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双抗夹心法ELISA（TAS-ELISA）步骤：1、准备可控温培养箱或摇床和样品。
样品用液氮或研钵研磨碎，再用组织：1×GEB 缓冲液=1:10（g:ml）浓度液提取。
2、用碳酸盐包被缓冲液稀释一抗，稀释倍数为200倍。
每孔加入稀释后的一抗100μl。
将加入一抗的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
3、一抗包被结束时，在水池中倒出剩余液体，用1×PBST洗4-5次，每次将酶标板在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
4、每孔加入100μl事先处理好的样品，每批实验均需加入阳性对照和样品提取液（GEB）。
将加入样品的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
5、样品包被时间结束时，在水池中快速倒出剩余样品液体，用1×PBST洗7次，最后一次在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
在室温中放置5min，或用枪头吸尽孔中液体。
6、用ECI抗体稀释液稀释酶标二抗，稀释倍数为200倍。
每孔加入稀释后的二抗100μl。
将加入二抗的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
7、二抗包被结束时，在水池中快速倒出剩余抗体，用1×PBST洗8次，最后一次在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
在室温中放置5min，或用枪头吸尽孔中液体和气泡。
8、在二抗包被结束前15min中准备底物显色液。
PNPP/1×PNP Buffer=1mg/ml的浓度配制，避光保存。
每孔加入底物100μl。
将加入底物的酶标板用锡箔纸包裹，置于37℃下孵育1小时。
9、显色30min时用肉眼观察显色结果，阳性孔应该显色，GEB孔应该无色。
直到显色1h时，阴性仍然无色就在酶标仪上测405nm处的OD值，求出阴性对照的OD值的值N，若样品OD值P≥2N，则视为阳性，否则为阴性。
试剂：。
第1篇一、实验目的1. 掌握双抗体夹心法的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用ELISA技术检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。
3. 分析实验结果，验证实验方法的有效性和准确性。
二、实验原理双抗体夹心法是一种常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，用于检测抗原。
其基本原理是将抗原与抗体结合，形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗体，通过显色反应判断抗原含量。
具体步骤如下：1. 将已知抗体包被于固相载体上，形成固相抗体。
2. 加入待测标本，若标本中含有目标抗原，则与固相抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
3. 洗涤去除未结合的标本。
4. 加入酶标记的抗体，该抗体能与抗原-抗体复合物中的抗原结合。
5. 再次洗涤去除未结合的酶标记抗体。
6. 加入底物，底物在酶的催化下发生颜色变化，颜色深浅与抗原含量成正比。
三、实验材料1. 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）标准品2. 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）单克隆抗体3. 酶标记的二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体）4. 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒5. 微孔板6. 仪器：酶标仪、离心机、移液器等四、实验步骤1. 包被抗体：将乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）单克隆抗体稀释后，加入微孔板中，每孔100μl，37℃孵育过夜。
2. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。
3. 封闭：加入封闭液，每孔200μl，37℃孵育1小时。
4. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。
5. 加样：将待测标本、阳性对照、阴性对照和空白对照分别加入对应的孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时。
6. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。
7. 加酶标记二抗：将酶标记的二抗稀释后，加入各孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时。
8. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。
9. 加底物：将底物A液和B液按比例混合，加入各孔中，每孔100μl，37℃孵育15分钟。
双抗夹心法测抗原原理双抗夹心法是一种常用的免疫学实验方法，用于检测特定抗原的存在。
它利用抗原与抗体的特异性结合来实现检测，从而确定样本中是否含有目标抗原。
双抗夹心法的原理可以简单概括为三个步骤：固定抗体、夹心抗原和检测抗体。
固定抗体被涂在固体表面上，如实验室常用的微孔板。
这些抗体通常是特异性的，能够识别并结合目标抗原。
固定抗体的涂布可以通过直接涂布、吸附或共价结合等方法完成。
接下来，待检测的抗原样品被加入到微孔板中，与固定抗体结合形成抗原-抗体复合物。
这一步骤被称为抗原的夹心过程，因为抗原被夹在固定抗体和检测抗体之间。
检测抗体被加入到微孔板中，与已夹心的抗原结合。
检测抗体通常与标记物相结合，例如酶、荧光染料或放射性同位素等。
通过检测标记物的信号，可以确定目标抗原的存在量。
双抗夹心法的关键在于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是一种能够被免疫系统识别并引发免疫反应的物质，可以是细菌、病毒、细胞表面蛋白等。
而抗体是由免疫系统产生的特异性蛋白质，能够与特定抗原结合形成稳定的复合物。
在双抗夹心法中，固定抗体和检测抗体的选择非常重要。
固定抗体必须具有针对目标抗原的特异性，以确保只有目标抗原能够结合。
而检测抗体则需要与固定抗体结合的位置不同，以便检测标记物的信号不受干扰。
除了特异性结合，双抗夹心法还具有高度灵敏性和可重复性的优点。
通过选择合适的抗体和优化实验条件，可以使其达到非常低的检测限度。
因此，双抗夹心法被广泛应用于医学诊断、生物学研究和药物开发等领域。
需要注意的是，双抗夹心法虽然在抗原检测中具有很高的可靠性和准确性，但仍然存在一些局限性。
首先，抗体的特异性有时可能受到干扰物的影响，导致误判。
其次，双抗夹心法无法提供关于抗原的定量信息，只能确定其存在与否。
双抗夹心法是一种常用的抗原检测技术，通过特异性抗体的结合来确定样本中是否含有目标抗原。
其原理简单明了，操作方便，具有高度灵敏性和可重复性。
在今后的医学和生物学研究中，双抗夹心法将继续发挥重要作用，为人们提供可靠的实验手段。
ELISA法测定癌胚抗原（CEA）操作规程1．检验目的检测血清CEA主要是用于空腔脏器如胃肠道、呼吸道、泌尿道的肿瘤诊断，还可作为手术疗效、是否转移和监测复发的指标；另外在某些良性病变中也会轻度升高，如酒精性肝病、胆道疾患等。
2．方法原理采用ELISA双抗体夹心法：向抗CEA抗体包被的聚苯乙烯反应板微孔内加入待检标本，再加酶标记抗CEA抗体，加入酶底物显色，用终止液终止反应，测定吸光度值，测定光密度，查标准曲线，计算待测标本中CEA含量。
3.性能指标此方法快速简便、特异性强、检测灵敏度度0.5ng/ml。
4．标本收集4．1标本类型：静脉血或动脉血的血清或血浆标本均可作为检测标本（抗凝剂可用肝素钠、枸橼酸钠、ACD、CPDA-1或EDTA，抗凝剂的质量应符合化试药品要求——化学纯或分析纯，使用的比例以厂家推荐为准）；其他体液如尿液、唾液、精液、羊水、胸水、腹水、乳汁等体液可以作为检测标本，但加热灭活的血清和血库的库存血则不宜作为检测标本。
4．2标本留取：以空腹为宜，收到标本后最好立即离心留取血清或血浆（凝固血应待其充分凝固后收集血清），不能有残留的红细胞、纤维蛋白丝，使用肝素治疗的病人宜在肝素治疗前抽血。
4．3标本保存：留取的标本最好在3小时内检测，不能立即检测的应放置于2-8℃最长达14天（可以含有凝块但要密闭以防蒸发），或者-10℃最长达14天（不能反复冻融也不能含有凝块和红细胞）。
4．4标本容器：盛放标本的容器必须为洁净的一次性真空采血管、玻璃试管、一次性的不同规格的塑料离心管4．5标本外送：如涉及到需要外送的标本，必须以规定的容器（0.5ml塑料离心管）存放并密封，并根据邮寄规则和要求进行包装，运送时还要放入冰袋（2-8℃）或干冰（-10℃）由专人运送至指定地点指定接收人。
4．6拒收标本：凡与4.1-4.5所述内容不符的标本，检验人员应向临床或就诊者说明拒收标本的原因，并提出解决的方案或建议。
双抗体夹心ELISA法检测CEA一、实验目的1. 阐述酶联免疫吸附测定(ELISA)的原理，列举ELISA类型2. 完成ELISA的基本操作3. 学会分析实验结果4. 能根据需要设计相应的ELISA实验流程二、实验原理酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。
ELISA 类型：直接法（一步法）；间接法（间接ELISA、双抗体/原夹心法，竞争性ELISA、BAS-ELISA）。
1. 已知的抗原或抗体结合到特定的固相载体表面（聚苯乙烯微量反应板，利用蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附），并保持其免疫学活性。
将抗原或抗体固定在固相载体表面的过程称为包被(coating)。
蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。
这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。
大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
包被用抗原分为——天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。
合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。
一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。
借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。
2. 抗原抗体的特异性结合：可用于以已知抗原检测未知抗体或以已知抗体检测未知抗原。
本实验采用以已知抗体检测未知抗原。
3. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。
结合在固相载体上的酶量与标本中待测抗原或抗体的量成正比。
（制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。
最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。
elisa双抗体夹心法实验报告实验报告：ELISA双抗体夹心法实验一、实验目的本实验旨在通过ELISA双抗体夹心法，检测待测样品中目标蛋白的含量，为相关研究提供依据。
二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种灵敏的免疫学检测方法，通过将特异性抗体与酶标记结合，实现对目标蛋白的定量检测。
双抗体夹心法是一种常用的ELISA 技术，其原理是将两种特异性抗体分别固定在酶标板的不同位置上，形成两个“抗体夹心”，实现对目标蛋白的双重捕获，从而提高检测的灵敏度和特异性。
三、实验步骤1.酶标板包被：将第一种特异性抗体（capture antibody）包被在酶标板孔中，以固定化抗体形式捕获目标蛋白。
2.封闭：加入封闭液（通常为正常血清或BSA），填充孔内未结合的位点，以减少非特异性吸附。
3.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。
4.样本加入：将待测样本加入酶标板孔中，与固定化的抗体发生特异性结合。
5.洗涤：再次洗涤酶标板，以去除未结合的物质。
6.酶标二抗加入：将第二种特异性抗体（detection antibody）与酶标记结合，形成酶标二抗。
将酶标二抗加入酶标板孔中，与目标蛋白发生特异性结合，形成“抗体夹心”。
7.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。
8.显色反应：加入底物溶液，发生显色反应。
若目标蛋白存在，则呈现颜色变化。
9.终止反应：加入终止液，停止显色反应。
10.吸光度测定：用酶标仪测定各孔的吸光度值（通常在450nm处测量），根据吸光度值判断目标蛋白的含量。
四、实验结果根据实验数据，绘制标准曲线图和散点图，分析待测样品中目标蛋白的含量。
通常，标准曲线图横坐标为蛋白浓度，纵坐标为吸光度值。
通过将待测样品的吸光度值与标准品进行比较，计算出待测样品中目标蛋白的浓度。
五、实验总结本实验通过ELISA双抗体夹心法成功检测了待测样品中目标蛋白的含量。
实验过程中需注意保持操作环境的清洁和干燥，避免影响实验结果。
E L I S A双抗体夹心法-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIANELISA双抗体夹心法点击次数： 320? 作者：百奥迈科发表于：2009-03-13 16:18转载请注明来自丁香园1、原理ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2、特点某些分泌型蛋白，用siRNA 干扰后可以用ELISA 进行检测。
3、ELISA 实验流程示图（以双抗体夹心法为例）?4、试剂与耗材（1）包被缓冲液（pH 9.6 0.05 M 碳酸盐缓冲液）：（2）洗涤缓冲液（pH 7.4，0.15 M PBS）：（3）稀释液：（4）终止液（2 M H2SO4）：（5）底物缓冲液（pH 5.0）：（6）四甲基联苯胺（TMB）使用液：（7）2，2’-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液：（8）抗原、抗体和酶标记抗体：按说明书处理。
（9）标准品：用稀释液稀释成梯度浓度溶液。
（10）96 孔聚苯乙烯塑料板（酶标板）。
2、实验步骤（双抗体夹心法）：（1）包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10 μg/mL。
在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
（2）加样：加一定浓度稀释的待检样品（同时做空白对照，阴性对照孔及阳性对照）0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，置湿盒中，37℃， 1 hr。
ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原临床ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。
具体测定方法如下：1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。
3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。
4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。
在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。
最初的双抗夹心ELISA试剂盒，均采用两步法。
后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。
目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HAg、。
FP和hCG等，基本上都采用一步法。
一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA测定结果有严重影响。
在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S形变化曲线。
而一步法双抗夹心ELISA的反应曲线则为钟形曲线。
也就是说测定显色随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(hook eHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephen。
ELISA操作步骤（双抗体夹心法）ELISA操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。
2 PBS洗3次，每次3分钟。
具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。
3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。
将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。
4 PBS洗3次，每次3分钟。
5. 加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。
6 PBS洗3次，每次3分钟。
7. 加入底物液(现用现配):TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl，底物加入量每孔100μl （TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。
8. 终止反应:每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应, 此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。
9 结果判断:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。
用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。
双抗体夹心ELISA法检测CEA一、实验目的1. 阐述酶联免疫吸附测定(ELISA)的原理，列举ELISA类型2. 完成ELISA的基本操作3. 学会分析实验结果4. 能根据需要设计相应的ELISA实验流程二、实验原理酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。
ELISA 类型：直接法（一步法）；间接法（间接ELISA、双抗体/原夹心法，竞争性ELISA、BAS-ELISA）。
1. 已知的抗原或抗体结合到特定的固相载体表面（聚苯乙烯微量反应板，利用蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附），并保持其免疫学活性。
将抗原或抗体固定在固相载体表面的过程称为包被(coating)。
蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。
这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。
大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
包被用抗原分为——天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。
合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。
一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。
借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。
2. 抗原抗体的特异性结合：可用于以已知抗原检测未知抗体或以已知抗体检测未知抗原。
本实验采用以已知抗体检测未知抗原。
3. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。
结合在固相载体上的酶量与标本中待测抗原或抗体的量成正比。
（制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。
最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。
抗原必须是高纯度的。
）4. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定（30min内），否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
ELISA法中所用的酶要求纯度高，催化反应的转化率高，转一性强，性质稳定，继续保留它的活性部位和催化能力。
HRP的色原底物：OPD（邻苯二胺）被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB）。
缺点：实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。
改进：在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。
TMB（四甲基联苯胺）是一种优于OPD的新型HRP色原底物。
其氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，过氧化氢溶液和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。
降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌。
使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min，但随后本底显色就不断加深。
比较：TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。
TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP 最为常用的色原底物。
本次实验所使用的也是TMB。
5. 双抗体夹心ELISA基本过程：抗体包被、洗涤、封闭结合位点、结合抗原、洗涤、结合酶标抗体、洗涤，加底物反应、显色并读数。
三、实验材料1. 酶标反应板（包被有抗CEA抗体）2. CEA标准品（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml）3. 样品1和样品24. 酶标抗体（酶结合物）5. 底物液A和底物液B（显色剂A和B）6. 终止液7. 洗涤液四、实验步骤1.将梯度标准品和待测样品分别加100μl于每孔，37℃（湿盒或封口）30min。
2.用洗涤液洗涤4次后，加入酶结合物100 μl于每孔，37 ℃湿盒或封口，30min。
3.洗涤4次后，分别加显色剂A和B各1滴混匀，37 ℃湿盒或封口，15min （避光）。
4.加终止液1滴，肉眼观察结果并读取OD450值。
（洗涤液的量逐渐递增）注意事项包被：样品若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。
（常规包被2-8℃冰箱过夜）试剂盒要注意保质期。
孵育：1) 贴封片或加盖，置湿盒；2) 按说明步骤严格控制操作时间。
洗板：保证洗液注满各孔，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干。
若用洗板机，请保持洗板针畅通。
显色：显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂（AB液临时混合）终止：在加终止液时应避免产生气泡。
读板：若用机器读板，应保证酶标板底部清洁。
五、实验数据处理和分析肉眼观察可以发现样品的浓度比较接近2~3管，可推测浓度在5~10之间。
标准曲线分析：两次样品是同种，结果OD值也近似，误差为（0.372-0.371）/0.372=0.27%，所以结果可靠，选择将两次样品的OD值取平均为0.3715，代入标准曲线得x值为9.512，所以所测样品的浓度为9.512ng/ml。
本次的样品为试剂盒的质控品1：10ng/ml±15%，本次实验测出结果为9.512ng/ml，与10的误差为（10-9.512）/10=4.88%<15%，所以本试剂盒效果很好，可以使用其检测病人的CEA水平，CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。
CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。
但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎等疾病，15%～53%的病人血清CEA也会升高，所以CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值。
此外，血清CEA水平与大肠癌的分期有明确关系，越晚期的病变，CEA浓度越高。
六、思考题1.抗体是如何包被在固相载体上的？（本试剂盒使用的是CEA单抗）。
IgG与聚苯乙烯疏水基团之间有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，不会影响后续抗原抗体反应。
取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液，须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性；腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。
在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
2.封闭的作用？所有的ELISA固相均需封闭吗？封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。
封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。
常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。
并非所有的ELISA固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。
当双抗体夹心法中，如果酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。
特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，已经起到了类似封闭剂的作用。
但在间接法测定中，封闭一般是不可少的。
所以我认为，如果经历过一次不封闭而背景并不高的话，可以考虑再次使用同一套抗原抗体的时候也不封闭，但是在用不同试剂的时候还是封闭比较稳妥。
3.抗原结合的特点？抗原抗体反应的特点主要有三性：即特异性、比例性、可逆性。
本实验利用了前两个特性——特异性是抗原抗体反应的最主要特征，这种特异性是由抗原决定簇和抗体分子的超变区之间空间结构的互补性确定的。
这种高度的特异性在传染病的诊断与防治方面得到有效的应用；比例性是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，在抗原抗体比例相当或抗原稍过剩的情况下，反应最彻底，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。
而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体反应。
4.为何要有洗涤步骤？抗体包被后洗涤是为了洗去未吸附的抗体；加入待检样品后洗涤是为了洗去未结合的抗原；加入已知酶标抗体后洗涤是为了洗去未结合的酶标抗体。
所有的洗涤步骤都是为了防止特异性反应背景过高，完全结合上的抗原/抗体是不会被PBST洗下来的，根据我以前实验中的经验，短时多次的洗涤效果最好。
5.颜色反应为何能反映出抗原的量？如何避免出现显色深度与抗原量成反比的情况？因为颜色反应的深浅是与底物量成正比的，而底物的量即抗原抗体结合物的量，在前带中，结合物的量是与抗原的量成正比的，所以颜色反应能反映出抗原的量。
所以在控制量的时候，应注意使抗体过量一些使其处于前带期。
而如果处于后带的位置，就会使得显色深度与抗原量成反比。
6.为何要做标准曲线进行定量？每次实验的条件和仪器状态都是不一样的，所以在测定样品的时候需要与标准品在同一个状态下，同一种条件进行实验，以作为比照。
而制定标准曲线是为了使测定结果更加精确，因为单纯用标准品和样品进行比例计算，得出来的误差是相当大的，所以多取几个点做出拟合曲线之后再在曲线上找点会使得结果更加精确。
所以每次都要有对照，而且每次都要做标准曲线。
7.封口和湿盒比较？湿盒的作用更全面一些，既有保湿的作用，又可以避光；而只封口避光效果会不太理想。
而且我认为封口后37℃时，会有一些液体蒸发后冷凝，停留在封口纸上，依然会导致反应管里液体减少，而湿盒是使得管内外湿度相当，效果会好一些。
8.洗板机的工作原理。
洗板机的工作原理是将微型空气压缩机用于洗板机中，利用空气压缩机产生的正负气压直接进入洗液瓶和废液瓶，产生瓶内压力或真空，从而通过冲洗头完成吸注液功能，残液量少，使用安全可靠。
用户在每天使用洗板工作完毕后，选择冲洗栏内的冲洗键即可进行冲洗，之后把洗板机内部的洗液转换成蒸馏水，完毕之后返回主菜单。
我认为冲洗的过程很重要，洗板机不如一次性枪头，一定要冲洗干净才能保证不污染下次实验。
