壤中氨氧化细菌群落结构的影响。
具体研究内容包括以下几个方面：
（1）收集稻田土壤样品，分别设立四个处理，分别为不施氮（CK）、低氮（LN）、中氮（MN）和高氮（HN）处理组，对每个组进行氮素肥料的施用。
（2）采用高通量测序技术，对每组土壤样品中的氨氧化细菌群落结构和丰度进行测定和分析。
（3）比较不同氮素施用处理组土壤中氨氧化细菌群落结构和丰度的差异，并进行统计学分析。
（4）分析氮素施用量对稻田土壤中氨氧化细菌群落结构和丰度的影响机制。
3. 研究意义：
通过本研究的开展，可以深入了解氮素肥料施用对稻田土壤中氨氧化细菌群落结构和丰度的影响。
该研究对于制定稻田氮素肥料施用的合理策略和管理措施具有一定的参考意义，同时也可以为建立稻田土壤微生物资源库提供重要的科学依据。
此外，本研究还有利于深入探究氮素循环在稻田生态系统中的作用和机制。
土壤中的氨氧化微生物硝化作用（Nitrification）是指生物利用氧气将氨氧化为亚硝酸盐继而将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的作用。
氨氧化作用是硝化作用的第一个反应步骤，也是限速步骤，是全球氮循环的中心环节。
氨氧化为亚硝酸盐的过程是由两群微生物完成：氨氧化细菌（AOB）与氨氧化古菌（AOA）。
研究最多的土壤中的氨氧化细菌属于亚硝化单胞菌属与亚硝化球菌属。
尽管在土壤中氨氧化同时发生在细菌和古菌之中，但古菌的氨氧化作用却同时在土壤以及海洋环境中占首要地位。
氨氧化细菌是执行硝化作用第一步的关键微生物，即将氨氧化为亚硝酸盐，该步骤也是硝化速率的限制性步骤。
自养型氨氧化细菌可分为两大类, 一类属于γ-变形细菌(γ-proteobacteria)，只存在于海洋和咸水中，另一类属于β-变形细菌(β-proteobacteria)，土壤中的氨氧化细菌均属此类。
氨氧化细菌通过单加氧酶(amoA)活性控制氨氧化成亚硝酸盐的速率。
最新研究发现具有amoA 基因的泉古菌门的古细菌，进一步研究证实自然界中存在具有氨氧化功能的氨氧化古菌，且陆地生态系统中氨氧化古菌的数量和分布比氨氧化细菌更丰富。
第二步（将亚硝酸盐氧化为硝酸盐）主要是由细菌中的硝化杆菌属来完成。
以上步骤都会产生能量并偶联合成腺苷三磷酸，硝化有机体都是化能自养菌并且利用二氧化碳作为他们生长的碳源。
一些氨氧化细菌具有一种称为脲酶的酶，这种酶催化尿素分子分解为两分子的氨以及一分子的二氧化碳。
人们发现欧洲亚硝化单胞菌与土壤生的氨氧化细菌群一样，可以通过卡尔文循环同化脲酶反应生成的二氧化碳以产生生物质能，并通过将氨（脲酶的另一产物）氧化为亚硝酸盐的过程收获能量。
这一特性可解释为什么在酸性环境中存在尿素的情况下会促进氨氧化细菌的生长。
早年通过同位素示踪技术的研究发现，14C—衰减性无机碳和H132 CO3都能嵌合到生长旺盛的泉古菌细胞上,结合对古代泉古菌的类脂特征分析均表明这些中温海洋泉古菌营自养型生长。
纳帕海农田土壤氨氧化细菌的群落结构彭淑娴;陆梅;王震;任玉连;范方喜;李冬梅【摘要】In order to explore the variation characteristics of ammonia oxidizing bacteria community structure in Napahai farmland soil in different season,soil samples were collected by plum point method in upper(0～20 cm) and lower(20～40 cm) soil layers in representative farmlands in dry and wet seasons,and the effects on ammonia oxidizing bacteria community structure were explored combined with soil environmental factors.High-throughput sequencing technique and redundancy analysis method were used to analyze the relationship among environmental factors and these ammonia oxidizing bacterial community structure based-on amoA gene from soil total DNA,and to determine the main environmental factors.Results:Contents of organic matter,total nitrogen,hydrolysable nitrogen,rapidly available phosphorus,rapidly available K,and nitrate nitrogen are the highest in upper soil in wet season,respectively 70.79 g/kg,2.90 g/kg,389.04 mg/kg,78.84mg/kg,768.92 mg/kg,49.04 mg/kg.In dry season,the upper farmland soil has the highest content of total phosphorus and total K,respectively 1.33 g/kg and 15.13 g/ kg.By high throughput sequencing,Nitrosospira-sp.-Nsp2 and uncultured-Nitrosospira-sp.are mainly the dominant ammonia oxidation bacteria,belongs to the Nitrosospira at genus level.The diversity of ammonia oxidation bacteria shows that the upper soil in dry season＞the upper soil in wet season＞ the lower soil in wet season＞ the lower soilin dry season.Known from the analysis of redundancy,the mainly environmental factors affect the upper farmland soil ammonia oxidizing bacteria in dry season shows the rule of rapidly available phosphorus＞total nitrogen＞ nitrite nitrogen,for the lower soil in dry season is ammonium nitrogen ＞ nitrite nitrogen＞ total K＞ nitrate nitrogen＞ total phosphorus.The soil ammonia oxidizing bacteria community structure in wet season is obviously affected by multiple environmental factors.%为弄清不同季节纳帕海农田土壤氨氧化细菌群落结构的变化特征,选取代表性农田于干季和湿季采用梅花点法选取上(0～20 cm)、下(20～40 cm)两层土壤,结合环境因子探讨其对氨氧化细菌群落结构的影响.提取土壤总DNA,对amoA基因进行特异性扩增和高通量测序,并结合冗余分析法分析氨氧化细菌群落结构组成、丰度及其与土壤环境因子的关系,确定主要环境因子.结果表明:农田土壤有机质、全氮、水解性氮、速效磷、速效钾及硝态氮含量在湿季上层土壤中均最高,分别为70.79 g/kg、2.90 g/kg、389.04 mg/kg、78.84 mg/kg、768.92 mg/kg和49.04 mg/kg;干季上层土壤全磷和全钾含量为最高,分别为1.33 g/kg和15.13 g/kg.经高通量测序,亚硝化螺菌属(Nitrosospira)为农田土壤氨氧化细菌的优势菌属,Nitrosospira-sp.-Nsp2和uncul tured-N itrosos pira-sp.为主要优势氨氧化细菌,土壤氨氧化细菌多样性表现为干季上层＞湿季上层＞湿季下层＞干季下层.结合冗余分析,影响干季农田上层土壤氨氧化细菌群落结构的主要环境因子及影响程度分别为速效磷＞全氮＞亚硝态氮,对于干季下层土壤则是铵态氮＞亚硝态氮＞全钾＞硝态氮＞全磷;湿季土壤氨氧化细菌群落结构明显受多种环境因子的综合影响.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2017(045)006【总页数】7页(P91-97)【关键词】纳帕海;农田;氨氧化细菌;高通量测序;环境因子【作者】彭淑娴;陆梅;王震;任玉连;范方喜;李冬梅【作者单位】西南林业大学环境科学与工程学院,云南昆明650224;西南林业大学环境科学与工程学院,云南昆明650224;北京林业大学,北京100083;西南林业大学环境科学与工程学院,云南昆明650224;西南林业大学环境科学与工程学院,云南昆明650224;西南林业大学环境科学与工程学院,云南昆明650224;云南林业职业技术学院,云南昆明650224【正文语种】中文【中图分类】S154.36纳帕海因其丰富的物种资源及独特的湿地类型，并在全球气候变化中发挥着重要作用而广受关注。
不同类型稻田中全程氨氧化微生物的分异特征作者：张洁宋怡轩张鑫磊张耀鸿来源：《江苏农业学报》2020年第03期摘要：選用微碱性氮贫瘠的上海市崇明岛稻田和微酸性氮丰富的南京市稻田剖面（0～50 cm），比较研究稻田土壤中氨氧化微生物类群丰度的差异及其环境驱动机制，评价其与氨氧化潜力的内在关系。
结果表明，崇明稻田的净硝化速率为12.82～22.30 mg/（kg·d），明显高于南京稻田[4.26～7.46 mg/（kg·d）]。
崇明稻田土壤剖面的Comammox amoA基因总拷贝数（Clade A与Clade B之和）均值为1 g 8.8×106拷贝，是南京稻田的2.4倍，且Clade A与Clade B的比值范围为2.5～12.7，证实了Comammox存在于2种不同类型的稻田土壤中。
崇明稻田和南京稻田剖面的氨氧化细菌（AOB）的amoA基因拷贝数均值分别为1 g 3.75×108拷贝和1.23×108拷贝，氨氧化古菌（AOA）的amoA基因拷贝数均值分别为1 g 2.05×107拷贝和0.35×107拷贝，这2种菌群基因拷贝数均在10.1～20.0 cm土层达到最高。
回归分析发现，2个稻田中氨氧化细菌（AOB）对氨氧化潜力的贡献率达到90%～94%，而Comammox仅为3%左右，表明氨氧化细菌（AOB）在氨氧化过程中发挥主要作用。
关键词：稻田;全程氨氧化细菌;氨氧化细菌;氨氧化古菌;氨氧化潜力中图分类号：S511.061文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）03-0584-07Differentiation characteristics of complete ammonia-oxidizing microorganisms in different types of paddy soilsZHANG Jie 1，2，SONG Yi-xuan 1，2，ZHANG Xin-lei 1，3，ZHANG Yao-hong1（1.Nanjing University of Information Science and Technology， Collaborative Innovation Center for Forecast and Evaluation of Meteorological Disasters/Jiangsu Provincial Key Laboratory of Agricultural Meteorology， Nanjing 210044， China;2.State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture， Institute of Soil Science， Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210008，China;3.Shanxi Climate Center， Taiyuan 030006， China）Abstract：In this study， the alkaline coastal paddy field profile （0-50 cm） with low nitrogen and acidic Nanjing paddy field profile with high nitrogen were selected to compare the abundance of ammonia-oxidizing microorganisms in paddy soils and its environmental driving mechanism， and to evaluate its internal relationship with ammonium oxidation potential was evaluated. The results showed that the net nitrification rate of coastal paddy fields ranged from 12.82 mg/（kg·d） to 22.30 mg/（kg·d）， which was significantly higher than that of Nanjing paddy fields [4.26-7.46 mg/（kg·d）]. The average number of total copies of comammox amoA gene （the sum of Clade A and Clade B） in the soil profile of coastal paddy fields was 8.8×106 copies per gram， which was 2.4 times greater than that of Nanjing paddy fields， confirming that comammox existed in two different types of paddy fields. In addition， the ratio of Clade A to Clade B ranged from 2.5 to 12.7. The average copy number of amoA gene of ammonia-oxidizing bacteria（AOB） in coastal and Nanjing paddy fields was 3.75×108 copies per gram and 1.23×108 copies per gram， respectively. The average copy number of amoA gene of ammonia-oxidizing archaea （AOA） was 2.05×107 copies per gram and 0.35×107 copies per gram， respectively. The abundance of these two bacteria were the highest in 10.0-20.0 cm soil layer. The results of regression analysis indicated that AOB contributed 90%-94% to the potential of ammonia oxidation in the two paddy fields， while comammox only contributed about 3%， indicating that AOB could play a major role in ammonia oxidation in the two soils.Key words：paddy soils;complete ammonia oxidizers（comammox）;ammonia-oxidizing archaea（AOA）;ammonia-oxidizing bacteria（AOB）;potential of ammonia oxidation硝化作用是自然界氮循环的关键转化过程，也是农田土壤氮素循环的重要环节[1]。
添加生物炭改善菜地土壤氨氧化细菌群落并提高净硝化率王先芳1，任天志2*，智燕彩2，张贵龙2，李 洁2*，王知文2（1 东北农业大学资源与环境学院，黑龙江哈尔滨 150030；2 农业农村部环境保护科研监测所/天津市农业环境与农产品安全重点实验室，天津 300191）摘要: 【目的】氨氧化过程是硝化作用的限速步骤，对氮循环有着重要影响。
本研究通过分析生物炭输入下土壤氨氧化微生物群落的变化，揭示其影响土壤硝化作用的生物学机制。
【方法】以华北潮土区设施菜地土壤为对象，设置生物炭梯度 (C 0、C 0.5、C 1.5、C 4.0) 土壤培养试验，结合PCR 和T-RFLP 等分析技术，观测生物炭输入下土壤氨氧化细菌群落变化动态，解析生物炭、土壤硝化作用与氨氧化细菌群落之间的关系。
【结果】添加生物炭明显改变了土壤氨氧化微生物群落结构及氮素硝化过程。
与未添加生物炭处理相比，生物炭添加处理培养前期土壤氨氧化细菌群落Shannon 、Evenness 指数分别升高5.4%～18.8%、26.2%～33.8%，后期Shannon 指数降低20.7%～34.2%。
生物炭输入对AOA 群落没有明显影响，AOB 群落256、58 bp 代表物种丰度分别增加61.4%～56.0%、60.6%～78.6%，488 bp 代表物种丰度降低22.8%～26.9%。
21 bp 代表物种丰度前期增加后期降低，与491 bp 代表物种丰度变化相反。
添加生物炭土壤AOB amoA 基因丰度增加48.9%～53.2%。
土壤NO 3–-N 含量提高1.7%～25.6%，NH 4+-N 含量下降13.4%～31.1%，土壤净硝化速率提高21.8%～70.2%。
【结论】生物炭的输入可以改善以AOB 为主的土壤氨氧化微生物群落结构，提高amoA 酶活性，但是对氨氧化古菌微生物群落结构未产生明显影响。
因此，生物炭提高土壤净硝化速率的作用与其对土壤氨氧化细菌群落和组成的影响密切相关。
第六章蔬菜露地土壤氨氧化细菌(Ammonia-Oxidizing
Bacteria)多样性分析
6.1 材料(同5.1)
6.2 土壤微生物总DNA的提取和纯化（同第二章方法二）
6.3 土壤氨氧化细菌的amoA基因PCR扩增反应，克隆和测序分析PCR扩增所用引物：
引物1（amoA-1F）：5’- GGGGTTTCTACTGGTGGT -3’
引物2（amoA-2R）：5’- CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC -3’
具体的步骤及方法为：
（1）DNA模板预处理
通过预试验证明当DNA模板稀释成50-100倍时，所得到的PCR扩增结果最理想。
因此将纯化处理的DNA稀释成50倍和100倍进行PCR扩增反应。
（2）每管PCR体系：50 μl体系
Buffer 10× 5.0μl
DNTP (10mM) 1.0 μl
引物1 (10 PM) 0.5 μl
引物2 (10 PM) 0.5 μl
Taqase (5 U) 0.5 μl
DNA模板 5 μl（100倍）
合计12.5 μl
（3）每管加dd H2O μl 37.5μl离心
A. 加石蜡油：10 μl；
B. 设置阳性对照，阴性对照，重复3次；
（4）PCR ：采用降落PCR的运行程序
95℃ 5 min；
94℃45 s
60℃ 1 min 35 cycles
72℃ 1 min
72℃15 min；
4℃10 h
（5）检测：1.0％琼脂糖电泳
（6）将片段的回收：
A.将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量。
B.向胶块中加入3倍体积的溶胶液，55℃水浴10 min，其间不断的上下翻转离心管，以
确保胶块充分的溶解。
C.将上一步所得到的溶液加入到一个新的吸附柱中，13,000 rpm离心30 s，倒掉废液。
将离心柱放回到收集管中。
D.向吸附柱中加入700 µl 漂洗液，13,000 rpm离心30 s, 倒掉废液。
将离心柱放回到收
集管中。
E.向吸附柱中加入500 µl 漂洗液，13,000 rpm离心30 s, 倒掉废液。
将离心柱放回到收
集管中。
13,000 rpm离心2 min，尽量去除漂洗液。
将吸附柱放置于室温或是50℃温箱数分钟，彻底的凉干。
F.将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液
30-50 µl（洗脱液65-70℃预热），室温放置2 min。
13,000 rpm离心1 min收集DNA溶液。
取5 µl 用于连接，其余-20℃保存。
（7）与pGEM-T载体连接，16℃连接过夜。
10 μl体系如下：
pGEM-T 1 μl
T4 DNA连接酶（4U/ µl） 1 μl
Buffer 2× 5 μl
PCR 产物 3 μl
合计10 μl
（8）转化：
A.将连接产物加入到TOP10高效感受态细胞中，感受态细胞（100 μl）置于冰上熔化
用冷却的无菌吸头将上述细胞悬浮液分装到新的预冷的离心管，50μl／管加入连接反应液5.0 μl，轻轻旋转一混匀内容物，冰浴中放置30 min，每隔10 min轻轻旋转一下；
B. 将管放置在42℃水浴中放置60-90 s，不要摇动快速的将管转移到冰浴中，使细胞冷
却2－3 min每管化500 μl LB培养基，置于37℃摇床振荡培养，温浴45 min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素标记基因；
C. 取100 μl的已经转化的感受态细胞转移到含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，用一无
菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，于37 ℃培养16 h，筛选阳性克隆（白色），用于摇菌和菌落PCR扩增鉴定。
（9）按下面组分加入到离心管中，根据载体引物进行PCR检测：
T7: 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′
SP6:5′-ACGATTTAGGTGACACTATAG-3′
超纯水8 µl
菌液 1 µl
T7(10µmol/L) 0.5 µl
SP6 (10µmol/L) 0.5 µl
2×Taq PCR Master Mix 10 µl
总体积20 µl
按照下面步骤进行PCR循环：
95℃ 2 min；
95℃30 s；
57℃30 s；（30 cycles）
72 ℃ 1.5 min
72℃10 min，
（10）质粒提取进行EcolRI酶切检测
EcolR I酶切反应体系：
超纯水13 µl
质粒 5 µl
H buffer 1 µl
EcolRI 1 µl
总体积20 µl
(11)经PCR和质粒酶切检测的阳性克隆进行测序分析：该工作交由北京诺塞基因公司完成。
6.4 丰富度分析，系统发育分析和统计分析
利用Sequencher v.4.2 (GeneCodes, Ann Arbor, MI)对序列进行核酸序列的编辑。
对于细菌amoA基因的系统发育分析利用该基因长约491bp大小的片段进行分析。
利用MacClade()对该基因的核酸和氨基酸序列进行排列。
通过GenBank进行BLAST比对(/BLAST/)。
序列不一致的程度小于或等于5%时作为一个序列组，被定义为一个可操作分类单元（OTUs）。
所有的丰富度分析——包括稀缺性曲线的分析（18）和Chao1 nonparametric richness estimations（5）都利用DOTUR程序进行分析。
Neighbor-joining 方法构建系统发育树和parsimony trees的建立都基于DNA序列比对分析利用ARB来进行
(http://www.arb-home.de)（25）。
我们选择核酸序列而不是已知的氨基酸序列在基因点或时间点上来突出遗传的异质部分。
利用PYLYP进行Distance-based and parsimony-based bootstrap analyses，并且对古菌的amoA基因进行1,000 replicates来评估系统发育分析的可靠性。
通过∫-Libshuff (41)程序对两文库群落组成的不同进行比较分析，10000次随机选择并且在PYLYP距离矩阵中利用0.01的距离间隔（D）。
利用∫-Libshuff来比较分析本试验中得到的保护地土壤样品和露地土壤样品氨氧化古菌群落多样性的不同。
P值利用Dunn-Sida´k
方法进行多重比较分析计算得到（44），P corrected =1-(1- P uncorrected)1/k，k值表示比较分析的文库数量（对于10个amoA基因文库，每一个文库相应的于其他9个其他文库进行比较，k=10×9=90）。
6.5 结果与分析
6.5.1 直接提取土壤微生物的DNA（方法二）
保护地根结线虫发生地和露地健康土壤微生物总DNA的提取，均采用土壤微生物总DNA的提取方法二。
由土壤微生物总DNA的电泳图谱图1可以看到泳道1，2，3，4为保护地土壤微生物总DNA的提取结果。
5，6，7，8为露地土壤微生物总DNA的提取结果。
两地土壤分别用两种不同方法提取DNA，3，4，7，8土壤样品均采用预处理方法提取，1，2，5，6土壤样品均未采用预处理方法提取。
试验结果表明采用预处理的方法较比不用此方法得到的DNA 纯净的多，且得到的DNA的量明显比未采用此方法的要多。
原因是对土样进行预处理可以很好地去除这些杂质, 减少胞外游离DNA污染,减少可溶性的无机物,有机物的污染,特别是减少腐植酸类物质的污染。
而预处理的缓冲液中含有PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）它可以有效去除部分腐植酸类物质。
而且EDTA可以络合金属离子，有效抑制核酸酶的活性，防止在下一步的DNA提取过程中造成DNA的降解。
M 1 2 3 4 5 6 7
5.5.2 PCR扩增氨氧化细菌amoA基因
利用Arch-amoAF和Arch-amoAR对氨氧化古菌amoA基因进行扩增得到大小约为491bp 的条带。
5.5.3 土壤氨氧化古菌的amoA基因克隆文库的构建和测序分析
保护地土壤氨氧化古菌amoA基因克隆文库的构建：PCR产物经纯化后连接在PGEM-T 载体上转化进入大肠杆菌细胞，取100 μl的已经转化的感受态细胞转移到含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37 ℃培养16 h，培养基上得到的即为amoA基因克隆文库。
通过载体引物PCR扩增筛选阳性克隆（白色），得到的结果如图3。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14。
