花药和花粉培养

第五章花药和花粉培养一、概况1.概念花粉培养：指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉作为外植体培养，形成花粉胚或愈伤组织，最终发育成花粉植株（单倍体）的技术.花药培养:指应用植物组织培养技术，把花粉发育到一定时期的花药接种到人工培养基上，以改变花药内花粉的发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，随后由胚状体直接发育成植株或由愈伤组织分化形成植株的培养方式异同点区别: 花药培养属于器官培养范畴，花粉培养属于细胞培养范畴共同点:在培养过程中都是花粉发育，均可获得单倍体细胞系或单倍体植株2.发展概况1964年印度Gula和Maheshwari成功地从毛叶曼陀罗花药培养获得许多胚状体，并证明胚状体直接起源于花粉粒，最终从胚状体进一步发育得到单倍体植株日本、法国、丹麦、德国等相继开展花培研究工作，目前已有10个科，24个属、34个种、250多种高等植物的花药培养获得成功花粉培养始于50年代，Tulecke首先培养银杏的成熟花粉粒得到愈伤组织，随后人们进行了很多研究，在许多植物上进行花粉培养，同时随着培养技术的逐步完善（看护培养、条件培养…)，获得愈伤组织、胚状体、有的还获得单倍体植株我国花培发展概况始于70年代，将花培与传统育种手段相结合，先后培育出一大批具有研究和应用价值的品种。

如烟草、小麦、玉米、甜椒等花培新品系、品种1974年，中科院植物所与山东烟草研究所合作，成功育成烟草新品种，并大面积推广，这是世界上第一个用单倍体方法培养出来的新品种国际公认，我国的花培工作处于国际领先水平。

我国有30多种植物进行花培试验，20多种获得了花粉植株，有一大部分是我国首创，同时在花培方法，机理等方面作了深入研究德著名学者Melchers：“花药培养起始于印度，而首先却在中国广泛应用，就花药培养的单倍体育种的应用而言，中国在世界上处于领先地位”3.意义a.基础理论研究方面研究减数分裂，花粉生长机制的重要方法用来进行生理、生化、遗传等基础理论的研究花粉粒体积小，数量多，形状、内含物成份基本一致，是比较均一的起始材料，便于在人工控制条件下研究它们的生长、分化、遗传等变化过程b.遗传育种=单倍体育种中的意义可获得纯合二倍体，大大缩短育种周期具有选择效率高的优点用于远缘杂交育种，克服杂种不育性便于隐性突变体的筛选，大大提高突变育种的工作效率二、培养方法1.途径愈伤组织再分化形成植株(脱分化到再分化，变异率提高，混倍现象明显取决于培养基中激素的种类、浓度配比) 花粉植株通过胚状体形成植株花粉植株()2.花粉培养优点:不存在体细胞干扰，没有混倍现象缺点:培养技术难度大花粉分离自然散落法：机械挤压法：优点⏹操作简便⏹适于双子叶植株，不适于禾谷类，易损伤花粉粒缺点⏹花粉中易混有体细胞⏹悬浮液中花粉密度不易控制注意：液体培养基中加蔗糖或甘露醇，调节渗透压，避免花粉吸水胀裂三、影响花培成功的因素有些难培养植物诱导频率很低，有些植物（裸子植物）至今没有获得真正的花培植株花药培养虽然是一项成功的技术，但要获得良好的效果，还需克服许多困难诱导植株成功与否以及诱导频率受多种因素影响（一）供试材料1.材料的基因型材料的遗传背景不同，诱导难易程度不同茄科番茄、蔓陀罗、烟草易成功禾本科水稻优于小麦亚种水稻粳亚种(40-80%)优于籼米亚种(2%)花药培养力是可以遗传的，且为显性或超显性2.植株的生理状态和年龄年幼植株花培成功率高开花始期成功率高烟草开花始期时花药比开花后期的更易产生花粉植株烟草开花期第6天，诱导率最高与植株的营养和生长条件有关N饥饿>高N水稻高温，高N下，诱导率下降，白化苗提高3.花粉发育时期——是影响花培成败的最关键因素之一四分体时期单核期---早、中、晚期双核期三核期#不同植物最适诱导期不同曼陀罗、烟草属、水稻---单核早期、双核期均可诱导，以单核中、晚期效果最好小麦、玉米---只有单核中期才能诱导大麦---单核晚期最佳一般采用单核中-晚期的花粉培养不同植物花培的合适花粉发育时期处于单核期的花粉培养最有利于诱导成苗小孢子发育第三期是胚胎形成的临界期，超过了这一时期胚状体就不能形成在小孢子发育过程，花药内激素水平正在不断改变，由于花药的成熟使激素平衡变得不适合，或为花粉发育所必需的其他一些养分已经耗尽，从而影响了诱导率培养前应确定花粉发育时期镜检：醋酸-洋红、I-KI染色（禾本科、茄科）、焙花青-烙矾法（木本、番茄）利用相应的形态学指标对于花培没有成功的植物最好选取花粉发育各个时期的花粉进行培养，确定最佳时期4.材料的预处理——试验证明，有几种预处理方法能有效提高诱导率低温预处理烟草：7-9℃，7-14天番茄：6-8 ℃，8-12天水稻：10℃，2-14天小麦、黑麦：1-3 ℃，2-20天常温下N饥饿预处理乙烯、高糖、离心预处理（二）培养基1.基本培养基MS应用最多，N6、B5、Nitsch也有应用不同植物种类，适用的培养基不同双子叶：Nitsch、MS十字花科、豆科：B5水稻等禾谷类：N62.碳源蔗糖应用最广，既是最好的碳源，又起调节渗透压的作用不同植物种类、不同诱导时期最适碳源浓度不同，通常以2-5%为宜烟草：2%诱导胚状体小麦：8-10%愈伤；5-8%分化水稻：4-6%愈伤；2-3%分化玉米：12-15%愈伤3.激素关键决定于激素种类、浓度、配比实例小麦：2mg/L 2.4-D 愈伤；< 2mg/L 胚状体4.其它添加物有机附加物、水解乳蛋白、水解酪蛋白、酵母提取物、肌醇、谷氨酰胺等活性炭（0.5-1%)吸附了琼脂中不利于细胞生长的某些杂质吸附了培养基高压灭菌蔗糖产生5-羟甲基糠醛吸附了激素，降低了激素水平（三）培养方法和培养条件1.材料的接种保证完全无菌条件、注意接种密度（104-105粒/ml为好），花药组织分泌的活性物质相互作用有利于诱导密度太高，养分消耗太快；密度太低，诱导率下降。

花粉和花药培养的比较花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。

该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。

小麦花药胚状体发生一、植物花药和花粉培养的概念（一）花药培养通过无菌操作技术，把发育到一定阶段的花药，接种在人工培养基上，进行诱导、分化，最终形成完整植株的技术。

草莓花药愈伤组织,花药植株（二）花粉培养将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养，也叫小孢子培养。

1964年：Guha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成胚；1967年：Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株；目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株。

二、花药培养历史通过花药培养育成的甜椒新品种：海花三号相同点：培养目的相同，均获得小孢子植株。

不同点：（一）花药培养离体操作技术简单，而且，药壁组织有时可作为条件因子促进小孢子的发育。

辣椒花药吊竹花粉粒三、两者的异同点花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。

但技术更复杂。

（二）花药培养属于组织培养；而花粉培养属于细胞培养。

1.花药培养容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生的植株中会出现不同倍性的个体，所以花药培养在诱导单倍体方面有一定的局限性，而分离的花粉粒培养可以克服这一不足。

2.由于去除了药壁和其它连接组织的干扰，因此能更好地调节控制雄核发育的各种因子，而且能直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程。

四、花粉培养的优点3.花粉是真正的单细胞单倍体，均能匀质地接受各种化学的、物理的因子处理，是突变体筛选及外源基因导入研究的有用材料，对育种有很大的意义。

4.一个花药中就有成千上万个小孢子，从花粉培养能得到更多的花粉植株。

七叶树花粉粒思考题1.简述花粉和花药培养的概念；2.花粉培养的特点是什么？3.花药培养的特点是什么？参考文献与网站Thank You!。