超声提取苦参中的苦参碱和氧化苦参碱

1 简述苦参碱、氧化苦参碱(苦参素)是苦豆子、苦参、广豆根等豆科槐属植物中生物碱的主要成份。

苦参碱(matrine)和氧化苦参碱(oxymatrine)化学分子式分别为C15H24N2O 和C 15H24N2O2,分子量分别为248 和264,是苦参型生物碱的主要活性成分,二者在一定条件下可以转化.2 苦参碱提取工艺2.1溶剂提取法苦参碱的溶剂提取法, 常用水、酸水及乙醇等作为提取溶媒, 提取方法多为浸渍、渗滚、煎煮、回流等经典方法。

孔令明等川从酸水回流提取、乙醇回流提取两大苦参总碱方法的对比中发现,乙醇回流法对苦参总碱的提取效果较好, 是一种目前较为合适的苦参总碱溶剂提取方法。

其最佳工艺参数为: 采用筛分目数20—60 目的苦参粉, 以60 % 的乙醇溶液, 料液比为1 : 2 , 回流提取2 次。

谭桂莲分别对水煎法、乙醇回流法和渗滤法提取氧化苦参碱工艺进行优选研究, 结果表明, 渗滤法所得浸提物中, 氧化苦参碱含量明显高于水煎法和乙醇回流法, 故认为渗滤法为氧化苦参碱的最佳提取方法。

2.2 离子交换法利用生物碱盐通过强酸型阳离子交换树脂柱, 使生物碱盐阳离子交换在树脂上, 而非生物碱化合物则流出柱外, 将交换后的树脂晾干, 用氨水碱化, 氯仿提取的原理。

高拴平等研究了离子交换法提取分离苦参碱的工艺和过程, 技术路线是:苦参粉→甲醇回流提取→回收溶剂→粗提物→稀硫酸溶解→脱脂→水层→除鞣→上D201型阳离子交换树脂※碱化树脂→氯仿提取→回收溶剂→脱水→丙酮→苦参碱结晶。

采用上述提取分离方法, 苦参碱的产率最高, 结晶质量最好。

张存莉等采用不同浓度的乙醇和阳离子交换树脂对苦参碱进行提取和纯化, 并对不同的苦参碱纯化工艺进行比较和研究。

结果表明, 用60%的乙醇进行提取和用阳离子交换树脂进行纯化的工艺过程生物碱收率较高, 生产成本较低, 工序较为简单, 有一定的进步性, 适宜工业化生产。

2.3 树脂吸附法吸附树脂是近10年来发展起来的一类有机高分子聚合物, 它具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和, 使用周期长、宜于构成闭路循环, 节省费用等诸多优点。

苦参生物碱的提取与分离张婷婷制药2班101310402290引言苦参又名苦骨、川参、凤凰爪、牛参、地槐、野槐等，为豆科多年生落叶亚灌木植物舌参根，采挖后去芦头及须根晒干切片入药，全国各地均产，功能主要为清热、燥湿、杀虫等，主治热毒血痢、肠风下血、黄疸、赤白带下、小儿肺炎、急性扁桃体炎等多种炎症和痔漏、疥癞恶疮、皮肤瘙痒、阴疮湿痒等疾病研究得知，苦参的根含有多种生物碱，如氧化苦参碱、羟基苦参碱、甲基野靛碱、臭豆碱、赝靛叶碱、脱氢苦参碱（槐果碱）等多种生物碱及黄酮类化合物因为苦参碱具有多方面的药理作用，如抗肿瘤作用、抗癌作用、抗病毒作用，所以对苦参总碱的提取与分离具有重要的意义苦参总碱的提取方法相对较多，本文中主要侧重论述苦参提取水煎法。

1 苦参碱以及其化学结构1.1苦参碱的基本性质苦参碱系指从豆科植物苦参、苦豆子、山豆根中分离出来的生物碱，是上述3种传统中草的主要活性成分之一，是苦参类生物碱的代表.《中国药典》2010年版一部中，是以苦参碱的含量作为苦参药材的质量控制指标［1］；2005年版一部中，苦参碱的含量也是苦参药材的质量控制指标之一.1.2 苦参碱的化学结构苦参碱是白金雀儿碱的异构体，属于喹喏里西啶类衍生物，由2个喹喏里西啶环骈合而成，有2个氮原子，一个是叔胺氮，一个是酰胺氮，其分子式为C15H24N2O,分子量为245.37.苦参碱有4种形态：α-苦参碱为针状或柱状结晶，熔点为760C;β-苦参碱为斜方晶状，熔点为870 C;γ-苦参碱为液体，沸点为2230Cδ- 苦参碱是柱状结晶，熔点为840 常用的是α- 苦参碱,其结构见图1.苦参碱能溶于水、苯、氯仿、甲醇、乙醇，微溶于石油醚。

图一α-苦参生物碱的结构图[2]2.苦参类生物碱的药理作用近年来发现苦参碱类生物碱在保护中枢神经系统和心血统、抗病毒、抗炎、免疫抑制及抗肿瘤等方面有重要的药理活性和应用前途［4］.2.1 苦参碱的抗肿瘤作用苦参碱类药物对于多种实验性肿瘤均有抑制作用，且多为移植性实体瘤.苦参碱和氧化苦参碱同是苦参中抗癌有效成分，对癌细胞有直接杀伤作用.电镜观察可见肿瘤细胞分裂呈中等抑制，瘤细胞膜和细胞质有明显改变.此外，苦参碱类药物具有毒性低、无抑制骨髓和机体免疫功能的优点.动物实验表明，氧化苦参碱对S -180有显著抑制作用.日本报道它对S -180的治疗指数比丝霉素的治疗指数大7至8倍，临床效果类似于苦参碱.另有发现：苦参碱对P815肿瘤细胞亦有直接毒性作用，能降低P815细胞的3H-TdR掺入值，这从机制上可能说明苦参碱是一种直接细胞代谢抑制剂.2.1.1 对肝癌细胞的作用一定浓度的苦参碱对HepG2细胞的增生有抑制作用[5]，主要为直接杀伤作用，从而影响了HepG2细胞的代谢，使AFP和PCN分裂指数降低，恶性表型消失，肿瘤细胞恶性程度和侵袭力减弱，这说明苦参碱可能成为很好的抗癌药物2.1.2 对胃癌细胞的作用苦参碱在体外对胃癌细胞具有杀伤作用，且在一定剂量和时间范围内呈明显的量效和时效关系,低分化的胃癌细胞AGT对苦参碱更为敏感,苦参碱对胃癌细胞株的外杀伤作用与其诱导胃癌细胞凋亡有关,将苦参碱作用于胃腺癌细胞SGC-7901 48h后，胃癌细胞Bcl-2表达量显著下降,可以推断出苦参碱对胃癌细胞凋亡的诱导作用可能与其影响Bcl-2的表达有关.2.1.3对肺癌细胞的作用实验表明，三参冲剂（主要成分为苦参碱和川芎嗪）对肿瘤细胞与内皮细胞的粘附因子有明显抑制作用，并可明显抑制CD44和CD49粘附因子的表达，从而抑制肿瘤细胞与内皮细胞的粘附，还可减轻内皮细胞的通透性，保护内皮细胞的完整性，阻断了肿瘤细胞与基质的粘附，从而减少了肿瘤转移的形成. 这主要是因为三参冲剂对Tiam-l基因具有一定调控作用.2.2 对中枢神经系统的作用研究发现氧化苦参碱、苦参碱等具有解热镇痛等中枢抑制性作用. 氧化苦参碱能明显抑制小鼠的自主活动，与水合氯醛等中枢抑制剂有协同作用，而对苯丙胺等中枢兴奋剂则有拮抗作用.苦参碱、氧化苦参碱对化学刺激和热刺激所致小鼠的疼痛反应均有明显抑制作用.苦参碱腹腔注射或口服均能抑制酵母菌致小鼠直肠升温作用，而此作用不能被阿托品和羟甲丙基麦角酰胺所拮抗，但可被多巴胺受体拮抗剂氟哌啶醇完全拮抗. 观察并推测苦参碱的解热功能除了对产热过程的直接作用外，还具有多巴胺能样活性.2.3 对心血管系统的作用大量研究表明，苦参碱在强心和抗心率失常方面有显著的作用. 苦参碱和氧化苦参碱均能对抗乌头碱、哇巴因、氯仿- 肾上腺素、氯化钡及冠脉结扎等诱发的动物实验性心率失常，且多为室性心率失常，并且均呈剂量依赖性的正性肌力作用. 实验证明，这几种生物碱都可显著增强离体豚鼠右心室乳头状肌收缩力.苦参碱作为潜在的强心药，一般同时具有增强心肌收缩力、减慢心率和拮抗心率失常的有益作用. 目前临床试用苦参碱和氧化苦参碱，发现对室性期前收缩、频发性期前收缩及阵发性心动过速效果较佳，这说明苦参碱类生物碱在强心和抗心率失常方面有着广阔的前景.2.4 抗病毒、抗炎作用2.4.1 在治疗乙型肝炎中的应用中药苦参碱治疗肝炎在《本草纲目》中已有记载. 中医认为，苦参碱性寒味苦，具有清热利湿、退黄利尿、消炎解毒等作用，可治疗多种疾病. 基础实验和临床研究表明，苦参碱具有多方面的药理作用及临床功能：①抑制胶原纤维增生而具有抗纤维化作用，这可能与其阻断PDGF（血小板源生长因子）和TGF-β1（转化生长因子β1）的作用，抑制储脂细胞增生和胶原合成有关［6］，苦参碱能够保护肝细胞，尤其是膜性结构，降低丙氨酸氨基转移酶、透明质酸、层黏蛋白水平，还可增加胆汁回流，消退黄疸；②抑制网状内皮系统吞噬功能，具有免疫调控作用. 苦参碱有免疫抑制活性，可抑制巨噬细胞胞浆、胞膜的PKC（蛋白激酶c）的活性，有可能成为一种有效的PKC 抑制剂. 实验证明苦参碱体内外均可抑制TNF 和IL-6的分泌，这可能与其抑制PKC 活性有关. 由于TNF 是肝脏炎症损伤中的重要介质，而对于LPS （细菌脂多糖）诱导的小鼠血清及培养的大鼠库普弗细胞的TNF 和IL-6升高，苦参碱都有抑制作用，这有可能是其消除肝脏炎症的机制之一. 苦参碱不仅有抗炎、抗肝损伤、改善肝脏微循环、促进肝细胞再生的作用，还有助于胆红素的摄取结合与排泄，起到降酶、退黄作用，并有抑制乙肝病毒复制和免疫抑制作用20世纪80年代以来干扰素被公认为有效的抗病毒药物，但其病毒学指标中HbeAG率约40％, 且停药后易复发. 干扰素主要通过与靶细胞膜上特异受体结合诱导靶细胞产生抗病毒蛋白，从而破坏病毒的mRNA ，抑制病毒复制，但其免疫调节作用弱. 而慢性乙型肝炎患者普遍存在免疫紊乱的情况，不利于乙型肝炎病毒的最终清除. 苦参碱注射液能提高机体免疫力，有清热利湿、利尿退黄、解毒功能，能改善病理性肝炎症状与体征. 干扰素加苦参碱注射液治疗慢性乙型肝炎能起到互补协同作用，能明显提高干扰素的治疗效果，临床无不良反应，值得推广应用.2.4.2 在治疗病毒型心肌炎中的应用陈曙霞等发现苦参碱具有独特的抗柯萨基B组病毒（CVB）的显著作用，体内外实验均证实病毒性心肌炎模型小鼠经苦参碱治疗后存活期明显延长，有的完全治愈，心、肝组织无病变发生，脾脏T 淋巴细胞亚群及NK 细胞活性亦改变.提示苦参碱能抑制LWB 繁殖，而且尚有免疫调节功能［8］. 实验和临床证明苦参碱类生物碱还有多种抗炎作用，其机制不详. 已有临床应用苦参碱静脉滴注治疗病毒性心肌炎的报道.3 苦参碱的提取与分离3.1 传统煎煮法对苦参的提取在苦参中苦参总碱或苦参碱及氧化苦参碱的提取方法中较为常用的有溶剂提取法和离子交换法. 笔者在实验中首先采用了传统的煎煮法：将中药苦参粗粉置适宜煎煮器中，加适量水浸没原料，充分浸泡后加热至沸，保持微沸浸出一定时间. 此法较简便，而且经煎煮后，药中的大部分成分可被不同程度地提出，因此是提取有效成分特别是药物制剂的基本方法.3.1.1 实验仪器包括电子天平、旋转蒸发器、电炉、磁力搅拌器、超声波振荡器等.3.1.2 材料苦参（购于中药市场，批号：20050715）、乙醇（AR）、乙酸乙酯（AR）、HCL（AR）、氯仿（AR）、NaOH、大孔吸附树脂、硅胶G 、纤维素钠、氧化苦参碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0402-200506）3.1.3 苦参提取水煎法首先用植物粉碎机粉碎苦参，并称取苦参粉100g加水1000ml 用电炉煮沸，煎煮1.5h，过滤收集药液. 再加水800ml电炉煮沸煎煮1h，过滤收集药液. 第3次加水600ml电炉煮沸，煎煮30min,过滤收集药液. 弃药渣合并三次药液，用纱布过滤冷却，并于3 000r/ min 离心5min，得上清液，于40C 冰箱冷藏备用. 旋转蒸发仪浓缩药液至50ml左右, 并过大孔吸附树脂（5ml/min）洗脱分离，得流出液，用80%的乙醇对大孔吸附树脂进行洗（2ml/min）再将流出液与洗脱液分别用氯仿、乙酸乙酯溶液萃取3次（8h次），用硅胶薄层层析，经显色鉴定表明流出液含有黄酮、洗脱液含有生物碱. 然后再用荧光显色鉴定，并与标准品对照，发现洗脱液中得到的生物碱至少含有3种.3.1.4 苦参碱的分离方法(1)准备吸附柱. ①取20AB-8树脂用清水浸泡15min;②取中小型柱子，洗净干燥，填入玻璃纤维；③将浸泡好的树脂与水一起转入柱子内，打开阀门排出多余水分；④用80%乙醇、5%盐酸溶液浸泡树脂过夜，再排出. 再第二次将上诉溶液加入柱子，浸泡4h.⑤用清水洗净，直到洗后溶液PH值为5为止；⑥用蒸馏水浸泡待用.2）薄层层析. ①将5g羧甲基纤维素钠加入100ml水溶解煮沸. ②将上诉溶液与硅胶G 以3：1的体积比调匀，并于1050C 下干燥40min. ③取一个载玻片，将干燥后的稠状液体均匀涂抹于上面, 干燥待用. ④在制备好的薄层上画一条基线，于中心点样药品原液数次. ⑤生物碱的展开剂为三氯甲烷、甲醇、氨水混合液，其中三氯甲烷：甲醇：氨水=5滴：0.6滴：6滴；对黄酮的展开剂为三氯甲烷和甲醇混合液，三氯甲烷：甲醇=8.5滴：1.5滴. ⑥用碘化铋钾对生物碱显色，发现有3个有色斑点. ⑦用5%三氯化铁对黄酮显色，发现没有有色斑点.3）让原药液流过吸附柱（速度为5ml/min），再用80%乙醇洗脱（速度为5ml/min），得到2部分溶液（流出液、洗脱液）. 分别对这2部分进行薄层层析，发现都有生物碱的存在. 说明生物碱在树脂上的吸附效果不好，准备调整PH 值及树脂进行再次吸附.4）用旋转蒸发仪对洗脱液进行浓缩，再用氯仿、乙酸乙酯分别进行萃取，得2部分溶液. 再对2部分溶液进行薄层层析，发现氯仿萃取的部分有生物碱的存在，而乙酸乙酯萃取的部分其中虽然有物质的存在，但是既不是黄酮也不是生物碱，需要进一步鉴定分析.3.2 酸水回流法提取苦参碱酸水回流法也是常用于苦参中苦参碱的提取方法，本次实验中采用了HCL 无机酸作为提取剂，用于对比传统煎煮法实验.3.2.1 仪器包括METTL ERAE 240电子天平、RICA 旋转蒸发器、EYELA COOLACE CCA-1100冷凝水循环装置、Waters 2695高效液相色谱仪3.2.2 材料苦参（购于重庆中药饮片厂）、乙醇（AR）、甲醇（HPLC）、乙腈（HPLC）、氯仿（AR）、HCL（AR）、NaOH、苦参碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0413-200506）、氧化苦参碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0402-200506）3.2.3 标准曲线的制作精密称取苦参碱对照品，以无水乙醇溶解，配制成含苦参碱0.492mg/ml 的溶液作为对照品溶液%分别取1，5，9，13，15u以HPLC 测定峰面积［9］，每样进2针取平均值，色谱条件为：Xterra RP185um4.6x150mm柱，柱温200C ，0.8ml/min,220nm,甲醇:水:三乙胺=480:520:0.4以峰面积为纵坐标，苦参碱量（)=）为横坐标，得回归方程：y=-34970.14999+1277796.646x；r=0.9999即苦参碱量在0.492到7.380ug范围内呈现良好的线性关系.3.2.4 酸水回流法提取苦参总碱选用L934,设计实验. 取苦参粉10g,按表1正交试验安排进行提取，以苦参碱得率为指标衡量提取效果. 试验流程如下：工艺液回流提取→HCL 水溶合并回流溶液→过滤→滤液用10%NaOH调节，使PH值为10到11 →过滤→滤液浓缩至小体积→以氯仿进行4段萃取（氯仿用量分别为用量体积的1倍、1/2倍、1/2倍、1/2倍）→合并氯仿层→蒸干→无水乙醇定容至25ml→测定苦参碱得率.4 未来展望近年来有关苦参类生物碱的药理研究工作已取得了很大进展，而临床上主要用于治疗肝炎的居多，对其他方面疾病的应用基本上还处于试验阶段. 在药物来源方面，我国以提取或提取后还原转化制备的工艺最为成熟，而合成方面虽然也有研究，但合成成本较高. 出于资源保护和经济效益考虑，由于中草药提取液苦参碱含量低，分离提纯麻烦，通过人工化学合成这类生物碱及其衍生物是非常必要的.参考文献：[1] 中华人民共和国国家药典委员会. 中国药典（Ι部）[M]北京：化学工业出版社，2000.[2] 刘文雅，刘汉清. 苦参碱的药理研究进展［J］. 中华实用中医杂志，2006（4）：473-475.[3] 刘北忠，蒋纪恺. 苦参碱与人类红血病细胞株K 562的结构特征研究［C］// 第五届西南三省一市生化学术会论文文集. 成都：［出版社不详］，1997.[4] 李弟，潘显道. 苦参碱类生物碱研究进展［J］. 医学研究通讯，2000(1)65-66.[5]司维柯，肖元. 苦参碱对人肝癌细胞HepG2的形态影响和相关增殖因素的变化［J］. 第三军医大学学报，2000，22（6），[6]张俊平，张珉. 苦参碱体内外抗大鼠肝纤维化的作用［J］.中国药理学报，2001,22(2),186.[7] 林文，张俊平. 苦参碱对细菌脂多糖诱导大鼠枯否细胞释放肿瘤坏死因子及白细胞介素-6的影响［J］. 药学报,1997,32(2):186.[8] 陈曙霞. 苦参抗柯萨基B 组病毒的初步研究［J］. 上海第二医科大学学报，1991,11(2):140-142.。

苦参不同方法提取物抗鱼体车轮虫作用的研究张继平;贺顺连;胡卫平【摘要】采用超声波、冷凝回流及常温浸泡3种方法从苦参中提取分离生物碱,经初步分析,其主要成分为苦参碱、氧化苦参碱等.运用药理学方法对得到的生物碱进行了抗鱼体车轮虫试验,结果显示:苦参生物碱能对鱼体鳃部车轮虫起到有效的驱杀作用;不同提取方法的提取物中由于生物碱的成分与含量有差异,对车轮虫的杀灭效果也有显著差异;超声波提取物中苦参碱的含量最高,对车轮虫的杀灭效果也最好,表明苦参生物碱中对车轮虫起驱杀作用的成分主要是苦参碱.【期刊名称】《长江大学学报（自然版）理工卷》【年(卷),期】2005(002)002【总页数】3页(P57-59)【关键词】鱼体车轮虫;苦参提取物;治疗作用【作者】张继平;贺顺连;胡卫平【作者单位】广东佛山科学技术学院动物科学系,广东,佛山,528231;广东佛山科学技术学院动物科学系,广东,佛山,528231;湖南五指峰生化有限公司,湖南,浏阳,410300【正文语种】中文【中图分类】S943近几年，全国各地的水产养殖中都不断发生因寄生虫病暴发流行而损失惨重的事件。

顺德、南海等地在1999年、2000年连续出现鳗鲡、鳜鱼的车轮虫病、指环虫病的暴发，由于缺乏有效药物治疗，损失很大，严重危害了水产养殖业的稳步健康发展。

目前，国内水产用杀虫药物大都以人工合成的化学药物为主(如有机磷杀虫剂、重金属类杀虫剂、菊酯类杀虫剂等)，此类化学药物毒性与残留都较大，虫体也易产生抗药性，不符合环保和健康食品要求[1]。

中草药商品制剂用于水产养殖主要见于防治水产动物细菌与病毒病[2]，针对水生动物寄生虫病的制剂很少，也主要是见于民间使用，因此，生产上用药常带有很大的盲目性。

由于植物源生物碱可通过破坏虫体的神经系统以及引起虫体拒食作用等起到驱虫杀虫效果[3]，因此，本试验尝试从苦参中提取生物碱用于抗鱼体车轮虫研究，旨在为探索研究及开发应用中草药防治水生动物寄生虫病提供理论参考。